Localización, identificación y Escisión de depósitos adiposos murino

Resumen

Debido a la conexión drástico y negativo entre la obesidad y otras comorbilidades, la investigación sobre el papel adiposo desempeña en la enfermedad y la salud en general se justifica. Se presenta un protocolo para el aislamiento y la escisión de los depósitos de tejido adiposo que permitan el estudio de tejido adiposo usando in situ y métodos in vitro.

Resumen

Obesity has increased dramatically in the last few decades and affects over one third of the adult US population. The economic effect of obesity in 2005 reached a staggering sum of $190.2 billion in direct medical costs alone. Obesity is a major risk factor for a wide host of diseases. Historically, little was known regarding adipose and its major and essential functions in the body. Brown and white adipose are the two main types of adipose but current literature has identified a new type of fat called brite or beige adipose. Research has shown that adipose depots have specific metabolic profiles and certain depots allow for a propensity for obesity and other related disorders. The goal of this protocol is to provide researchers the capacity to identify and excise adipose depots that will allow for the analysis of different factorial effects on adipose; as well as the beneficial or detrimental role adipose plays in disease and overall health. Isolation and excision of adipose depots allows investigators to look at gross morphological changes as well as histological changes. The adipose isolated can also be used for molecular studies to evaluate transcriptional and translational change or for in vitro experimentation to discover targets of interest and mechanisms of action. This technique is superior to other published techniques due to the design allowing for isolation of multiple depots with simplicity and minimal contamination.

Introducción

Adiposo hizo una aparición notable en la atención de los medios, debido al aumento espectacular de la obesidad durante las últimas décadas del siglo 20. La obesidad afecta actualmente a más de un tercio de los adultos y el 17% de los niños y adolescentes en los Estados Unidos (US) ^1. Que abarca todos los grupos étnicos, la investigación estadística que rodea la epidemia de la obesidad se ha demostrado que los negros no hispanos tienen la tasa ajustada por edad más alta de obesidad (49,5%) en comparación con los mexicano-americanos (40,4%), los hispanos (39.1%), y no los blancos no hispanos (34,3%) ^2. El efecto económico de la obesidad es también una preocupación cada vez mayor para el sistema sanitario. En 2012, se estimó que el costo anual de la atención médica para la obesidad en los EE.UU. en 2005 fue de $ 190,2 mil millones, casi el 21% del presupuesto total de los gastos médicos. Tristemente, la obesidad infantil se estima que es responsable por $ 14 mil millones en costos médicos directos solo. Estadísticamente, se determinó que el costo médico promedio deindividuos con obesidad fue $ 2,741 superior al año que aquellos sin esta morbilidad ^3-5.

La obesidad es un factor de riesgo importante para una variedad de condiciones tales como: la diabetes tipo 2, dislipidemia, enfermedad cardiovascular, cáncer, trastornos esqueléticos musculares y la inflamación crónica. La obesidad está profundamente ligada a la patogénesis del síndrome metabólico y otras enfermedades crónicas ^6-8. Con este tipo de conexiones drásticas y negativas entre la obesidad y otras comorbilidades, la investigación científica ha centrado la atención para comprender mejor la epidemia actual y los papeles diversos y esencial desempeñada por adiposo.

Históricamente, el tejido adiposo se considera intrascendente y fue visto simplemente como un tejido simple relleno. Actualmente, adiposo se ha demostrado que desempeñan muchas funciones esenciales en la función del cuerpo en: metabolismo, la regulación hormonal, la inflamación, la protección y el aislamiento ^9. El tejido adiposo está compuesto principalmente deadipocitos, pero también contiene los pericitos, células endoteliales, monocitos, macrófagos y células madre pluripotentes ^8. El tejido adiposo se distribuye por todo el cuerpo en depósitos distintos. Los principales depósitos se pueden encontrar por vía subdérmica, subcutánea, intramuscular, y visceral ^10. Depósitos adiposos se han demostrado tener unos perfiles metabólicos específicos de depósito, que han demostrado una susceptibilidad específica de depósito a la obesidad y trastornos relacionados ^8.

Tradicionalmente, el tejido adiposo se ha clasificado en dos tipos principales: tejido adiposo blanco (WAT) y tejido adiposo marrón (BAT); aunque la literatura reciente indica las presencias de un tercer grupo bautizaron adiposo brite o beige ^11. El tejido adiposo se ha demostrado que tienen diferentes colores, morfologías, funciones metabólicas, las características bioquímicas y patrones de expresión genéticos ^10. Los adipocitos en WAT tienen un único y gran gotas de lípidos y cantidades variables de las mitocondrias. WATse encuentra predominantemente en las localidades subcutáneos y viscerales del cuerpo. Funciones WAT principalmente como un sitio de almacenamiento de energía y la protección de órganos. Los adipocitos en BAT tienen una morfología multilocular y abundantes mitocondrias. BAT se encuentra principalmente en el cuello y los grandes vasos sanguíneos del tórax, así como las escápulas ^12. BAT funciona principalmente en los comportamientos de gastar energía que regulan la termogénesis ^7. Adiposo Brite o beige se ha demostrado que compartir una morfología y la expresión análoga a BAT pero se ha encontrado para ser originado a partir de adipocitos blancos ^11.

El método quirúrgico se describe en este manuscrito proporciona a los investigadores la capacidad de analizar los diferentes efectos que factores tales como: medio ambiente, productos farmacéuticos, y la genética, tienen sobre adiposo; así como el papel adiposo beneficioso o perjudicial juega en la enfermedad y la salud en general. Además, proporcionando una manera de identificar y aislar diferentes tipos de tejido adiposo parapermitirá comprender mejor las relaciones bioquímicas y diferencias entre los depósitos. Esto puede ayudar en la determinación de la relación entre la ubicación, la función y tipos de grasa en el cuerpo. Este método descrito logra esto proporcionando los medios para la visualización bruto, el análisis de la expresión génica, análisis de la expresión de proteínas, el examen histológico, y el aislamiento de líneas celulares primarias para estudios in vitro. Actualmente hay muchos artículos que proporcionan información sobre el comportamiento metabólico de los diferentes depósitos de tejido adiposo, así como sus localizaciones anatómicas; pero no proporcionan un método en profundidad sobre cómo localizar de forma específica, identificar y aislar a estos depósitos. Este método proporciona una técnica quirúrgica precisa que permite el aislamiento de múltiples depósitos con una cantidad mínima de la disección y la contaminación en comparación con otros métodos diseñados para el aislamiento de uno o dos depósitos ^13-14.

El objetivo de este protocolo es proporcionarun método preciso para la identificación y el aislamiento de diferentes tipos de depósitos de grasa desde múltiples localizaciones anatómicas.

Protocolo

NOTA: Todos los animales procedimientos fueron realizados con la aprobación del Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) de la Universidad de Cincinnati y de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud (NIH Publication No . 85-23, revisado 1996).

1. La eutanasia y esterilizar el ratón

1. Coloca el ratón en un dropbox que contiene una dosis supratheraputic de isoflurano y permitir a inhalar a efecto. Una vez que el ratón es sacrificado, retirar de la caja.
2. Cervical dislocar como un segundo medio de la eutanasia.
3. Esterilizar la superficie externa del ratón por la limpieza del animal con etanol al 70%.

2. Identificación y aislamiento de tres diferentes depósitos adiposos

1. Tejido adiposo marrón (BAT) Aislamiento:
   1. Asegúrese de que la piel está húmeda de la limpieza de alcohol para ayudar a la corte a través de la epidermis y la dermis layers.
   2. Coloque el ratón en una posición supina con la espalda contra la mesa.
   3. Coge la piel justo debajo del diafragma con fórceps, ascensor y una incisión con tijeras.
   4. Cortar transversalmente alrededor de la circunferencia del ratón para exponer el peritoneo.
   5. Revelar la BAT depósito en forma de mariposa por degloving la mitad superior del ratón. Mantenga los apéndices inferiores y el abdomen en una mano y tirando de la piel hacia la cabeza.
   6. Orientar el ratón, de modo que se coloca boca abajo en la mesa. Tenga cuidado de no contaminar el depósito expuesto con el pelo.
   7. Instrumentos quirúrgicos limpios y el cambio a un nuevo par de guantes.
   8. Busque la escápula y depósito correspondiente. Retire con cuidado el adiposo blanco superficial encima de la mariposa y luego diseccionar la mariposa de la grasa marrón interescapular. Tenga cuidado de evitar que el músculo estrechamente asociado con la grasa parda.
      NOTA: El uso de un microscopio de disección se recomienda para la eliminación de la white adiposo, así como en la separación de la adiposo marrón de las escápulas.
   9. Quite la grasa de depósito y transferir a un tubo de microcentrífuga de 2 ml.
   10. Si el ARN o proteína es a extraer, congelar el tejido por inmersión en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C. Congelar la muestra a la vez para evitar la degradación. Si el cultivo, cubrir el tejido en DMEF-12 y establecer en hielo hasta que se recogen todas las muestras para cultivo (información complementaria).
2. Aislamiento de tejido adiposo subcutáneo (SC), un blanco tejido adiposo Depot (WAT):
   1. Póngase un par de guantes nuevos como a la contaminación cruzada entre los depósitos de grasa.
   2. Revelar la inguinal, depósitos SQ triangulares por DE-enguantado la mitad inferior del ratón. Mantenga los apéndices superiores y tórax en una mano y tirando de la piel hacia abajo hacia los pies con la otra mano.
   3. Oriente el ratón en una posición supina con cuidado de no contaminar el depósito expuesto con el pelo.
   4. Surgica Cleaninstrumentos l y el cambio a un nuevo par de guantes.
   5. Diseccionar cuidadosamente los triángulos de grasa SQ. Tenga cuidado de no contaminar la muestra con el músculo, la vecina de grasa, glándulas mamarias o cortando cualquier barco y contaminar la muestra de sangre.
      NOTA: El uso de un microscopio de disección se recomienda si las fronteras no están claramente definidos.
   6. Retire los depósitos de grasa y la transferencia a 2 ml tubos de microcentrífuga.
   7. Si el ARN o proteína es a extraer, congelar el tejido por inmersión en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C. Congelar la muestra a la vez para evitar la degradación.
   8. Para la tinción, arreglar o incrustar en octubre Si el cultivo, cubrir el tejido en DMEF-12 y establecer en hielo hasta que se recogen todas las muestras para cultivo (información complementaria).
3. Aislamiento de gonadal Fat un tejido adiposo visceral (IVA) y el tejido adiposo blanco (WAT) Depot:
   1. Póngase un par de guantes nuevos como a la contaminación cruzada entre los depósitos de grasa.
   2. Con cienciassors, cortar el peritoneo transversalmente, directamente debajo del diafragma. Cortar el peritoneo desde el diafragma hasta mediados recto coronalmente para exponer los órganos abdominales.
   3. Localizar los testículos o los ovarios e identificar el tejido adiposo blanco adjunto, conocido como el adiposo del epidídimo en varones o adiposo gonadal en las hembras.
   4. Instrumentos quirúrgicos limpios y el cambio a un nuevo par de guantes
   5. Diseccionar cuidadosamente ambos depósitos de grasa del epidídimo de los testículos, epidídimos y conductos deferentes. O si es mujer, diseccionar cuidadosamente ambas almohadillas de grasa gonadal de los ovarios.
   6. Retire los depósitos de grasa y transferirlos a 2 tubos de microcentrífuga ml.
   7. Si el ARN o proteína es a extraer, congelar el tejido por inmersión en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C. Congelar la muestra a la vez para evitar la degradación.
   8. Para la tinción, arreglar o incrustar en octubre Si el cultivo, cubrir el tejido en DMEF-12 y establecer en hielo hasta que se recogen todas las muestras para cultivo (información complementaria).

3. Aislamiento de tejido adiposo perivascular (IVAP)

1. Aislamiento del Corazón:
   1. Coloque el ratón en una posición supina con apéndices superior e inferior extendidas hacia afuera.
   2. Apéndices Seguros que utilizan una cinta quirúrgica.
   3. Después de colocar el ratón como se indica anteriormente, crear tensión levantando el proceso xifoides con fórceps. Cortar horizontalmente a través del diafragma, la exposición de la parte inferior de la cavidad torácica.
   4. Mientras mantiene la tensión, levantando el proceso xifoides, cortar a través de la caja torácica superiormente hacia la cabeza, sólo para el lado del esternón.
   5. Recoger la caja torácica justo por debajo de la clavícula, y cortar a lo largo de la longitud inferior de la clavícula hacia fuera hacia la axila en ambas direcciones. La cavidad torácica y su contenido (corazón, pulmones, etc.) deben ahora ser claramente visible.
   6. Limpie la cavidad torácica de la sangre ajena y líquido utilizando ga estériluze para absorber el fluido. Si órganos o recipientes colectores asegúrese de profuso (información complementaria).
   7. Una vez que el área se borra de líquido, cortar los vasos y bronquios de fijación para eliminar los pulmones, lo que permite una mejor exposición del corazón.
2. Localización y Escisión de tejido adiposo perivascular aórtica (IVAP):
   1. Quite los siguientes órganos como para identificar mejor las porciones inferiores de la aorta: hígado, estómago, bazo, páncreas, intestinos y colon.
   2. En primer lugar comenzar con la identificación del estómago y el esófago. Cortar el esófago en la unión gastro-esofágica para liberar el estómago del cuerpo.
   3. A continuación, identificar los intestinos y el mesenterio circundante. Cortar superficialmente a través de mesenterio, ya que se encuentra muy de cerca a la porción renal de la aorta, luego "ejecutar el intestino."
   4. Cortar el colon libre como cerca del recto posible. Por lo tanto, liberando el estómago, intestino y colon de ratón.
   5. Remover el estómago, intestino, colon, páncreas y el bazo cortando a través del mesenterio de fijación y los vasos. El páncreas y el bazo deben venir libre con el estómago, intestino y colon.
   6. Retire el hígado por el corte a través de las venas hepáticas y adjuntando mesenterio, retire todos los lóbulos.
   7. Cortar la capa visceral y la grasa rodean los riñones. Deja los riñones unidos a la aorta in vivo para servir como marcadores geográficos para los diferentes segmentos de la aorta.
   8. Enjuague el área con 1x PBS estéril y eliminar todo el fluido por absorción con una gasa estéril.
   9. El uso de micro-tijeras y micro-pinzas, separar la aorta de su apego a la espina dorsal y su enganche ventral al esófago.
   10. Aislar la aorta siguiendo y desconexión de la aorta de la longitud de la aorta descendente desde el origen en el corazón hasta la bifurcación en la región ilíaca.
   11. Identificar y aislar los vasos subclavia. Aislar estas embarcacionesdesde el cuello hasta la raíz aórtica para exponer mejor la unión aórtica y la raíz en el corazón.
   12. Retire el timo a continuación, cortar el tronco braquiocefálico, la arteria carótida común izquierda y la arteria subclavia izquierda, permitiendo el movimiento del corazón.
   13. Con la ayuda de un microscopio de disección, ver la capa de tejido adiposo perivascular (IVAP) que rodea la aorta.
   14. Teniendo mucho cuidado para no pellizcar o apretar el IVAP, tire suavemente de la manera IVAP de la aorta con micro-forceps. Cortar suavemente la fijación de la IVAP a la aorta con micro-tijeras a partir de la región torácica justo por encima de donde se encuentra el diafragma.
       NOTA: Se recomienda utilizar un microscopio de disección.
   15. Repita este proceso toda la longitud de la aorta, terminando en la región de la aorta infrarrenal, que se encuentra justo por encima de la bifurcación ilíaca del vaso aórtico.
   16. Si se desea arco IVAP aórtica, que se utiliza el mismo método para eliminar el IVAP de la menor curvature del arco.
   17. Coloque las muestras IVAP en 2 ml tubo (s) de microcentrífuga.
   18. Si el ARN o proteína es a extraer, congelar el tejido por inmersión en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C. Congelar la muestra a la vez para evitar la degradación. Si el cultivo, cubrir el tejido en DMEF-12 y establecer en hielo hasta que se recogen todas las muestras para cultivo (información complementaria).
       NOTA: los depósitos adiposos adicionales a tener en cuenta si está interesado en un análisis exhaustivo de depósito adiposo incluye: retroperitoneal, mesentérica, omental, pericárdico y poplítea.

Resultados

Identificación y localización de inguinal adiposo subcutáneo, tejido adiposo marrón interescapular, adiposo del epidídimo visceral (Figura 1), así como el adiposo perivascular arco aórtico, la aorta torácica adiposo, tejido adiposo aórtica suprarrenal y el tejido adiposo de la aorta infrarrenal (Figura 2) se logró con éxito utilizando el método quirúrgico descrito. El examen histológico y la diferenciación entre muestras MTD y WAT fueron evaluados positivamente mediante h...

Discusión

La obesidad puede conducir a una gran cantidad de morbilidades y la plena comprensión del papel que juega adiposo no se entiende completamente; Por lo tanto, la investigación continuada en el campo de la adiposo es necesario. Los modelos animales, específicamente modelos murinos son ideales para la investigación inicial en la progresión de las enfermedades y las pruebas de los posibles tratamientos farmacéuticos. En el uso de estos modelos, el aislamiento y la escisión precisa de los depósitos de tejido adiposo ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Med-Vet International	#RXISO-250
70% Ethanol	Fisher	07-678-001
DMEF-12	Sigma Aldrich	D-6421	Warm in waterbath before putting on tissue.
2 ml Microcentrifuge tubes	Midsci	MCT-200-C-S
Phosphate buffered saline	Sigma Aldrich	P5368-10PAK