Expresión transitoria de proteínas por hidrodinámico entrega de genes en ratones

Resumen

En la transfección in vivo de ADN desnudo por la entrega de genes hidrodinámico introduce genes en el tejido de un animal con una respuesta inflamatoria mínima. Cantidades suficientes de producto génico se generan de tal manera que la función y regulación, así como la estructura y la función de la proteína del gen pueden ser analizados.

Resumen

La expresión eficiente de los transgenes in vivo es de importancia crítica en el estudio de la función génica y el desarrollo de tratamientos para las enfermedades. En los últimos años, la entrega de genes hidrodinámico (DAG) ha emergido como un método sencillo, rápido, seguro y eficaz para la entrega de transgenes en roedores. Esta técnica se basa en la fuerza generada por la inyección rápida de un gran volumen de solución fisiológica para aumentar la permeabilidad de las membranas celulares de órganos perfundidos y por lo tanto introducir ADN en las células. Una de las principales ventajas de DAG es la capacidad de introducir transgenes en células de mamífero utilizando el ADN plásmido desnudo (pADN). La introducción de un gen exógeno utilizando un plásmido que es mínimamente laborioso, altamente eficiente y, en contra de los transportistas virales, muy segura. DAG se utilizó inicialmente para suministrar genes en ratones, que se utiliza ahora para ofrecer una amplia gama de sustancias, incluyendo oligonucleótidos, cromosomas artificiales, ARN, proteínas y pequeñas moléculas en ratones, ratasy, en un grado limitado, otros animales. Este protocolo describe HGD en ratones y se centra en tres aspectos claves del método que son fundamentales para realizar el procedimiento con éxito: la correcta inserción de la aguja en la vena, el volumen de inyección y la velocidad de entrega. Se dan ejemplos para mostrar la aplicación de este método para la expresión transitoria de dos genes que codifican proteínas secretadas, primates específica, la apolipoproteína LI (apoL-I) y la proteína relacionada con haptoglobina-(HPR).

Introducción

Desde su primera descripción por Liu et al. Y Zhang et al., La entrega de genes hidrodinámico (DAG) se ha convertido en una herramienta muy valiosa para el estudio de la función génica en sistemas de modelos de roedores ^{1, 2.} La técnica consiste en la inyección rápida (5-7 segundos) de un volumen grande (8-12% de peso corporal) de solución en la vena de la cola de los ratones para facilitar la captación de ADN plásmido por las células de órganos diana ^{1, 2.} Estas condiciones conducen a robusto expresión génica en el hígado y menos la expresión de genes en el riñón, bazo, pulmón y corazón.

La inyección de 10 mg plásmido pCMV-lacZ puede transfectar tanto como 40% de los hepatocitos, lo que hace HGD el método más eficiente, no viral, en la entrega de genes in vivo hasta la fecha ^1. A diferencia de los portadores virales, pDNA es fácil de preparar, no provocar una respuesta inmune en el huésped roedor ³ y que no constituya un riesgo para la salud mediante la recombinación con el extremovirus exógenas. Además, ya que las moléculas de ADN entregadas por DAG no necesitan envasado, este método es adecuado para la entrega de cromosomas artificiales bacterianos (BAC) tan grandes como 150 kb ^4. Otros tipos de moléculas que han sido entregados por un método hidrodinámico incluyen ARN ^5-10, morfolinos ^11, proteínas de ^{12, 13} y otras moléculas pequeñas ^{12, 14.} Las ventajas y desventajas de DAG con respecto a otros métodos de entrega se han discutido en las excelentes críticas en la literatura ^15-20 y un número de autores han proporcionado una descripción detallada del procedimiento ^21-23.

La introducción de transgenes en ratones por DAG es seguro y eficaz ^{1-3, 24} y el método se ha usado en ratas con éxito comparable ^25. Con algunas modificaciones, los experimentos de prueba de concepto se han llevado a cabo en pollos ^26, rablos bits ²⁷ y ²⁸ cerdos, aunque, la aplicación in vivo de esta técnica en animales más grandes sigue siendo un reto. Cuando se utiliza este método, otra limitación común es que muchos de los vectores de expresión de mamíferos disponibles carecen de los componentes para lograr una, persistente alto nivel de la expresión génica. El uso de un plásmido, la expresión génica pCMV-Luc en los órganos diana es evidente tan pronto como diez minutos después de la DAG, sin embargo, el nivel de expresión inicial, alta cae bruscamente en la primera semana después de la inyección ^1. Expresión de los transgenes a largo plazo es posible, dependiendo del promotor y el intrón utilizado en el diseño de plásmido ^{3, 24} inyecciones sin embargo, el mantenimiento de la expresión génica de alto nivel a menudo requiere repetidas. Por esta razón, HGD puede ser menos adecuado para estudiar enfermedades crónicas que son un resultado de la exposición a largo plazo a las proteínas perjudiciales o productos de la proteína. Con estas limitaciones, DAG es una herramienta excepcionalmente poderosa para el estudio de la popapel potencial de un gen y el efecto de que los mutantes in vivo, así como los efectos terapéuticos y la regulación de proteínas y para el establecimiento de modelos animales de la enfermedad (para una revisión, ver ^15). Por ejemplo, HGD puede utilizarse para asignar la función a los dominios y aminoácidos de las proteínas mediante la introducción de forma individual diferentes construcciones de genes en ratones que tienen los respectivos genes noqueado. Además, esta técnica puede ser utilizado en cualquier cepa de ratón.

Este protocolo describe HGD en ratones con un enfoque en los aspectos técnicos necesarios para lograr la transfección exitosa: la inserción correcta de la aguja en la vena, el volumen de inyección y la velocidad de entrega. La aplicación de este método se demostró en un modelo de ratón de la tripanosomiasis africana, una enfermedad mortal de los humanos y el ganado ^{29 de 30.} Aunque varias especies de tripanosomas causan enfermedades en el ganado, la mayoría no puede causar enfermedad en seres humanos debido a los complejos inmunes innatas en blood llamadas factores líticos tripanosoma (Tlfs) ^{29, 31, 32.} Estos, lipoproteínas de alta densidad de formación de poros (HDL) contienen dos proteínas únicas, primates específica:. HPR, el ligando, lo que facilita la absorción de Tlfs en tripanosomas, y apoL-I, el componente lítico ^{31, 33-38} Trypanosoma brucei rhodesiense es capaz de infectar a los humanos debido a la expresión de una proteína asociada a la resistencia sérica (SRA) que se une y neutraliza humana apoL-I ^{34, 39.} Baboon TLF no es neutralizada por SRA por su divergente proteína apoL-I ^40. Como se informó anteriormente, el uso de un vector de expresión de mamíferos (pRG977), la expresión transgénica de componentes TLF babuino en ratones confiere protección contra los tripanosomas humanos infecciosa ^40. Los datos representativos presentados aquí demuestran cómo se puede aplicar la entrega de genes hidrodinámico para estudiar los efectos terapéuticos de una proteína.

Protocolo

Todos los experimentos descritos aquí fueron aprobados por el Comité de Hunter College Institutional Animal Care y Uso de la City University de Nueva York.

1. Preparación de ADN de plásmido libre de endotoxinas

1. Elige una sola colonia de bacterias que contienen el gen de interés en un vector de expresión de mamífero a partir de una placa selectiva recién rayada.
2. Siga las recomendaciones que se encuentran en el manual de un kit disponible en el mercado de purificación de plásmido libre de endotoxina para el cultivo y la cosecha de las bacterias.
3. Se purifica el plásmido de ADN libre de endotoxina a partir de células bacterianas siguiendo el protocolo de un kit de purificación de plásmido libre de endotoxina comercialmente disponible.
4. Utilice artículos de plástico libre de endotoxinas y manejar ADN con cuidado para garantizar que la endotoxina no se vuelve a introducir en la muestra de ADN después de la etapa de eliminación.
5. Medir la concentración de ADN de plásmido libre de endotoxinas mediante la determinación de su absorbancia a 260 nm utilizando un MICRespectrofotómetro o-volumen de UV como se describe a continuación o un estándar, basado en la cubeta de espectrofotómetro.
   1. Limpiar las superficies ópticas inferior y superior del sistema de retención de la muestra espectrofotómetro micro de la siguiente manera. Pipetear 1 l de agua desionizada limpia en el sistema óptico más bajo. Cierre el brazo de palanca y toque un par de veces para bañar al sistema óptico superior, entonces la palanca de apertura y limpie con un pañuelo de papel.
   2. Abra el software del espectrofotómetro micro y seleccionar el módulo de ácidos nucleicos.
   3. Coloque 1 l de agua desionizada limpia en el sistema óptico inferior, baje el brazo de palanca y seleccione "initialize" en el software del programa. Una vez que la inicialización es superficies completas, limpias, tanto ópticos con un pañuelo de papel ..
   4. Realizar la medición en blanco mediante la carga de 1 l de-endotoxina libre de tampón TE (10 mM de Tris-Cl, pH 8,0; EDTA 1 mM) y seleccionando "en blanco" desde el software de programa. Una vez que la medición se realiza en blanco, limpie las superficies ópticas con un tantotejido.
   5. Lleve a cabo la medición de la muestra mediante la carga de 1 l de muestra de ADN libre de endotoxinas y seleccionando "medida" en el software del programa. Se registrará la concentración de ADN. Evaluar la pureza del ADN mediante el registro de la relación de absorbancia 260/280 nm que aparece en la pantalla. Dado que el uso de ADN puro (260/280 proporción de 1,8) para DAG es muy deseable, evitar el uso de una muestra de ADN con una relación de 260/280 por debajo de 1,7. Una vez que la medición se hace, limpie ambas superficies ópticas con un pañuelo de papel.

2. Con un peso de los ratones

1. Marcar los ratones de una manera apropiada para la cepa. Nota: el marcado de la cola, no se recomienda para este procedimiento.
   1. Especies ratón Marcar que tienen la piel blanca (por ejemplo, Suiza Webster) en la espalda con un marcador negro. Vuelva a aplicar marcas en el tiempo que sea necesario.
   2. Especies Marcos ratón que tienen pelaje negro (por ejemplo C57BL / 6) por el oído perforación de varios días de antelación.
2. Pesar individua ratoneslly colocando suavemente en una sartén pesada de animales o un cubo colocado en una balanza de laboratorio digital. Registrar el peso de cada ratón utilizado en el experimento, en el día del experimento.

3. Preparación de jeringas

1. Preparación de la mezcla de inyección
   1. Calcular la cantidad de ADN necesaria asumiendo 5-50 g de ADN de plásmido libre de endotoxinas para la inyección de cada ratón.
      1. Determinar la cantidad óptima de ADN de plásmido experimentalmente.
      2. Al determinar la cantidad de ADN necesario, asumir la inyección de un ratón adicional por grupo, como la carga adecuada de las jeringas requerirá cierta mezcla de inyección extra. Para ayudar a los cálculos, considere el siguiente ejemplo: inyectar 4 ratones experimentales y 4 de control, cada una pesa 25 g, con 50 microgramos de ADN plásmido por ratón. Para determinar la cantidad de ADN necesaria en este caso, calcular con 5 ratones por grupo: 5 x 50 g = 250 g de ADN necesaria para cada grupo.
   2. Determinar la cantidad de solución salina (cloruro de sodio 0,9%) necesaria asumiendo 10% de peso corporal para la inyección de cada ratón.
      1. De acuerdo con el ejemplo anterior, inyectar cada 25 g de ratón con 50 g de ADN plasmídico en 2,5 ml de solución salina (2,5 g de líquido).
      2. Cuando la determinación de la cantidad de solución salina necesaria para todo un grupo de ratones, asumir la inyección de un ratón adicional por grupo para permitir la carga apropiada de las jeringas. Considerando el experimento dado, calcular la cantidad de solución salina necesaria para 5 ratones en cada grupo: 5 x 2,5 ml = 12,5 ml de solución salina para cada grupo (o 25 ml en total). Nota: Si los ratones de un mismo grupo no son el mismo peso (diferencia de más de 10% en el peso corporal), preparar la inyección se mezcla por separado.
   3. Utilice solución salina sin conservantes y sin endotoxina, estéril, que ha sido aprobado para uso humano, en 10 ml, viales de múltiples usos.
   4. Usando una aguja de calibre 20 (0,9 mm x 25 mm) unido a una punta de cierre luer de una jeringa de 20 ml,retirar el líquido de los viales de solución salina y vaciar las jeringas en un tubo cónico de 50 ml. Para ayudar a pipeteado preciso de solución salina durante la preparación de las mezclas de inyección de ADN solución salina, solución salina recoger más de lo necesario para la inyección de todos los ratones en el experimento. Para el experimento anterior, retirar la solución salina de 3, 10 ml viales (un total de aproximadamente 30 ml), incluso si la cantidad calculada de solución salina necesaria para el experimento es de sólo 25 ml.
   5. Pipetear la cantidad calculada de ADN en un tubo cónico de 50 ml diferente. Tenga cuidado de no tocar el lado del tubo con el cuerpo de la pipeta para evitar la introducción de la endotoxina. De acuerdo con el ejemplo, pipetear 250 g de control y 250 g de plásmido de ADN experimental en tubos cónicos separados.
   6. Añadir la cantidad requerida de solución salina para el ADN usando una pipeta serológica. Considerando el experimento de la muestra, pipeta 12,5 ml de solución salina a cada una de las mezclas de reacción (experimental y de control).
   7. Permitir que todas las soluciones para llegar atemperatura ambiente antes de la inyección.
2. Preparación de las jeringas
   1. Para cada ratón, llenar una, 3 ml, jeringa luer-lock estéril con la mezcla de ADN-solución salina usando una aguja estéril de calibre 20-(0,9 mm x 25 mm). Tenga cuidado para evitar las burbujas de aire. Evitar el uso de jeringas de mayor volumen como la velocidad de flujo de inyección no se puede controlar muy bien, y es difícil de manipular jeringas más grandes en una mano. Expulsar el exceso de cualquier mezcla de ADN-salina en el tubo cónico, ya que puede ser reutilizado.
   2. Cambie la aguja para una aguja de calibre 27 estéril. Llenar la aguja con el líquido por completo sin introducir burbujas de aire. Ajustar el volumen de la mezcla de ADN-solución salina tal como se calcula en base al peso del ratón.
   3. No permita que la aguja no tapada toque ninguna superficie no estéril. Si es necesario, las agujas pueden volver a tope con la técnica de una sola mano: coloque la tapa en una superficie plana, inserte la aguja sin agarrarse de la tapa con la otra mano y presione la aguja tapadacontra un objeto firme para asegurar la tapa sobre la aguja. Las jeringas están ahora listos para inyecciones de cola-vena.

4. Entrega de ADN hidrodinámica

1. Tenga en cuenta que los ratones anestésicos pueden reducir la viabilidad. Evite realizar DAG en una habitación que es demasiado frío, ya que esto también reducirá la viabilidad. Si la habitación tiene una temperatura ambiente de 20 ° C o si se utiliza anestesia, coloque el ratón sobre una almohadilla térmica a 37 ° C después del procedimiento para evitar la pérdida de los animales. Si se utiliza anestesia, asegúrese de que la boca y hocico del ratón mientras están sin obstáculos en la pista de calor y observar el ratón hasta que se recupere por completo. No retener el alimento o el agua de los ratones antes de la DAG.
2. Calentar los ratones para dilatar los vasos sanguíneos.
   1. Coloque la jaula del ratón (con ropa de cama incluida) en una almohadilla de calor durante 5 minutos para que la temperatura de la ropa de cama es de aproximadamente 38 a 39 ° C. La temperatura debe ser suficientemente baja para mantener a los ratones en la almohadilla de calor para unperíodo extendido.
   2. Como alternativa, coloque el ratón en una inmovilización acceso dorsal con moderación mínima. Se calienta la cola del ratón durante 1 min suavemente sujetándolo con un trozo de gasa humedecida en agua tibia. Permitir ratón para volver a la posición, si es necesario. Limpie la cola con un pañuelo de papel para secarse.
   3. Alternativamente, ratón caliente mediante la colocación de la jaula bajo una lámpara de calor durante no más de 2 min. Si se utiliza una lámpara de calor, tenga cuidado para evitar el sobrecalentamiento del ratón.
3. A gran volumen de inyección en la vena de la cola
   1. Inmovilizar un acceso restrainer dorsal sobre una superficie plana con cinta de laboratorio.
   2. La celebración por la cola, coloque el ratón suavemente en la inmovilización e inserte el conector. Utilizar la menor restricción como sea necesario para mantener la cola inmovilizada. Asegúrese de que el ratón está respirando libremente.
   3. Si el ratón está en peligro grave en cualquier momento durante el procedimiento, retire el ratón desde la inmovilización de inmediato y deje reposar.
   4. Pasa el raton por louna de las venas caudales lateral es visible. Localice las venas caudales laterales mirando hacia abajo en la parte posterior del ratón: la línea roja que se ejecuta en el medio de la cola es una arteria, mientras que las líneas azules en ambos lados de la cola son las venas caudales laterales.
   5. Limpie la cola del ratón con una toallita de alcohol.
   6. Con la mano que no se inyectan, sostenga la cola con fuerza entre los dedos índice y medio para que la cola pasa por debajo del dedo índice, más de la mitad y la tercera los dedos y debajo del dedo meñique. Deje que el dedo pulgar se mantenga libre de moverse. (Figura 1A)
   7. Con la otra mano, limpie el área a inyectar de nuevo con un algodón empapado en alcohol. Permita que el área se seque.
   8. Tome la jeringa cargada con la inyección a mano y sujételo por barril entre el pulgar y los otros cuatro dígitos. No retener el émbolo.
   9. Coloque la jeringa paralela a la cola con la aguja apuntando hacia el cuerpo del ratón yel bisel (borde oblicuo) de la aguja hacia arriba.
   10. Inserte la aguja en la vena de la cola. Proceder con la inyección sólo si la vena está situado correctamente, lo que es evidente a partir de la aguja deslizante en sin resistencia. Tenga en cuenta que la profundidad de inserción de la aguja es una cuestión de preferencia personal, sin embargo, la inserción completa no se recomienda debido a un aumento del riesgo de corte de la vena. Evitar mover la aguja.
   11. Usando el dedo pulgar de la mano de la cola de retención, cierre en el cubo de la aguja y presione buje contra la cola para mantener la aguja en su posición. No aplique una presión extrema y no te detengas en el eje de la aguja, ya que impide el flujo de líquido en la vena. Sostenga la cola con el dedo índice ligeramente en este punto a fin de no obstaculizar la inyección (Figura 1A).
   12. Vuelva a colocar la mano jeringa sosteniendo de manera que el dedo índice y el dedo medio se están aferrando a la brida y el pulgar está en el extremo del émbolo (Figure 1A).
   13. Presione hacia abajo el émbolo en un movimiento continuo e inyectar el volumen total de líquido en 6-8 segundos.
   14. Retire la aguja de la vena y detener la hemorragia aplicando presión suave en la cola con un pañuelo de papel.
   15. Retire del ratón de la inmovilización y el lugar del ratón en una jaula de recuperación colocado encima de una almohadilla eléctrica (ropa de cama debe ser de 37-38 ° C). Si la sala de inyección es frío, este paso es fundamental para la supervivencia de los ratones. Apóyese en la cola del ratón hasta que el sangrado se detiene por completo.
   16. Observar el ratón durante 1 hora después de la entrega de ADN hidrodinámico. Un período inicial de jadeos y la inmovilidad es normal debido a la arritmia temporal causada por DAG, pero asegúrese de que el ratón muestra señales de recuperación en aproximadamente 5 min. Si la respiración del ratón llega a estar muy bajo, masajear suavemente el abdomen del ratón para facilitar la respiración. Tenga en cuenta que la tasa de recuperación puede ser un poco influenciado por la cepa de ratón utilizada.
   17. Ratón Retornoenjaular a la vivienda y garantizar que el ratón tiene un abundante suministro de alimentos y agua.
4. A gran volumen de inyección en la vena de la cola usando una posición alternativa mano
   1. Coloque ratón en la inmovilización y prepararse para la inyección siguiendo los pasos 4.3.1 a través de 4.3.5, tal como se describe anteriormente.
   2. Descanse la mano que no se inyectan en una superficie plana con cuatro dedos doblados en un ángulo de noventa grados. Los dedos (excepto el pulgar) todos deben descansar en la parte superior de uno al otro, la creación de una plataforma. Sostenga la cola del ratón entre el pulgar y el dedo que señala (fig. 1B).
   3. Con la otra mano, limpie el área a inyectar de nuevo con un algodón empapado en alcohol. Permita que el área se seque.
   4. Coge jeringa con la inyección a mano y mantenerla por la brida y el extremo del émbolo, lista para la inyección.
   5. Complete el procedimiento siguiendo este protocolo desde el paso 4.3.9 al paso 4.3.17, como se describió anteriormente.

Resultados

La colocación correcta de la aguja en la vena de la cola del ratón (como se ilustra en la Figura 1) es un requisito previo para el éxito la entrega de un transgén por transfección basado hidrodinámica-. A menudo la parte más difícil de la técnica, sin embargo, es la retención de la aguja dentro de la vena de la cola y sin movimiento para que todo el volumen de la inyección puede ser entregado en un plazo de 6-8 s. Los errores menores durante el proceso de inyección pueden resultar en muy red...

Discusión

Cuando se realiza correctamente, DAG es un medio muy seguro y eficaz de la prestación de los transgenes. Los pasos críticos para el éxito de DAG son: 1) la entrega de la cantidad correcta de ADN en un gran volumen de vehículo de solución salina 2) en la vena de la cola del ratón 3) en menos de 8 segundos.

Aunque el proceso de inyección en sí requiere sin duda alguna destreza manual, el éxito de este seis segundos procedimiento a menudo se encuentra en una cuidadosa preparación del ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcohol Prep Wipe	Webcol	6818
AST kit, Amplite Colorimetric	AAT Bioquest	13801
Conical Tube, 50 ml	BD Falcon	352070
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362
KimWipes	KIMTECH	34120
Mouse Tail Illuminator	Braintree Scientific	MTI RST	Or equivalent
Needle, 20 Gx 1 (0.9mmx25mm)	BD	305175
Needle, 27 Gx 1/2 (0.9mmx25mm)	BD	305109
pRG977 (mammalian expression vector)	Regeneron Pharmaceuticals		Material Transfer Agreement required
Sodium Chloride, 0.9% INJ USP 10 ml, Hospira	Fisher	NC9054335
Syringe, 3ml, Luer-Lok Tip	BD	309657	Luer Lock necessary to withstand pressure from HGD