マウスにおける流体力学的遺伝子送達によるタンパク質の一過性発現

要約

流体力学的遺伝子送達による裸のDNAのin vivoトランスフェクションは、最小限の炎症反応と動物の組織に遺伝子を導入しています。遺伝子産物の十分な量は、遺伝子の機能および調節、ならびにタンパク質の構造および機能を分析することができるように生成される。

要約

インビボでの導入遺伝子の効率的な発現は、遺伝子機能を研究および疾患のための治療法を開発する上で極めて重要である。過去数年にわたり、流体力学的遺伝子送達（HGD）はげっ歯類に導入遺伝子を提供するための、簡単、迅速、安全かつ効果的な方法として浮上している。この技術は、灌流臓器の細胞膜の透過性を増加させ、従って、細胞内にDNAを送達するために生理的溶液の大量の急速注入が発生する力に依拠している。 HGDの主な利点の一つは、裸のプラスミドDNA（pDNAの）を用いて哺乳動物細胞に導入遺伝子を導入する能力である。プラスミドを用いて外来遺伝子を導入することは最小限に、高効率、面倒で、ウイルスのキャリアに反して、格段に安全である。 HGDが最初にマウスに遺伝子を送達するために使用された、現在では、マウスへのオリゴヌクレオチド、人工染色体、RNA、タンパク質および小分子を含む広範囲の物質を送達するために使用され、ラットそして、限られた程度に、他の動物。このプロトコルは、マウスではHGDについて説明し、成功した手順を実行するに不可欠な方法の3つの重要な側面に焦点を当てています。正しい静脈への針の挿入、注入量および配信の速度。例は、分泌、霊長類特異的タンパク質をコードする2つの遺伝子の一過性発現にこの方法を適用することを示すために与えられて、アポリポタンパク質のLI（APOL-I）およびハプトグロビン関連タンパク質（HPR）。

概要

によるその最初の記述以来、Liu らとZhang ら 、流体力学的遺伝子送達（HGD）は、齧歯類モデル系^1、2における遺伝子機能を研究するための貴重なツールとなっています。技術は、標的器官^1,2,3の細胞によるプラスミドDNAの取り込みを容易にするために、マウスの尾静脈に大量の溶液（8〜12％の体重）の急速注入（5-7秒）を含む。これらの条件は、肝臓におけるロバストな遺伝子発現および腎臓、脾臓、肺および心臓におけるより少ない遺伝子発現をもたらす。

10のpCMV-LacZのプラスミドの注射はHGD日¹に、最も効率的、非ウイルス、in vivoでの遺伝子送達方法作り、肝細胞の40％をトランスフェクトすることができます。ウイルス担体とは異なり、pDNAの準備が容易であり、齧歯類宿主³において免疫応答を誘発しないと終了と再結合することにより健康リスクをもたらすものではないogenousウイルス。 HGDにより送達DNA分子は、パッケージングを必要としないので、また、この方法は、150キロバイト⁴と大きい細菌人工染色体（BAC）の送達に適している。流体力学的方法によって送達されている他のタイプの分子は、RNA ^384-768、モルホリノ^11、タンパク質^12、13および他の小分子^12、14を含む。その他の配送方法を超えるHGDの長所と短所は、文献^15から20に優れたレビューで議論されてきたと著者数が^21〜23の手順の詳細な説明を提供してきました。

HGDでマウスに導入遺伝子を導入することは、安全で^1-3、24有効であり、この方法は、同等の成功を²⁵としたラットで使用されています。ある種の改変で、概念実証実験は、ニワトリ²⁶にRABが行われているビット²⁷と豚^28は 、あるが、より大きな動物ではこの技術のin vivoでの適用は課題である。この方法を使用する場合、別の一般的な制限は、利用可能な哺乳動物発現ベクターの多くは、遺伝子発現の持続性の、高レベルを達成するための構成要素を欠いていることである。のpCMV-Lucのプラスミドを用いて、標的臓器における遺伝子発現がHGD後10分早ければ明らかであるが、当初、高発現レベルは、注射の¹の後の最初の週に急激に低下する。長期の導入遺伝子発現は、しかしながら、高レベルの遺伝子発現の維持は、多くの場合、反復注射を必要とするプラスミドのデザイン^3,24で用いられるプロモーターおよびイントロンに応じて可能である。このため、HGDは、タンパク質またはタンパク質産物を損傷への長期暴露の結果である慢性疾患を研究するのにはあまり適しかもしれない。これらの制限で、HGDはPOを研究するための例外的に強力なツールです。インビボでの遺伝子およびその変異体の効果、並びに治療効果およびタンパク質および疾患の動物モデルを確立するための調節の役割tential（総説については^、15を参照）。例えば、HGD、個別にそれぞれの遺伝子をノックアウトしたマウスに種々の遺伝子構築物を導入することにより、ドメインおよびタンパク質のアミノ酸に機能を割り当てるために使用されてもよい。さらに、この技術は、任意のマウス株において使用され得る。

配達の静脈、注入量と速度に正しい針の挿入：このプロトコルは、成功したトランスフェクションを達成するために必要な技術的な側面に焦点を当てたマウスではHGDについて説明します。この方法の適用は、アフリカトリパノソーマ症のマウスモデル、ヒトおよび家畜²⁹の致命的な病気^、30に示されている。トリパノソーマのいくつかの種は、家畜の病気の原因となるが、ほとんどは、Bで免疫複合体を生得によるヒトに疾患を引き起こすことはできません100dは呼ばトリパノソーマ溶解性因子^{（TLFS）29、31、32。} 。HPR、トリパノソーマにTLFSの取り込みを促進するリガンド、およびAPOL-I、溶解成分の^31、33-38 トリパノソーマ ：これらの孔形成、高密度リポタンパク質（HDL）が2ユニークな、霊長類特異的なタンパク質が含まれているローデシアはに結合し、人間APOL-I ^34、39を中和する血清耐性関連タンパク質（SRA）の発現のためにヒトに感染することができます。ヒヒTLFは、その発散APOL-Iタンパク質⁴⁰に、SRAによって中和されていません。哺乳動物発現ベクター（pRG977）を使用して、以前に報告されたように、マウスにおけるヒヒTLF成分のトランスジェニック発現は、ヒト感染性トリパノソーマ⁴⁰に対する防御を付与する。ここに提示代表的なデータは、遺伝子送達は、タンパク質の治療効果を研究するために適用することができる流体力学的方法を示している。

プロトコル

ここで説明する全ての実験は、ハンターカレッジの施設内動物管理使用委員会、ニューヨーク市立大学によって承認された。

エンドトキシンフリーのプラスミドDNAの1。準備

1. 新しく作製した選択プレートから哺乳動物発現ベクター中の目的の遺伝子を含む細菌のシングルコロニーを選択します。
2. バクテリアの成長や収穫のための市販のエンドトキシンフリープラスミド精製キットのハンドブック推奨事項に従ってください。
3. 市販のエンドトキシンフリープラスミド精製キットのプロトコールに従って細菌細胞からエンドトキシンフリーのプラスミドDNAを精製する。
4. エンドトキシンフリーのプラスチック製品を使用し、その毒素を除去工程後のDNAサンプルに再導入されていないように注意して、DNAを扱う。
5. MICRを用いて260nmの吸光度を測定することによりエンドトキシンフリーのプラスミドDNAの濃度を測定O容量の紫外線の下に説明するように、分光光度計または標準キュベットベースの分光光度計。
   1. 次のようにマイクロ分光光度計のサンプル保持システムの下限と上限の光学面をクリーニングします。低い光学系へのきれいな脱イオン水をピペット1μL。レバーアームを閉じて、上部の光学系を入浴するためにそれを数回タップしてから、オープンレバーやティッシュで拭いてください。
   2. マイクロ分光光度計のソフトウェアを開き、核酸モジュールを選択します。
   3. レバーアームを下げ、プログラムソフトから「初期化」を選択し、下側の光学システムに1μlのきれいな脱イオン水を置きます。初期化が完了すると、組織との両方の光学面をクリーニング..
   4. そして、プログラムソフトウェアから「ブランク」を選択することと、エンドトキシンフリーTEバッファー（1mMのEDTA、10mMのトリス-Cl、pH8.0）を1μLをロードすることによってブランク測定を行います。とブランク測定が完了すると、きれいな両方の光学面組織。
   5. エンドトキシンフリーのDNA試料を1μLをロードし、プログラムソフトウェアから「測定」を選択して、サンプル測定を実行します。 DNA濃度を記録します。画面に表示される吸光度比280分の260 nmで記録することにより、DNAの純度を評価。 HGDのための純粋なDNA（1.8の吸光度比260/280）を使用することが非常に望ましいことから、1.7以下の吸光度比260/280とのDNAサンプルを使用しないでください。測定が完了すると、組織との両方の光学面をクリーニングします。

2。マウスの計量

1. 株について適切な方法でマークしたマウス。注：尾のマーキングは、この手順にはお勧めできません。
   1. 黒のマーカーで仰向けに白い毛皮（ 例えばスイスウェブスター）がマークにマウス種。必要に応じて時間をかけてマークを再適用します。
   2. 耳で黒の毛皮（ 例えば 、C57BL / 6）を持つマークにマウス種は、事前に数日間パンチ。
2. マウスindividuaを量るLLY優しく動物計量皿やバケツに入れて、デジタル研究所スケール上に配置した。実験の日に、実験に用いた各マウスの体重を記録します。

注射器の3。準備

1. 注射ミックスの調製
   1. 各マウスの注入のための50μgのエンドトキシンフリープラスミドDNA - 5を想定して必要とされるDNAの量を計算します。
      1. 実験的にプラスミドDNAの最適量を決定します。
      2. 必要なDNAの量を決定する際には、注射器の適切なローディングは、いくつかの余分な注入ミックスが必要になりますように、グループごとに1つの追加のマウスの注入を想定しています。計算を支援するために、次の例を考えてみましょう。マウスあたり50μgのプラスミドDNAを用いて、4つの実験および4対照マウス、各重量25グラムを注入する。各グループのために必要な5×50μgの= 250μgのDNAをこの場合に必要とされるDNAの量を決定するために、グループあたり5匹で計算します。
   2. 各マウスの注射のために体重の10％を仮定して必要とされる生理食塩水の量​​（0.9％塩化ナトリウム）を決定する。
      1. 上記の例によれば、2.5ミリリットルの生理食塩水（2.5グラム液）中のプラスミドDNA50μgの各25gのマウスを注入する。
      2. マウスのグループ全体のために必要な生理食塩水の量​​を決定する際には、注射器の適切なローディングを可能にするために、グループごとの追加マウスの注入を想定しています。指定された実験を考慮すると、各グループの5匹のマウスに必要な生理食塩水の量​​を計算する：5×2.5ミリリットル=各グループの12.5ミリリットルの生理食塩水（または25ミリリットルの合計）。注：同じグループ内のマウスは、同じ量（体重の10％以上の差）でない場合、注入は別々に混合し調製する。
   3. 10ミリリットル、複数回使用バイアル中に、ヒトへの使用が承認されている防腐剤やエンドトキシンフリー、滅菌生理食塩水を使用してください。
   4. 20ミリリットルの注射器のルアーロック先端に取り付け20ゲージの針（X 25ミリメートル0.9ミリメートル）を使用して、生理食塩水のバイアルから液体を引き出すと50mlのコニカルチューブに注射器を空にする。 DNA-生理食塩水注入ミックスの製造中に生理食塩水の正確なピペット操作を支援するために、実験ではすべてのマウスの注射のために必要以上の生理食塩水を集める。上記の実験では、実験に必要な生理食塩水の計算された量だけ25ミリリットルであっても、3、10ミリリットルバイアル（約30ミリリットルの合計）から生理食塩水を撤回。
   5. 別の50ミリリットルコニカルチューブにDNAの計算された量をピペット。エンドトキシンの導入を回避するために、ピペット本体とチューブの側面に触れないように注意してください。実施例によれば、別個のコニカルチューブに実験的なプラスミドDNAの250μgの制御および250μgのにピペッティング。
   6. 血清学的ピペットを使用してDNAへの生理食塩水の必要量を加える。マスターミックス（実験及びコントロール）のそれぞれにサンプル実験、ピペット12.5ミリリットルの生理食塩水を考える。
   7. すべてのソリューションに到達することができます注射前に室温。
2. 注射器の作製
   1. 各マウスには、滅菌された20ゲージの針（0.9ミリメートル×25 mm）を用いたDNA-生理食塩水の混合、滅菌、3ミリリットル、ルアーロック注射器を埋める。気泡がないように注意してください。注入の流量がより高い体積のシリンジの使用を避け、非常によく制御することができず、それは片手で大きな注射器を操作することは困難である。これは、再使用できるように戻って円錐管に余分なDNA-生理食塩水のミックスを取り出します。
   2. 無菌の27ゲージの針に針を切り替えます。気泡を導入することなく、完全に液体と針を埋める。マウスの重量を基準にして計算されるように、DNA-生理食塩水ミックスの音量を調整します。
   3. キャップを外し、針が任意の非無菌面には触れないようにしてください。もう一方の手でキャップの上に保持せずに針を挿入し、蓋をし、針を押し、平らな面にキャップを配置します。必要に応じて、針が片手で技術を使用して再封止されていてもよい針にキャップを固定するためのしっかりしたオブジェクトに対して。注射器は現在、尾静脈注射の準備ができている。

4。流体力学的DNA送達

1. 麻酔マウスは生存能力を低下させる可能性があることに注意してください。これも生存性を低下するため、寒すぎる部屋でHGDを実行しないようにします。部屋は20℃の周囲温度がまたは麻酔を使用している場合は、任意の動物の損失を避けるために、37℃のポスト手順で設定した加熱パッドの上にマウスを置くと。麻酔を使用する場合は、マウスの口や鼻、熱パッドの上に障害物がない間であり、それが完全に回復するまで、マウスを観察していることを確認します。前HGD匹のマウスから食べ物や水を保留しないでください。
2. 血管を拡張するために、マウスを温める。
   1. （寝具は含まれていて）、寝具の温度が約38〜39℃になるように、5分間のヒートパッド上でマウスのケージを置きます温度は、ANのための加熱パッド上でマウスを維持するのに十分低くなければならない期間を延長した。
   2. 代わりに、最小限の拘束で背アクセス制止にマウスを置きます。優しく暖かい水で湿らせたガーゼとそれを保持することによって、1分間のマウスの尾を温める。必要であれば、マウスは再配置することができます。乾燥させるための組織と尾を拭きます。
   3. 代わりに、これ以上の2以上分間加熱ランプの下にケージを配置することによって暖かいマウス。加熱ランプを使用している場合は、マウスの過熱を避けるために、十分に注意してください。
3. 大容量尾静脈注射
   1. 実験室でのテープで平らな面に背アクセス制止を固定。
   2. 尾を持ち、静かに制止にマウスを置き、プラグを挿入します。固定化された尾を保つために、必要に応じて、わずか拘束を使用してください。マウスが自由に呼吸していることを確認してください。
   3. マウスが手術中の任意の時点で厳しい苦痛にある場合は、すぐに制止からマウスを取り外して、休息することができます。
   4. マウスを置きそう側方尾静脈のいずれかが表示される。尾の両側の青い線が横尾静脈であるが、尾の途中で実行されている赤い線は、動脈である：マウスの​​背中にまっすぐ下に見ることで横方向の尾静脈の位置を確認します。
   5. アルコール綿で十分にマウスの尾を拭いてください。
   6. 尾は中間および第三の指の上に小指の下に、人差し指の下を通過するように、非噴射の手を使用して、人差し指と中指の間でしっかりと尾を持つ。親指が自由に動くことがままにできるようにします。 （ 図1A）
   7. もう一方の手を使用して、アルコール綿で再び注入されるエリアを拭いてください。エリアを乾燥させる。
   8. 注入手にロードされた注射器を手に取り、親指と他の4桁の数字の間のバレルを持ってください。プランジ​​ャー上に持たないでください。
   9. 針はマウスの本体側に向けて尾に注射器を平行に配置し、上を向いて、針のベベル（斜めエッジ）。
   10. 尾静脈に針を挿入します。抵抗なく摺動針から明らかな静脈が正しく配置されている場合にのみ、注射、に進みます。針の挿入の深さはしかし、完全に挿入が原因で静脈のせん断のリスクの増加にはお勧めしません個人的な好みの問題であることに注意してください。 針を動かさないようにします。
   11. テール持った手の親指を使って、位置に針を保持するために、テールに対して針を押しハブのハブに閉鎖。極端な圧力を加えないでください、これらは静脈内への液体の流れを妨げるように、針の軸上に保持していません。インジェクション（ 図1A）を妨げないように、この時点で緩く人差し指で尻尾を持ちます。
   12. 再位置シリンジ保持手の人差し指と中指は、フランジ上に保持され、親指がプランジャの端になるように（FigurE 1A）。
   13. 1、連続動作にプランジャーを押し下げと6-8秒内の液体のフルボリュームを注入する。
   14. 静脈から針を外し、ティッシュで最後尾に穏やかな圧力を適用することにより、出血を止める。
   15. 加熱パッドの上に置かれ、回復ケージに拘束し、場所をマウスからマウスを取り外します（寝具37〜38℃にする必要があります）。注入部屋が冷えている場合は、このステップは、マウスの生存のために重要である。出血が完全に停止するまで、マウスの尾を握る。
   16. 流体力学的なDNA送達後1時間、マウスを観察します。喘ぐと不動の初期期間は、HGDによる一時的な不整脈に正常であるが、マウスは約5分で回復の兆しを示していることを確認してください。マウスの呼吸が非常に浅くなった場合は、ゆっくりと呼吸を容易にするために、マウスの腹部をマッサージ。回収率はわずかに使用したマウス株によって影響され得ることに留意されたい。
   17. リターンマウス住宅ケージ、マウスが食料や水の豊富な供給があることを確認してください。
4. 代替的な手の位置を使用して、大容量尾静脈注射
   1. 制止にマウスを置き、次の手順により、注射の準備を前述したように、4.3.5経由4.3.1。
   2. 90度の角度で曲げ4本の指で平らな面に非噴射の手を休める。指（親指を除く全て）は、プラットフォームを作成する、互いの上に載るべきである。親指と人差し指（ 図1B）との間にマウスの尾を保持します。
   3. もう一方の手を使用して、アルコール綿で再び注入されるエリアを拭いてください。エリアを乾燥させる。
   4. 注入 - 手で注射器をつかみ、フランジと、注射の準備ができて、プランジャー、年末を持ってください。
   5. 前述したように、ステップ4.3.17を経てステップ4.3.9から、このプロトコルに従って、手順​​を完了します。

結果

マウスの尾静脈への針の正確な位置決めは、（ 図1に示されるように）正常に流体力学ベースのトランスフェクションによって導入遺伝子を送達するための前提条件である。注射の全体積は6-8秒の期間内に送達することができるように、しばしば、技術の最も困難な部分は、しかし、移動せずに尾静脈内の針の保持である。射出プロセス中に小さなエラーが大幅に減少し、トラン...

ディスカッション

正しく実行すると、HGD、導入遺伝子の送達が著しく安全で有効な手段である。成功HGDへの重要なステップは、以下のとおりです。1）未満8秒でマウス3）の尾静脈に）生理食塩水車両2の大容量で、DNAの適切な量を提供する。

注射自体のプロセスは紛れもなく、いくつかの手先の器用さが必要ですが、この6秒の手続きの成功は、多くの場合、実験の入念な準備にある。最大...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcohol Prep Wipe	Webcol	6818
AST kit, Amplite Colorimetric	AAT Bioquest	13801
Conical Tube, 50 ml	BD Falcon	352070
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362
KimWipes	KIMTECH	34120
Mouse Tail Illuminator	Braintree Scientific	MTI RST	Or equivalent
Needle, 20 Gx 1 (0.9mmx25mm)	BD	305175
Needle, 27 Gx 1/2 (0.9mmx25mm)	BD	305109
pRG977 (mammalian expression vector)	Regeneron Pharmaceuticals		Material Transfer Agreement required
Sodium Chloride, 0.9% INJ USP 10 ml, Hospira	Fisher	NC9054335
Syringe, 3ml, Luer-Lok Tip	BD	309657	Luer Lock necessary to withstand pressure from HGD