Rat Kalp Yetmezliği Hücre Terapisi: Miyokard İnfarktüsü için çift Torakotomi ve Hücreleri ile BioMatrix arasında Epikardiyal implantasyonu

Özet

Bir kemirgen modelinde, LAD ligasyonu ile uyarılmış miyokardiyal enfarktüsü tedavi etmeye yönelik bir biograft implantasyonu, geleneksel olarak iki açık kalp ameliyatı gerektirmiştir. Ölümlerini azaltmak ve hücreleri ile ilişkili solid ve jelatinli biyolojik matrisler tespiti için en uygun koşulları sağlamak amacıyla, minimal invaziv prosedürler geliştirilmiştir.

Özet

Kardiyak hücre tedavisi hücreleri ile ilişkili biyomateryallerin ilgi ve implantasyonu artan kazanmış miyokart hücre teslim optimize etmek için önemli bir sorun haline gelmiştir. Miyokard infarktüsü kemirgen modeli (MI) arter (LAD) ligasyonu yaygın bir torakotomi yapılmıştır sol ön inen oluşan; bir sternotomi ile bir ikinci açık kalp cerrahisi, geleneksel olarak tedavi epikardiyal uygulanması için gerçekleştirilmiştir. LAD ligasyon modeli açıklaması yana, ameliyat sonrası ölüm oranı ancak ikinci ameliyat kritik kalmıştır, 35-13% düşmüştür. Ağrı ve ameliyat sonrası enfeksiyon kazanımını arttırmak ve azaltmak için, minimal invaziv cerrahi işlemler sunulmaktadır. İki torakotomi, LAD ligasyon için ilk biri ve tedavi epikardiyal yönetimi için ikinci bir yapıldı. Bir katı ya da jel matrisler özellikleri ile bağlantılı hücrelerden oluşan Biografts enfarktüslü ar üzerine uygulanmıştırad. 2 ve 6 hafta sonra gerçekleştirilmiştir ekokardiyografi ile teyit edildiği gibi, LAD ligasyon kalp fonksiyonlarının kaybı ile sonuçlandı. Goldner kalp bölümlerinde gerçekleştirilen trikrom boyama Transmural skar oluşumunu doğruladı. Birinci ve ikinci ameliyatlar daha az olduğunu,% 10 post-operatif mortalite sonuçlandı.

Giriş

19. ^yüzyılın sonundan bu yana, kardiyovasküler hastalık sanayileşmiş ülkelerde bir numaralı seri katili kalmıştır. Bunlar arasında, koroner arter hastalığı, ana etiyolojisi temsil eder. Miyokard infarktüsü (Mİ) ve akut faz sonuçları giderek kronik fazda ve ciddi kalp yetmezliği doğru gelişir uyumsuz biçimlenme tarafından takip edilmektedir. Önemli en son teknolojik ve terapötik ilerlemelere rağmen, bağlı kalp yetmezliğinin ilerlemesine morbidite ve mortalitesi hala ¹ büyüyor. Bu bağlamda, hücre tedavisi kalp yetmezliği doğru hastalığın ilerlemesini durdurmak ve miyokardın son zamanlarda belirlenen rejeneratif kapasitesini harekete geçirmek için yeni bir tedavi seçeneği olarak artan bir ilgi kazanmıştır. Deneysel ve klinik araştırmalar çeşitli hücre tiplerinin kalp naklinden sonra elde yararlı etkileri ikna edici bir kanıt sağladı. Önemli sonuçlar geliştirilmiş cardi dahilac kasılma fonksiyonu, sol ventrikül remodeling azaldı infarkt azalır ve infarkt alanında damar yoğunluğu artmıştır. Fakat, hücre enjeksiyonundan sonra düşük hücre sayısı tutma önemli bir dezavantajı kalmıştır. Hücre teslim ² iyileştirmek için bir alçı ile hücrelerin Derneği son zamanlarda araştırmacı ve klinik çıkarlarını teşvik etmişlerdir.

Koroner arter (LAD) sol ön inen ligasyonu transmural infarktüsü ve olgun bir yara sonuçlanan küçük bir hayvan modeli MI için bir referans yöntemidir. MI, kronik fazda uygulanan hücre tedavisi ikinci bir cerrahi müdahale gerektirir. Bir medyan sternotomi genellikle hücrelerin veya biografts bir epikardiyal implantasyon intramiyokardiyal enjeksiyonu sağlamak için gerçekleştirilir. Bu tür invaziv cerrahi işlemler ölüm oranı, ameliyat sonrası iyileşme süresi, ağrı ve enfeksiyon riskini arttırır. Burada sunulan minimal invaziv yaklaşım değil sadece bu önyargı engeller ama aynı zamanda o sağlarTedavi uygulaması için kalbin ptimal erişilebilirlik. MI ve jel tipi biyolojik matris ile ilişkili hücrelerin epikardiyal implantasyon sol interkostal torakotomilerde üzeri kalpte yapılır.

Protokol

NOT: Lewis Kadın ve Erkek sıçanlar, 200-220 gr standart laboratuar koşullarında (12 saat aydınlık ve karanlık döngüsü, istenildiği kadar su ve gıda, IVC kafes) altında tutuldular. Tüm hayvanlar hayvan koruma FELASA ve İsviçre Kanun tavsiyelerine uygun olarak tedavi edildi.

1. Hücre Hazırlanışı: Kemik İliği dan Mezenkimal Kök Hücre İzolasyonu

1. 5 dakika boyunca bir indüksiyon odasında izofluran% 5 ve O ₂ 5 L / dak, sıçanları anestezisi. Anestezi sistemine bağlı bir burun konisi içine hayvanın burun yerleştirin. Sedasyon onaylamak için bir ayak veya kuyruk tutam gerçekleştirin.
2. Kalça ayak bileği arasında cildi keserek makasla bacaktan deri kaldırmak. Kasları çıkarın ve hayvan eksanguinasyonla için femoral arter kesti. Kalça eklemi Açığa ve femur başını yerinden. Bu femur başını zarar vermemek önemlidir. 50 ml'lik plastik bir tüp içinde, steril PBS içinde kemikleri yerleştirin.
3. Tüm mu kaldıronları kırmadan kemiklerden scles ve ligament. Not: Bu, kemik, etanol ile yıkama çözeltisi ya da kirlenme bağlantı bilmek bozulmadan kalması çok önemlidir. 5 dakika boyunca% 70 etanol içinde soyulmuş kemikleri durulayın.
4. Steril bir laminer akış kaputu altında, makas ile kemiklerin hem ipuçları kesti. Kemik ekstremite steril PBS enjekte edilerek kemik iliği yıkayın. 15 ml tüp içine kemik iliği toplayın. 300 x g ile santrifüj 7 Min.
5. Süpernatantı. Kırmızı kan Celi Lysis tamponunda 3 ml pelet askıya alınması. 300 x g, 7 dakika boyunca tekrar iplik önce, oda sıcaklığında 1 dakika boyunca süspansiyonu inkübe edin. 150 ml kültür, bir şişe içinde, steril, hücre kültür ortamı (395 ml IMDM ortamı, 5 ml pen / strep, 100 ml FBS) ekleyin ve tohum hücreleri.
6. Nonadherent hücreleri çıkarmak için ikinci gün orta değiştirin.
   1. Istenilen hücre miktarı elde edilinceye kadar 2-3 hafta boyunca her ikinci gün orta değişiklikleri gerçekleştirin.
   2. Alternatif olarak, tohum tarafından biograft hazırlamakgerekli ve ³ başka bir yerde tarif edildiği gibi bir katı matris üzerine hücreleri ing.
7. Kalp implantasyonu günü, hücreleri hazırlamak ya da sadece epikardiyal uygulamadan önce biograft hasat.
   1. Accutase hücre dekolmanı çözüm kullanarak hücreleri toplamak. Hücreleri saymak. Istenilen hücre miktarı elde etmek için hesaplanır hücre süspansiyonu hacmi, 1.5 ml santrifüj tüpü doldurun. 300 xg'de 7 dakika santrifüj ve süpernatant kaldırmak.
   2. Seçenek olarak ise, steril PBS içerisinde çalkala ve hücre kültür ortamından hasat biograft ve serumsuz taze kültür ortamı içinde tutar.

2. İlk Torakotomi ve LAD ligasyon

1. Sıçan tartılır. 37 ° C'de ısıtma yastığı açın. 5-7 dakika indüksiyon odasında% 5 izofluran ve 5 L / dk% 100 O ₂ ile sıçan anestezisi. Sedasyon onaylamak için bir ayak veya kuyruk tutam gerçekleştirin. Isıtma yastığı sıçan yerleştirin.
2. 14 ile hayvan entübeG iv kateter. 2.5 L / dk oksijen,% 2.5 izofluran, 2 ml tidal hacim ve / dak 90 nefeslerin bir nefes frekans için programlanmış bir kemirgen ventilatöre entübasyon kateteri bağlayın.
3. 0.1 mg / kg bir buprenorfin çözelti hazırlayın. Deri altına çözeltinin üçte biri enjekte edilir. Toraks sol kısmını tıraş. % 1 Betadine solüsyonu ile dezenfekte.
4. Dördüncü interkostal boşlukta sternum dik cilt İnsizyon. 3 göğüs kasının katmanları (pektoralis majör, artan pektoralis ve dış eğik pektoralis) ayırın. (Kaburga arasında 4 ve 5), dördüncü interkostal boşluk açın.
5. Kaburga yaymak ve kalp maruz küçük bir ekartörünü kullanın. Dikkatli perikard açın. Bulun ve atrium altında 7.0 dikiş 4 mm ile koroner arter (LAD) sol ön inen Arter.
6. 3,0 suturlerle iki dikiş ile interkostal alanı kapatın. Sternum proksimal ve distalde iki sütür yerleştirin. İlk olarak, tDistal dikiş ighten. Göğüs şişirmek ve herhangi bir pnömotoraks önlemek için 2 saniye boyunca ventilatör egzoz boru kelepçe. İkinci dikiş sıkın. (Hayır dikişler ihtiyaç vardır) geri yerine kasları katmanları yerleştirin. 5,0 dikiş ile cilt kapatın.
7. % 1 Betadine solüsyonu ile dezenfekte dikiş. Buprenorfin, solüsyonun geri kalanı enjekte edilir. Anestezi sistemi kapatın. Entübasyon kateteri çıkarın.
8. 1-2 saat ılık bir Lamp altında kafeste sıçan tutun. Kafes içinde bir termometre tutun ve aşırı ısınmaya önlemek için sıcak lamba ve kafesin arasındaki mesafeyi kontrol eder. VKİ ünitesinde sıçan dön. Deri altından Buprenorfin 0.05-0.1 mg / kg enjekte Gönder -operatively 48 saat boyunca 6-12 saat.

İkinci Torakotomi Tedavi Via 3. Epikardiyal İdaresi

1. Tekrarlayın 2,1-2,3 adımları.
2. Beşinci interkostal boşlukta sternum dik cilt İnsizyon. 3 tabakanın ayrılmasıTorasik kas s (pektoralis majör, artan pektoralis ve dış eğik pektoralis). (Kaburgalar 5 ve 6 arasındaki) beşinci interkostal aralık açın.
3. Kaburga yaymak ve kalp maruz küçük bir ekartörünü kullanın. Bazı bağlılık varsa, dikkatle ince forseps ile bunları kaldırmak.
4. Dikilen altında bir soluk alanı olarak görünen enfarktüs alanı bulun. Not: Gerektiğinde daha sol karıncığa görselleştirmek için tepe eklenir ameliyat dikiş ipliğinin bir 10 cm'lik bir parça (7,0) kullanır. Kalp maruz bir kelepçe ile gevşek tutulan sütür hafifçe çekin.
5. Aşağıdaki tedavilerden birini uygulayın:
   1. Kalp yüzeyinde biograft yerleştirin. 10 dakika boyunca, oda sıcaklığında önceden ısıtılmış doldurulmuş fibrin yapıştırıcı şırınga kullanın. 25 G Luer iğne kullanılarak biograft altında fibrin yapıştırıcı bir damla (50-100 ul) uygulayın. Biograft tamamen sızdırmaz olduğundan emin olun.
   2. Seçenek olarak ise, yüzey o bir pipet ile toplanmış hücre pelletini geçerlidirdikilen altında soluk alan üzerine kalp f. Hücre pelet üzerine fibrin yapıştırıcı bir damla (50-100 ul) uygulayın.
6. Apeksinden sütür parça çıkarın.
7. Tekrarlayın 2,6-2,8 adımları.

Sonuçlar

Tüm hayvanlar torakotomilerde sonra 1 saat içinde iyileşti. Yara iyileşmesi hızlı oldu. Enfeksiyon veya ödemi gözlendi.

Çift sol torakotomi kalbe iyi erişim (Şekil 1) izin verdi. Ağrı ve ameliyat sonrası mortalite düşüktür. Hayvan cerrahi hızla iyileşti ve (Şekil 2) ağırlık kazandı. Kaplan Meir sağkalım yüzde ilk torakotomi için% 96 oldu. 104 üzerinde dört sıçan ikinci torakotomi ile 24 saat aşağıdaki tedavi uygul...

Tartışmalar

LAD kalıcı ligasyonu geri dönüşümsüz miyokard yaralanmasına neden olmaktadır. İlk hayvan modeli, o günden beri kronik MI için standart ve uygun model olarak kabul edilmiştir. 1960 ⁴ tarif edilmiştir. Onun kararlılığı ve uyarlık MI ⁵ için tedavilerinin deneysel değerlendirilmesini sağladı. İlk açıklama aşağıdaki Geliştirilmiş prosedürler 35-13% ⁶ bir operatif mortalite oranı bildirdi.

Beklendiği gibi, LAD ligasyon 2 hafta içi...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polysorb 3-0 suture	Covidien	UL 204
Polysorb 5-0 suture	Covidien	UL 202
Surgipro II 7-0 Suture	Covidien	VP904X
Catheter Insyte 14 G	BD	381267
Inspira Advanced Volume Controlled Ventilator	Harvard Apparatus	557058
Dumont #7 Forceps	FST Germany	11274-20
Fibrin Sealant	Baxter	1501441	TISSEEL Glue, Frozen -20 °C
Castroviejo Eye Specula	Harvard Apparatus	72-8925	use as retractor for the ribs
IMDM GlutaMAX	Gibco	31980
Pen/Strep	Gibco	15140
FBS	PAA Clone	A15-101
Bone Scissors	Fine Science Tools	16044-10
Red Blood Cell Lysis Solution	Gentra Systems	D-50k1
Accutase Cell Detachment Solution	Stem Cell Technology	7920