Локализация, идентификация и Удаление мышиный жировой депо

Резюме

Из-за резкого и отрицательной связи между ожирением и другими сопутствующими заболеваниями, исследование о роли жировой играет в болезни и общее состояние здоровья является оправданным. Мы приводим протокол для выделения и удаления жировых депо, позволяющих проводить исследования жировой помощью на месте и в лабораторных методов.

Аннотация

Obesity has increased dramatically in the last few decades and affects over one third of the adult US population. The economic effect of obesity in 2005 reached a staggering sum of $190.2 billion in direct medical costs alone. Obesity is a major risk factor for a wide host of diseases. Historically, little was known regarding adipose and its major and essential functions in the body. Brown and white adipose are the two main types of adipose but current literature has identified a new type of fat called brite or beige adipose. Research has shown that adipose depots have specific metabolic profiles and certain depots allow for a propensity for obesity and other related disorders. The goal of this protocol is to provide researchers the capacity to identify and excise adipose depots that will allow for the analysis of different factorial effects on adipose; as well as the beneficial or detrimental role adipose plays in disease and overall health. Isolation and excision of adipose depots allows investigators to look at gross morphological changes as well as histological changes. The adipose isolated can also be used for molecular studies to evaluate transcriptional and translational change or for in vitro experimentation to discover targets of interest and mechanisms of action. This technique is superior to other published techniques due to the design allowing for isolation of multiple depots with simplicity and minimal contamination.

Введение

Жировая внесли заметный внешний вид в центре внимания средств массовой информации, в связи с резким увеличением ожирения в течение последних нескольких десятилетий 20-го века. Ожирение в настоящее время затрагивает более чем одну треть взрослых и 17% детей и подростков в Соединенных Штатах Америки (США) ^1. Spanning всех этнических групп, статистическое исследование вокруг эпидемии ожирения показали, что не испаноязычные чернокожие имеют самый высокий уровень с поправкой на возраст ожирения (49,5%) по сравнению с американцев мексиканского происхождения (40,4%), все выходцы из Латинской Америки (39,1%), и не- Испанец белые (34,3%) ^2. Экономический эффект ожирения также растущее беспокойство для системы здравоохранения. В 2012 году было подсчитано, что ежегодные медицинские затраты на лечение от ожирения в США в 2005 составил $ 190,2, почти 21% от общего медицинского расходов бюджета. К сожалению, детское ожирение, по оценкам, будет отвечать за $ 14 млрд в прямые медицинские расходы в одиночку. Статистически, было установлено, что в среднем медицинской стоимостилюди с ожирением составила $ 2741 выше году, чем те, без этого заболеваемости ^3-5.

Ожирение является основным фактором риска для различных условий, таких как: сахарный диабет типа 2, дислипидемии, сердечно-сосудистых заболеваний, рака, мышечных скелетных расстройств и хронического воспаления. Ожирение глубоко связаны с патогенезом метаболического синдрома и других хронических заболеваний ^6-8. С таким решительным и отрицательных связей между ожирением и другими сопутствующими заболеваниями, научные исследования обратили внимание, чтобы лучше понять текущей эпидемии и разнообразные и основные роли, которую играют жировой.

Исторически сложилось так, жировой ткани считалось несущественным, и рассматривалось просто как простой заполнения ткани. В настоящее время, жировая как было показано, играют многие важные роли в функции организма в: обмена веществ, гормональной регуляции, воспаление, защиты и изоляции ^9. Жировая ткань состоит в основном изадипоциты, но также содержит перицитов, эндотелиальные клетки, моноциты, макрофаги и плюрипотентных стволовых клеток ^8. Жировая ткань распределяется по всему телу в разных депо. Основные депо могут быть найдены подкожно, подкожно, внутримышечно и интуитивно ^10. Жировые депо, как было показано, чтобы иметь депо конкретные метаболические профили, которые показали депо конкретную восприимчивость к ожирению расстройств, связанных и ^8.

Традиционно, жировая ткань была классифицирована на два основных типа: белая жировая ткань (WAT) и бурая жировая ткань (BAT); хотя в последнее время литература указывает Присутствия третьей группы окрестили Brite или бежевый жировой ^11. Жировая ткань как было показано, имеют различные цвета, морфологию, метаболические функции, биохимические свойства и генетические паттерны экспрессии ^10. Адипоциты в Ват есть один большой липидов капли и различное количество митохондрий. WATв преимущественно находятся в подкожной и висцеральной местах тела. WAT функционирует в первую очередь как место хранения энергии и защиты органа. Адипоциты в городе Бат есть многоячеистую морфологию и обильные митохондрии. ВАТ расположен в основном в области шеи и крупных кровеносных сосудов грудной клетки, а также лопатками ^12. BAT в первую очередь функции в энергетических расходовать поведения, которые регулируют термогенез ^7. Brite или бежевого жировая было показано, что разделяют аналогичную морфологии и экспрессии на биту, но было установлено, что возник из белых адипоцитов ^11.

Описаны хирургический метод в этой рукописи предоставляет исследователям с возможностью анализировать различные эффекты, что такие факторы, как: окружающая среда, фармацевтика, и генетики, имеющие на жировой; а также выгодно или вредно роль жировой играет в болезни и общего состояния здоровья. Кроме того, предоставляя возможность для идентификации и выделения различных типов жировой тканипозволяют лучше понять биохимические отношений и различий между депо. Это может помочь в определении отношения между местоположением, функции и виды жира в организме. Описанный метод решает эту задачу, обеспечивая средства для валового визуализации, анализа экспрессии генов, анализа экспрессии белка, гистологического исследования и изоляции линий первичных клеточных для изучения в лабораторных условиях. В настоящее время существует много статей, которые дают представление о метаболической поведения различных жировых депо, а также их анатомических местах; но не предоставляют метод углубленного о том, как конкретно локализовать, идентифицировать и изолировать эти склады. Это хирургический метод обеспечивает точное метод, который позволяет для выделения нескольких депо с минимальным количеством вскрытия и загрязнение по сравнению с другими методами, предназначенных для изолята из одного или двух депо ^13-14.

Цель этого протокола заключается в обеспеченииточный метод для выявления и изоляции различных типов жировых депо из нескольких анатомических мест.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры на животных были проведены с одобрения уходу и использованию комитета Институциональная животных (IACUC) из Университета Цинциннати и в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных от Национальных Институтов Здоровья (NIH Издание № . 85-23, пересмотренное в 1996 г.).

1. Эвтаназии и стерилизовать мыши

1. Наведите в раздаточной коробке, содержащей supratheraputic дозу ИФ и позволяют вдыхать эффект. После того, как мышь эвтаназии, снять с коробки.
2. Цервикально вывихнуть в качестве второго средства эвтаназии.
3. Стерилизация внешней поверхности мыши, очищая животное с 70% этанола.

2. Выявление и изоляция трех различных жировой депо

1. Бурая жировая ткань (BAT) Изоляция:
   1. Убедитесь, что мех мокрые от чистки алкоголя, чтобы помочь в проходящем через эпидермальный и дермальный ЛеRS.
   2. Наведите указатель мыши в лежачем положении с его спиной к столу.
   3. Возьмите кожу чуть ниже диафрагмы щипцами, лифт и надрезать ножницами.
   4. Вырезать поперек по окружности мыши, чтобы выставить брюшины.
   5. Выявить в форме бабочки BAT депо по degloving верхнюю половину мыши. Удерживайте нижнюю придатки и живота в одной руке и вытягивать кожу вверх, к голове.
   6. Ориентируйте мыши, таким образом, что он расположен склонны на столе. Будьте осторожны, чтобы не загрязнять подвергаются депо с волосами.
   7. Чистые хирургические инструменты и изменения в новую пару перчаток.
   8. Найдите лопатки и соответствующий склад. Осторожно удалите поверхностную белой жировой вершине бабочки, а затем рассекают бабочку межлопаточной бурого жира. Будьте осторожны, чтобы избежать мышцы тесно связана с бурого жира.
      ПРИМЕЧАНИЕ: использование рассечение микроскопом рекомендуется для удаления WХайт жировая, а также в разделении бурой жировой от лопатками.
   9. Удалить жировые депо и перенести в 2 мл микроцентрифужных трубки.
   10. Если РНК или белок должны быть извлечены, заморозить ткань погружением в жидкий азот и хранить при -80 ° С. Замораживание образца сразу, чтобы предотвратить деградацию. Если культивирования, покрывают ткань в DMEF-12 и установить на льду, пока все образцы собираются в культуре (дополнительного информации).
2. Выделение подкожной жировой ткани (SQ), белой жировой ткани Depot (WAT):
   1. Положите на новую пару перчаток, чтобы не заражать между жировых депо.
   2. Выявить паховые, треугольные SQ склады де-перчаток нижнюю половину мыши. Держите верхний придатки и грудной клетки в одной руке и вытягивать кожу вниз, к ногам с другой стороны.
   3. Расположите курсор в положении лежа на спине, стараясь при этом, чтобы не загрязнить подвергаются депо с волосами.
   4. Чистый surgicaл инструменты и поменять на новую пару перчаток.
   5. Осторожно рассекают треугольники SQ жира. Будьте осторожны, чтобы не загрязнить образец с мышц, соседние жира, молочных желез или резки любые суда и загрязнять образец с кровью.
      ПРИМЕЧАНИЕ: использование рассечение микроскопом рекомендуется, если границы четко не определены.
   6. Удалить жировые отложения и трансфер в 2 мл микропробирок.
   7. Если РНК или белок должны быть извлечены, заморозить ткань погружением в жидкий азот и хранить при -80 ° С. Замораживание образца сразу, чтобы предотвратить деградацию.
   8. Для окрашивания исправить или вставлять в октябре Если культивирования, покрывают ткань в DMEF-12 и установить на льду, пока все образцы собираются в культуре (дополнительного информации).
3. Выделение половых желез жира висцеральной жировой ткани (НДС) и белой жировой ткани (WAT) Depot:
   1. Положите на новую пару перчаток, чтобы не заражать между жировых депо.
   2. С научноssors, вырезать брюшины в поперечном направлении, непосредственно под диафрагмой. Вырезать брюшины от диафрагмы до прямой кишки середине коронки, чтобы разоблачить органов брюшной полости.
   3. Найдите яички или яичники и определить прилагаемый белой жировой ткани, известный как придатка жировой у мужчин или половых жировой у женщин.
   4. Чистые хирургические инструменты и изменения к свежим пару перчаток
   5. Осторожно рассекают как придатка яичка жировые отложения из яичек, придатков и семявыносящих протоков. Или если женщина, тщательно анализировать как гонадных жировые из яичников.
   6. Удалить жировые отложения и передавать их на 2 мл микропробирок.
   7. Если РНК или белок должны быть извлечены, заморозить ткань погружением в жидкий азот и хранить при -80 ° С. Замораживание образца сразу, чтобы предотвратить деградацию.
   8. Для окрашивания исправить или вставлять в октябре Если культивирования, покрывают ткань в DMEF-12 и установить на льду, пока все образцы собираются в культуре (дополнительного информации).

3. Выделение Периваскулярный жировой ткани (PVAT)

1. Выделение сердца:
   1. Положите мышь в положении лежа на спине с верхней и нижней конечностей, предоставленных наружу.
   2. Безопасные придатки с помощью хирургической лентой.
   3. После размещения мыши, как указано выше, создают напряженность, поднимая мечевидного отростка с щипцами. Вырезать горизонтально через мембрану, подвергая нижнюю часть грудной полости.
   4. Сохраняя напряжение, поднимая на мечевидного отростка, прорезать грудной клетки сверху к голове, только в сторону грудины.
   5. Поднимите грудную клетку только, ниже ключицы, и разрезать вдоль нижней длины ключицы из к подмышечной впадине в обоих направлениях. Грудной полости и его содержимое (сердце, легкие и т.д.) теперь должны быть четко видны.
   6. Очистите грудной полости постороннего крови и жидкости с помощью стерильного гаUZE поглощать жидкость. Если сбор органов или судов убедитесь, что обильная (дополнительный данные).
   7. После того, как область очищены от жидкости, разрезать бронхов и присоединение сосуды, чтобы удалить легкие, что позволяет лучше воздействие на сердце.
2. Локализация и Удаление аорты Периваскулярный жировой ткани (PVAT):
   1. Удалите следующие органы, чтобы лучше определить низшие части аорты: печень, желудок, селезенка, поджелудочная железа, кишечник и толстой кишки.
   2. Начать с идентификации желудка и пищевода. Вырезать пищевода при желудочно-пищеводного перехода, чтобы освободить желудок от тела.
   3. Затем определите кишечника и окружающий брыжейки. Вырезать поверхностно через брыжейки, как он лежит очень близко к почечной части аорты, затем "работать кишечник."
   4. Вырезать толстой кишки освободить как можно ближе к прямой кишке, как это возможно. Таким образом, освобождение желудка, кишечника и толстой кишки с помощью мыши.
   5. Репереместить желудка, кишечника, толстой кишки, поджелудочной железы и селезенки путем перерезания примыкающим брыжейки и сосудов. Поджелудочная железа и селезенка должны прийти бесплатно с желудка, кишечника и толстой кишки.
   6. Удалить печени путем перерезания печеночных вен и присоединение брыжейки, удалите все лепестки.
   7. Срежьте висцерального слой и жир окружает почки. Оставьте почки, прикрепленные к аорте в естественных условиях в качестве географических маркеров для различных сегментов аорты.
   8. Промыть области с стерильной 1x PBS и удалить всю жидкость за счет поглощения с стерильную марлю.
   9. Использование микро-ножницы и микро-щипцы, разделите аорты от ее привязанности спинной к позвоночнику и его вентральной привязанности к пищевода.
   10. Изолировать аорты, следуя и снятие аорты длину нисходящей аорты от происхождения в центре бифуркации в подвздошной области.
   11. Идентифицировать и изолировать подключичной сосуды. Изолировать эти судаот шеи до корня аорты лучше выставить аорты переход и корень в сердце.
   12. Удалить тимус затем вырезать брахиоцефальных артерий, левой общей сонной артерии, и левой подключичной артерии, позволяя при этом движение сердца.
   13. С помощью рассечения микроскопом, просмотр периваскулярной жировой ткани (PVAT) слой, окружающий аорты.
   14. Принимая большую осторожность, чтобы не прищемить или выжать PVAT, осторожно потяните PVAT путь от аорты с микро-щипцами. Осторожно разрезать прикрепление PVAT в аорте с микро-ножниц, начиная с грудного отдела просто превосходной, где диафрагма расположена.
       ПРИМЕЧАНИЕ: рассечение микроскоп рекомендуется.
   15. Повторите эту процедуру на всю длину аорты, заканчивая инфраренальной аорты области, который находится всего выше подвздошной бифуркации аорты судна.
   16. Если дуга аорты PVAT желательно, использовали тот же метод для удаления PVAT от меньшей Curvature арки.
   17. Поместите образцы PVAT в 2 мл микроцентрифужных трубки (ов).
   18. Если РНК или белок должны быть извлечены, заморозить ткань погружением в жидкий азот и хранить при -80 ° С. Замораживание образца сразу, чтобы предотвратить деградацию. Если культивирования, покрывают ткань в DMEF-12 и установить на льду, пока все образцы собираются в культуре (дополнительного информации).
       ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительные склады жировой рассмотреть, если заинтересованы в комплексном анализе жировой депо включают в себя: забрюшинных, брыжеечных, сальника, перикарда и подколенных.

Результаты

Идентификация и локализация паховой подкожной жировой, межлопаточной бурой жировой, висцеральной придатка жировой (рисунок 1), а также дуги аорты периваскулярной жировой, грудного отдела аорты жировой, надпочечников аорты жировой и инфраренальной аорты жировой (Рисунок 2...

Обсуждение

Ожирение может привести к большому целому ряду заболеваний и полном понимании той роли, которую жировой играет до конца не изучен; Поэтому продолжение исследований в области жировой необходимо. Модели на животных, в частности, мышиные модели идеально подходят для начального исследова...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Med-Vet International	#RXISO-250
70% Ethanol	Fisher	07-678-001
DMEF-12	Sigma Aldrich	D-6421	Warm in waterbath before putting on tissue.
2 ml Microcentrifuge tubes	Midsci	MCT-200-C-S
Phosphate buffered saline	Sigma Aldrich	P5368-10PAK