Inyección intraestriatal de sangre autóloga o clostridial colagenasa como modelos murinos de la hemorragia intracerebral

Resumen

Preclinical models of intracerebral hemorrhage are utilized to mimic certain aspects of clinical disease. Thus, mechanisms of injury and potential therapeutic strategies may be explored. In this protocol, two models of intracerebral hemorrhage are described, intrastriatal (basal ganglia) injections of autologous blood or collagenase.

Resumen

La hemorragia intracerebral (ICH) es una forma común de enfermedad cerebrovascular y se asocia con morbilidad y mortalidad significativas. La falta de tratamiento y el fracaso efectivo de grandes ensayos clínicos dirigidos a la hemostasia y la eliminación de coágulos demostrar la necesidad de una mayor investigación mecanismo impulsado de ICH. Esta investigación se puede realizar a través del marco establecido por los modelos preclínicos. Dos modelos murinos en uso popular incluyen (ganglios basales) inyección intraestriatal de sangre entera autóloga o colagenasa clostridial. Dado que, cada modelo representa claramente diferentes características fisiopatológicas relacionadas con la ICH, el uso de un modelo en particular se puede seleccionar sobre la base de qué aspecto de la enfermedad es a ser estudiado. Por ejemplo, la inyección de sangre autóloga representa con mayor precisión la respuesta del cerebro a la presencia de sangre intraparenquimatosa, y puede reproducir más de cerca posible hemorragia lobar. Inyección de colagenasa clostridial representa con mayor precisión las sruptura de los vasos centro comercial y hematoma evolución característico de hemorragias profundas. Por lo tanto, cada uno de los resultados del modelo en diferente formación de hematomas, neuroinflammatory respuesta, el desarrollo de edema cerebral, y los resultados neuroconductuales. La robustez de una intervención terapéutica pretendida puede ser mejor evaluada usando ambos modelos. En este protocolo, la inducción de ICH con modelos de demostración, post-operatorio inmediato de la lesión, y las técnicas de atención postoperatoria temprana se demuestran. Ambos modelos resultan en lesiones reproducibles, volúmenes hematoma, y ​​déficits neuroconductuales. Debido a la heterogeneidad de ICH humana, se necesitan varios modelos preclínicos para explorar a fondo los mecanismos fisiopatológicos y probar estrategias terapéuticas potenciales.

Introducción

La hemorragia intracerebral (HIC) es una forma relativamente común de enfermedad cerebrovascular con aproximadamente el 40-50% de los pacientes afectados de morir dentro de 30 días ^1. Desafortunadamente, pocas mejoras se han hecho en la tasa de mortalidad en los últimos 20 años ^2. Los informes de los Institutos Nacionales de Salud ³ y las directrices de la American Heart Association ⁴ subrayaron la importancia de desarrollar modelos clínicamente relevantes de ICH para ampliar la comprensión de la fisiopatología y desarrollar objetivos para nuevos enfoques terapéuticos.

Existen varios modelos para imitar ICH humana ^5. Como la comprensión de la fisiopatología de la ICH madura, se ha hecho evidente que una variedad de modelos puede ser utilizado para examinar diferentes aspectos de la enfermedad. Modelos utilizados anteriormente incluyen angiopatía amiloide murino ^6, inserción microbalón intraparenquimatosa y la inflación ^7, y la sangre arterial directainfiltración de ^8,9. Lobar hemorragia de angiopatía amiloide se ha modelado con el uso de ratones transgénicos y representa un subtipo de la ICH distinta. Modelos microbalón imitan el efecto de masa aguda de la formación de hematomas, pero no logran captar la respuesta celular del cerebro a la presencia de sangre. Por último, la infiltración de sangre arterial directa somete el cerebro a las presiones arteriales de la arteria femoral. Por lo tanto, este modelo imita presiones arteriales y la presencia de sangre, pero no somete al cerebro a la lesión microvascular de pequeña ruptura de los vasos sanguíneos. Además, este modelo tiene inherentemente alta variabilidad. Curiosamente, las ratas espontáneamente hipertensas ¹⁰ desarrollan HIC espontánea a medida que envejecen. El estudio de estos animales después del desarrollo de la ICH puede imitar la enfermedad en presencia de uno de los principales comorbilidades que predisponen a los seres humanos de la ICH. Si bien existen estos otros modelos, la inyección de intraestriatal clostridial colagenasa ¹¹ o inyección instrastiatal de unsangre entera utologous ¹² son, en la actualidad, los dos modelos más comunes utilizados en la investigación preclínica ICH.

La selección del modelo de la ICH debe hacerse con base en el objetivo de la pregunta experimental, incluyendo la selección y el método de inducir la formación de hematomas especies. Por ejemplo, los cerdos son animales grandes con volúmenes relativamente grandes de la materia blanca del cerebro en comparación con los ratones. Por lo tanto, son adecuados modelos porcinos para estudiar la materia blanca fisiopatología siguiente ICH. En contraste, los cerebros de roedores son materia principalmente de color gris, pero los sistemas transgénicos hacen roedores útil para evaluar los mecanismos moleculares de la lesión y la recuperación después de la ICH. Cada modelo tiene sus fortalezas y debilidades (Tabla 1) inherentes, que debe ser considerado cuidadosamente antes de la experimentación.

Los siguientes protocolos demuestran los modelos de sangre y de inyección de colagenasa autólogas en ratones. Estos modelos han sido cada uno traducida de modelos desarrollados originalmente en ratas^13,14 y permitir el uso de la tecnología transgénica ampliamente disponibles para explorar los mecanismos moleculares asociados con la muerte celular después de la ICH. Ambos representan claramente diferentes mecanismos de lesión de ICH humano, y ambos tienen muy diferentes resultados esperados en términos de medidas conductuales e histológicas. Por lo tanto, ciertas hipótesis pueden prestarse a un modelo sobre el otro, pero muchas ideas pueden requerir la validación en ambos modelos.

Tabla 1. Comparación de las características de los modelos de hemorragia intracerebral inyección de sangre autóloga colagenasa-e.

	La inyección de colagenasa	Inyección de sangre
Facilidad de Uso	+ + +	+ +
Reproducibilidad	+ +	+ +
Control de la Hemorragia Tamaño	+ +	+ + +
El reflujo de sangre	+	+ +
Simula Enfermedades Humanas	+	-
Sencillez	+ +	+ +
El uso en múltiples especies	+ +	+ +

Protocolo

Declaración de Ética: Este protocolo ha sido aprobado por el Comité de la Universidad de Duke Institucional Cuidado de Animales y Uso y sigue todas las pautas para el uso ético de los animales.

1. Preparación de Equipo

1. Autoclave las herramientas quirúrgicas antes de la cirugía.
2. Desinfectar el aparato estereotáctico con etanol al 70%.
3. Encienda el baño de agua y mantener la temperatura del agua a 42 ° C.
4. Disolver Tipo IV-S clostridial colagenasa en solución salina normal a una concentración de 0,075 U por 0,4 l.

2. Colagenasa Modelo Inyección

1. Pesar el ratón.
2. Anestesiar el ratón en una cámara de inducción con 5% de isoflurano en el 30% O _2/70% N _2. Anestesia adecuada se indica después de aproximadamente 2 minutos, cuando la respiración de ratón han reducido a 1 por segundo.
3. Intubar la tráquea con una G catéter intravenoso 30 mm 20.
4. Conectar el catéter a unrespirador de roedores y ventilar mecánicamente los pulmones con el 1,6% de isoflurano en el 30% O _2/70% N _2, a razón de 105 respiraciones por minuto, con un volumen corriente entregado de 0,75 ml ^..
5. Afeitar el cuero cabelludo con una máquina de afeitar electrónica. Una vez que el ratón se anestesia y intubado, moverlo a una estación de trabajo diferente para el afeitado y luego regresó a la banca quirúrgica.
6. Asegure la cabeza en un marco estereotáctico y nivelar la cabeza con la sutura coronal y sagital tanto como puntos de referencia.
7. Aplique una pomada oftálmica para los ojos.
8. Inserte una sonda de temperatura rectal. Mantenga la temperatura rectal a 37,0 ± 0,2 ° C por medio de una cama de agua que circula debajo de la carrocería.
9. Limpie el área quirúrgica con betadine seguido con etanol al 70% y repetir 3 veces.
10. Haga una incisión en la línea media del cuero cabelludo 1 cm y limpie periostio lateralmente con un aplicador con punta de algodón estéril para exponer bregma.
11. Taladro 1 mm de diámetro agujero de trépano de 2,2 mm dejó latEral al bregma con un taladro refrigerado por agua.
12. Gire vial colagenasa 5 veces, luego lavar una jeringa de 0,5 l con 25 G aguja (que se adjunta al marco estereotáctico) con 0,5 l solución de colagenasa 5 veces (Deja 0,5 l de solución de colagenasa en la jeringa después de la última de lavado).
13. Alinee la punta de la aguja con orificio de trepanación luego expulsar a 0,1 l de la jeringa y limpie bisel de la aguja con la maquinilla de afeitar de desprenderse.
14. El uso de un micromanipulador, avanzar la aguja de 3 mm de profundidad de la corteza y dejar inmóvil durante 30 segundos.
15. Inyectar 0,4 l más de 90 seg.
16. Disminuir isoflurano al 1% y dejar inmóvil aguja durante 5 min.
17. Retire la aguja lentamente.
18. Aplique 1-2 gotas de 0,25% por vía subcutánea bupivacaína y suturar la piel.
19. Apague vaporizador isoflurano y quitar ratón del marco estereotáctico.
20. Permita ratón para recuperar la ventilación espontánea con extubación traqueal posterior.
21. Ratón Regreso a una jaula limpia y permitir el libre acceso aalimentos y agua.

3. Autólogo Modelo Inyección de sangre

1. Siga los pasos de 02.01 a 02.11 para el modelo de inyección de colagenasa.
2. Dibujar 50 l de solución salina normal estéril en una jeringa de 30 l G 50.
3. Coloque la jeringa de microlitro con un tubo PE10 70 cm.
4. Expulsar todo la solución salina normal de la jeringa en el tubo de microlitro a un tubo de PE10-air de completamente.
5. Tire de la jeringa de pistón microlitro a cabo 1 mm para hacer una burbuja de aire en la abertura distal del aparato de jeringuilla de tubo de PE10-microlitro para evitar la mezcla de solución salina y la sangre durante los procedimientos posteriores.
6. Limpiar la región de la arteria central de la cola distal del ratón con etanol al 70%, y cortar la arteria con una maquinilla de afeitar de 0,5 a 1 cm a la punta de la cola.
7. Recoger 40 l de sangre de la cola cortada en el aparato de jeringuilla de tubo de microlitro-PE10. Nota: que la heparina no se utiliza en la aguja, tubo, o el ratón.
8. Conecte la jeringa de microlitro a la injebomba cción.
9. Conectar la porción de cánula de metal de una aguja de 27 G para el extremo del tubo de PE10, y asegurar la aguja a un micromanipulador en el marco estereotáctico.
10. Expulsar a 2 l de sangre de 27 G de la aguja y limpie bisel de la aguja con la maquinilla de afeitar de desprenderse.
11. Alinee la punta de la aguja con orificio de trepanación e inserte la aguja 3 mm de profundidad de la corteza.
12. Inyectar 35 l de sangre autóloga a razón de 2 l por min.
13. Disminuir isoflurano al 1% y dejar inmóvil aguja durante 10 min.
14. Retire la aguja durante 30 s.
15. Aplique 1-2 gotas de 0,25% por vía subcutánea bupivacaína y suturar la piel.
16. Apague vaporizador isoflurano y quitar ratón del marco estereotáctico.
17. Permita ratón para recuperar la ventilación espontánea con la posterior de la extubación.
18. Ratón Regreso a una jaula limpia y permitir el acceso libre a comida y agua.

4. Sham Operación

1. Siga los mismos procedimientos para injectio colagenasamodelo n, excepto que sin la inyección después de la inserción de la aguja.

5. Cuidados después de la cirugía

1. Inyectar 0,5 ml de solución salina normal por vía subcutánea en la noche de la intervención quirúrgica en la parte posterior del cuello del animal.
2. Proporcionar alimentos ablandada con agua y la comida en gel en pequeñas tazas de plástico colocadas en el suelo de la jaula. Vuelva a colocar la comida al día durante 7 días.
3. Compruebe si hay pérdida de peso, cicatrización de heridas y signos de malestar al día durante 7 días.
4. Si se requieren intervalos de recuperación de más de 7 días, retirada de la sutura se puede realizar bajo anestesia ligera con inhalada (aproximadamente 1% de isoflurano en 30% de O _2/70% N _2), si es necesario.

Resultados

Debido a las diferencias en la formación de un hematoma (Figura 1), giro ipsilateral se muestra inmediatamente después de despertar para los ratones inyectados de sangre autóloga y dentro de 2 a 4 horas después de la inyección de colagenasa, como la expansión del hematoma se produce (Figura 2). Ausencia de giro ipsilateral debe plantear la preocupación por la ausencia de lesiones significativas. En el primer día después de la lesión, los ratones en ambos modelos deben demostra...

Discusión

A pesar de que emerge la investigación preclínica y grandes ensayos clínicos resultantes de la promesa de la terapéutica de ^15-18, no hay intervenciones farmacológicas demostradas para mejorar el resultado en el ICH, y la atención se mantiene en gran medida de apoyo. Las listas de posibles terapias pueden ser generados por tecnologías de alto rendimiento, como el trabajo transcriptómica y proteómica. Si bien estas tecnologías siguen avanzando nuestro conocimiento de posibles dianas terapéuticas, Tr...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotactic frame	Stoelting Co.	51603
Probe holder with corner clamp	Stoelting Co.	51631
Mini grinder	Power Glide	Model 60100002
0.5 μl syringe	Microliter	86259	25 G needle
5 μl syringe	Microliter	7637-01
30 G microliter syringe	Microliter	7762-03
Syringe pump	KD Scientific	Model 100
Heat therapy water pump	Gaymar Industries, Inc.	Model# TP650
Circulating waterbed	CMS Tool & Die, Inc.
Rodent ventilator	Harvard Apparatus	Model 683
Isoflurane vaporizer	Drager	Vapor 19.1
Air flowmeter	Cole Parmer	Model PMR1-010295
Induction chamber			Self made
Otoscope	Welch Allyn	22820
Intravenous catheter	Becton-Dickinson	381534	20 G, 1.16 inch Insyte-W
Isoflurane	Baxter Healthcare Corporation	NDC10019-360-69
Collagenase Type IV-S	Sigma	C1889
Polyethylene tubing PE10	Becton-Dickinson	427401
27 G 1 1/4 inch needle	Becton-Dickinson	305136
Surgical scissors	Miltex	21-539
Forceps	Miltex	17-307
Needle holder	Boboz	RS-7840
Monofilament suture	Ethicon	8698	Size 5-0
Indicating controller	YSI	73ATD