Adaptación videofluoroscópicos Swallow Métodos de Estudio Humanos para detectar y caracterizar disfagia en modelos murinos de enfermedades

Resumen

Este estudio adaptado con éxito videofluoroscópico tragar estudio (VFSS) métodos humanos para su uso con modelos de enfermedad murinos con el fin de facilitar la investigación traslacional disfagia.

Resumen

Este estudio adaptado videofluoroscópico humana tragar estudio métodos (VFSS) para su uso con modelos de enfermedad murinos con el fin de facilitar la investigación traslacional disfagia. Los resultados exitosos dependen de tres componentes fundamentales: cámaras de prueba que permiten la auto-alimentación mientras está de pie sin restricciones en un espacio confinado, recetas que enmascaran el sabor aversivo / olor de agentes de contraste orales disponibles en el mercado, y un protocolo de prueba paso a paso que permite la cuantificación de la fisiología golondrina. Eliminación de uno o más de estos componentes tendrá un impacto negativo en los resultados del estudio. Por otra parte, la capacidad de nivel de energía del sistema de fluoroscopia determinará que tragar parámetros puede ser investigado. La mayoría de los centros de investigación tienen fluoroscopios alta energía diseñados para su uso con las personas y los animales más grandes, lo que resulta en excepcionalmente pobre calidad de imagen cuando se prueban los ratones y otros roedores pequeños. A pesar de esta limitación, hemos identificado siete VFSParámetros S que son consistentemente cuantificable en ratones cuando se utiliza un fluoroscopio de alta energía, en combinación con el nuevo protocolo VFSS murino. Hemos obtenido recientemente un sistema de fluoroscopia de baja energía con capacidades excepcionales de alta resolución de imagen y de ampliación que fue diseñado para su uso con ratones y otros roedores pequeños. Los trabajos preliminares con este nuevo sistema, en combinación con el nuevo protocolo VFSS murino, ha identificado 13 parámetros golondrina que son consistentemente cuantificables en ratones, lo cual es casi el doble del número que se obtiene utilizando (es decir, de alta energía) convencional fluoroscopios. Se espera que la identificación de los parámetros de golondrina adicionales como optimizamos las capacidades de este nuevo sistema. Resultados hasta ahora demuestran la utilidad de usar un sistema de fluoroscopia de baja energía para detectar y cuantificar los cambios sutiles en la fisiología golondrina que de otro modo puede pasarse por alto cuando se utiliza fluoroscópios de alta energía para investigar modelos de enfermedad murinos.

Introducción

La disfagia (deglución deterioro) es un síntoma común de numerosas condiciones médicas que afectan a personas de todas las edades. Los ejemplos incluyen accidente cerebrovascular, enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer, parálisis cerebral, distrofia muscular, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la enfermedad de Batten, cáncer de cabeza y cuello, el nacimiento prematuro y el envejecimiento avanzado. La disfagia está altamente correlacionado con la mortalidad, por lo general como consecuencia de la desnutrición grave o neumonía que se desarrolla cuando-bacterial cargados de alimentos / líquido / saliva se aspira en los pulmones ^1-4. Esta dolencia debilitante y potencialmente mortal afecta a más de 15 millones de personas cada año en los Estados Unidos solamente ^3. A pesar de la alta prevalencia y los resultados negativos asociados, las opciones actuales de tratamiento para la disfagia se limitan a paliativos (en vez de curativo) enfoques, tales como modificación de la dieta (por ejemplo, evitar consistencias de alimentos / líquidos específicos), cambios posturales (por ejemplo, tucking de la barbilla al tragar), los enfoques de motor (por ejemplo, ejercicios que apuntan los músculos en la cavidad oral, la faringe y la laringe), los enfoques sensoriales (por ejemplo, el sabor de aplicación, temperatura, y / o la estimulación mecánica), y el tubo de alimentación (por ejemplo, nutrición e hidratación administrada vía nasogástrica (NG) sonda o gastrostomía endoscópica percutánea (PEG) de tubo). Estos tratamientos sólo sirven como tratamiento sintomático y no se abordan las causas subyacentes del problema. De hecho, una barrera importante para el descubrimiento de nuevos tratamientos eficaces, para la disfagia es el conocimiento científico limitado de los mecanismos patológicos responsables, que probablemente diferente para cada enfermedad.

La disfagia diagnóstico se realiza predominantemente mediante un procedimiento radiográfico llamado videofluoroscópico tragar estudio (VFSS), también conocido como un estudio de trago de bario modificado. En los últimos más de 30 años, esta prueba de diagnóstico ha sido considerado como el estándar de oro para evaluating función golondrina ^5-7. Esta prueba implica que el paciente sentado o de pie dentro de la trayectoria del haz de rayos X de una máquina de fluoroscopia mientras voluntariamente la ingestión de alimentos y consistencias líquido mezclado con un agente de contraste oral, típicamente sulfato de bario ^8,9 o iohexol ^10. A medida que el paciente traga, los alimentos y líquidos que contienen agente de contraste se puede ver en tiempo real a través de un monitor de ordenador durante el viaje desde la boca hasta el estómago. Estructuras de los tejidos blandos también son visibles y pueden ser evaluados en relación a la estructura y función. Se les pide a los pacientes para llevar a cabo varios tragos de cada comida y consistencia líquida, todos los cuales son de vídeo grabado para su posterior visualización y análisis cuadro por cuadro para cuantificar la presencia y grado de disfagia. Numerosos componentes fisiológicos de la deglución son típicamente analizadas, como el punto de disparo anatómica de la deglución faríngea, bolo tiempo de tránsito a través de la faringe y el esófago, el alcance y la duración de Laryngeal elevación, la ubicación y cantidad de residuos post-deglución, y la aparición de y la razón fisiológica para la aspiración ^7,11.

Aspectos del protocolo VFSS humana fueron adaptadas recientemente para el estudio de ratas libremente comportan; Sin embargo, los resultados fueron limitados debido a las ratas no se quedaron en el campo videofluoroscópico de vista durante la prueba ^12. VFSS no ha sido previamente tratado con ratones. Éxito de la adaptación del protocolo VFSS humana para su uso con ratones y ratas proporcionaría un método de investigación novedosa para investigar los cientos de modelos de enfermedades que se sabe que causan disfagia en los seres humanos murino actualmente existente (ratón y rata). Este nuevo método (en adelante, VFSS murina) sería, por tanto, acelerar la identificación y validación de modelos murinos de disfagia que son adecuados para la investigación de los mecanismos neurofisiológicos subyacentes en el tejido músculos, los nervios y el cerebro que son patológicos y contribuyendo a la disfagia in seres humanos. Por otra parte, murino VFSS permitiría la identificación de medidas objetivas (biomarcadores) de la función golondrina / disfunción que pueda compararse directamente con los seres humanos. Estas especies cruzadas biomarcadores videofluoroscópicas podrían luego servir medidas de resultado como nuevos para cuantificar la eficacia del tratamiento en los ensayos preclínicos con ratones y ratas, que sería mejor traducir a los ensayos clínicos con personas.

Para este fin, el protocolo VFSS murino se estableció utilizando ~ 100 ratones de ambos sexos. Todos los ratones eran o C57 o híbridos cepas C57 / SJL. Los ratones C57 no fueron alterados genéticamente, mientras que C57 / SJL fue la cepa de fondo para una colonia de ratones transgénicos SOD1-G93A (o SOD1), el modelo animal más utilizado de la ELA. La colonia SOD1 fue un aproximado de 50-50 mezcla de transgénicos (es decir, los afectados por ELA) ratones y las camadas no transgénicas (es decir, no afectados).

El protocolo VFSS murino consta de tres componentes:

1. cámaras de observación de diseño personalizado que permiten la alimentación voluntaria y tragar mientras está de pie sin restricciones en un espacio confinado dentro de una máquina de fluoroscopia,
2. Recetas que enmascaran el sabor aversivo / olor de agentes de contraste oral y producen radiodensidad suficiente para permitir la visualización adecuada de la deglución,
3. Un protocolo paso a paso de la prueba que maximiza el cumplimiento animal, minimiza el tiempo total de la prueba y la exposición a la radiación, y permite la cuantificación de varios parámetros de tragar para cada etapa de tragar (es decir, oral, faríngea y esofágica).

El efecto combinado produce un bajo estrés, ambiente cómodo, de autoalimentación examen que permite la evaluación de la alimentación típica y tragar comportamientos de los ratones.

Protocolo

El protocolo VFSS murino sigue un protocolo y directrices del NIH aprobado Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC).

1. Cámaras de observación Construct de Tubería del policarbonato y Láminas (Figura 1)

1. Cortar 5 cm de ancho, tubo de policarbonato cuadrado (~ 2 mm de espesor de pared) en 16 cm de longitud utilizando una fresadora manual. La mayoría de los ratones se ajustan adecuadamente a estas dimensiones, lo que resulta en una cámara de pruebas estrecha que permita caminar y dar la vuelta si lo deseas. Un espesor de pared de ~ 2 mm proporciona una rigidez adecuada sin atenuar significativamente el haz de rayos X.
   1. Hay dos tipos de cámaras son esenciales para este protocolo: "tubos caño", diseñados para la entrega de líquidos a través de pico, y los "tubos de ventilación", diseñados para la entrega de líquidos a través de peg-bol.
      1. Para los "tubos de caño", hacer un pequeño agujero oblongo (12 x 8 mm) en la parte superior de cada tubo cerca de un extremo mediante un mach fresado manual deine. Este agujero se utiliza para ofrecer soluciones de agua potable a través de una boquilla de tubo para sorber durante el condicionamiento conductual y pruebas VFSS.
      2. Para los "tubos de ventilación", taladro 9 pequeños agujeros de ventilación en la parte superior de cada tubo cerca de un extremo. Este tubo se utiliza durante la prueba VFSS con un cuenco de paridad en lugar de tubo para sorber.
      3. Es posible utilizar tubos caño cuando la entrega de líquido a través de peg-bol; sin embargo, la abertura en el techo de la cámara debe ser bloqueado para evitar conductas de exploración de distracción por los ratones (véase la etapa 6.2.2).
2. Corte láminas de policarbonato (3/4 "de espesor) en tapas finales (50 x 50 mm, 2 por tubo) utilizando una fresadora computarizada, también llamado un control numérico (CNC) de la máquina informatizada.
   1. Molino de una ranura oblonga (19 x 6 mm) cerca de un borde de la cara interior de cada extremo-cap. Utilice esta ranura para asegurar un cuenco de clavija para los ratones a beber durante las pruebas de VFSS.
   2. Mill 5 orificios de ventilación redondas (diámetro 6 mm) A través de cada tapa de extremo.
   3. Molino de un agujero más pequeño redonda (5 mm de diámetro) a través de la tapa de extremo, directamente encima de la ranura oblonga. Utilice este orificio para suministrar líquido a la peg-bol durante las pruebas VFSS.
   4. En la cara exterior de la tapa posterior, molino de un 9/16 "de diámetro escariado que es 1/4" de profundidad alrededor de este agujero más pequeño.
   5. Molino de distancia 2 mm a lo largo del perímetro de la cara interior de la tapa de extremo hasta una profundidad de 7 mm para hacer un paso que se inserta fácilmente en el extremo del tubo.
   6. Molino de una ranura 1 mm en el paso de la tapa de extremo para alojar una junta tórica, que es necesaria para evitar que el tapón terminal de caer fuera del extremo del tubo.
   7. Redondear los bordes expuestos y biselar todas las esquinas de las tapas laterales para evitar la masticación por los ratones.
3. Haga peg-tazones de láminas de policarbonato utilizando una máquina CNC. Dimensiones totales deben ser de 24 x 19 x 6 mm ^3, con un plato en forma de depresión de 10 x 3 mm ² en un extremo. Una clavija-bol es needed para cada tubo. PEG-cuencos deben insertar perfectamente en la ranura oblonga en las tapas laterales (Figura 2).

Figura 1:. Observación Cámaras cámaras de observación fueron diseñados para mantener los animales comportarse libremente en el campo de la fluoroscopia de vista. Estas imágenes muestran componentes de la cámara esenciales para la realización de VFSS. Top: "tubo de suministro", diseñado para la entrega de líquidos a través del surtidor. En pocas palabras: "tubo de ventilación", diseñado para la entrega de líquidos a través de peg-bol. Las dos tapas laterales son intercambiables entre los tubos y caño de ventilación.

Figura 2:. PEG-tazones Cada tazón clavija encaja en una ranura en la cara interior de cada extremo-cap. Izquierda:componentes sin ensamblar. Media: ensamblado componentes. Derecha:. La cara exterior del tapón terminal Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Construir Botellas tubo para sorber de Tubos de centrífuga, tapones de silicona, y los canalones metálicos (Figura 3)

1. Utilice una broca del tapón (5/16 ") para hacer un agujero central a través de cada tapón de silicona.
2. Aplicar unas gotas de aceite mineral en el orificio e inserte manualmente un grifo de metal en el extremo ancho del tapón. Se prefieren los canalones de punta de bola rectas porque los canalones de extremo abierto rectas resultan en fugas excesivas y salpicaduras del agente de contraste dentro de la cámara de observación, que puede interferir con la visualización durante la prueba.
3. Ajustar la longitud del surtidor de manera que abarca toda la longitud del tapón de silicona y se extiende aproximadamente 3 cm más allá del extremo ancho del tapón.
4. Insertar el extremo estrecho de cada tapón (que contiene un tubo para sorber) en un tubo de centrífuga de 30 ml.
5. Compruebe que la longitud del surtidor es adecuada mediante la inserción a través del agujero oblongo en la parte superior de la cámara de observación. La punta del surtidor debe descansar aproximadamente 1 cm del techo de la cámara, que es lo suficientemente largo para los ratones adultos sanos para llegar.
   NOTA: Longer longitudes resultan en ratones potable mientras se enciende / inclinación de la cabeza, lo que oscurece la visualización de deglutir durante VFSS.
6. Extender la longitud del surtidor para dar cabida a los ratones más jóvenes, las cepas de ratón de tamaño más pequeño, y modelos de enfermedad ratón que no pueden alcanzar el pico debido a la deficiencia motora de las extremidades.
7. Lave los caños recién hechas antes de su uso para eliminar el aceite mineral, restos de silicona, y otros contaminantes durante la manipulación.

Figura 3: Sipper. Tubo Botellas Izquierda: componentes sin ensamblar. Media: ensamblado componentes. Derecha:. Beber ratón de tubo para sorber en cámara de observación Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Construir un sistema de entrega de jeringa para uso con PEG-cuencos (Figura 4)

1. Utilice un torno para hacer adaptadores para la conexión de la tubería de polietileno (PE) para las finales tapas de cámara de observación, describió de la siguiente manera.
   1. Cortar 1/2 "de diámetro material de la barra de resina acetal en 1 1/4" secciones de longitud, en lo sucesivo denominadas adaptadores de tubo (o adaptadores).
   2. En un extremo de cada adaptador, reducir una "sección de longitud en la punta para 3/16" 1/2 de diámetro, a que se refiere el presente documento como el extremo estrecho.
   3. Para el 3/4 "sección de longitud de cada adaptador (es decir, el medio" restante extremo de diámetro), ranuras de la máquina para el agarre manual durante nosotrose. En este apartado se hace referencia en este documento como el extremo ancho.
   4. En el extremo ancho de cada adaptador, perforar un agujero central que es 0,098 "de diámetro y 1" de profundidad.
   5. Taladro y resma la porción restante del agujero central de cada adaptador de 0.096 "para proporcionar un mejor ajuste en el tubo de PE.  
2. Cortar tubo de PE (PE 240, diámetro interior 1,67 mm) a la longitud deseada utilizando una tijera. Una longitud de 3-4 pies aumenta suficientemente la distancia entre el investigador y el fluoroscopio durante las pruebas VFSS para mejorar la seguridad de radiación.
   NOTA: Longer longitudes utilizarán un mayor volumen de la solución de agente de contraste durante la prueba VFSS, quizás mayor que el estándar de receta 30 ml.
3. Insertar un 15 G aguja de punta roma plenamente en un extremo de la tubería de PE. El ajuste debe ser ajustado.
4. Introduzca el otro extremo (libre) de la tubería de PE a través del orificio central del tubo adaptador, a partir de tque el extremo ancho.
5. Tirar de la tubería de PE fuera del extremo estrecho del adaptador de modo que se extiende ~ 2 mm.
6. Insertar el extremo estrecho del adaptador (con tubo de PE ~ 2 mm que se extiende desde ella) en la tapa de extremo de un tubo de observación; que debe encajar perfectamente en el agujero escariado situado justo encima de la clavija-bol.
7. Ajuste la longitud de la tubería de PE en el extremo estrecho del adaptador de modo que apenas se extiende por encima de la depresión tazón en el peg-bol.
8. Llenar una jeringa de 10 ml (sin aguja unida) con agua de un vaso de precipitados y eliminar las burbujas de aire.
9. Conecte la jeringa llena hasta el extremo de la aguja de la tubería de PE.
10. Empuje lentamente el émbolo de la jeringa para suministrar agua a la peg-bol en la cámara de observación. Pare cuando el peg-bol está casi llena. Evite el llenado excesivo, lo que hará que las salpicaduras durante potable.
11. Si la clavija-bol no se llena correctamente, ajuste la longitud de la tubería de PE que se extiende por encima de la clavija-bol.
12. El exceso de extensión del PEtubería será atraer ratones para masticar en él durante las pruebas, en lugar de beber de la peg-bol.
13. Si el tubo de PE no se extiende lo suficientemente lejos, el líquido se ejecutará en el suelo de la cámara de observación en lugar de llenar el PEG-tazón.
14. Después de su uso, retire la jeringa y lavar todo el sistema de entrega de la jeringa con agua y jabón. Utilice una jeringa de 10 ml para empujar el aire a través del tubo de PE para eliminar el agua. Esterilizar en autoclave según sea necesario.

Figura 4:. Jeringa Sistema de entrega de la izquierda: componentes sin ensamblar. Media: ensamblado componentes. Derecha:. Beber ratón de peg-bol en la cámara de observación Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Construir una Sciss motorizadoo elevación de la tabla de posicionamiento remoto de la cámara de observación (Figura 5)

1. Construir una plataforma de tijeras con una plataforma cm 12 x 12 que puede subir y bajar por 5 cm para dar cabida a los ratones de visualización en distintas posiciones dentro del campo de la fluoroscopia de vista. Material de elevación debe ser de metal o de plástico para facilitar su limpieza con desinfectantes.
2. Motores paso a paso de montaje para ajustar la altura y posición longitudinal del ascensor.
3. Pareja el primer motor paso a paso con el mecanismo elevador de tijera para controlar la altura de la traducción de un travesaño. Este acoplamiento puede ser un tornillo o de cremallera y piñón de engranaje de plomo.
4. Acoplar el segundo motor paso a paso en el bastidor elevador de tijera para controlar la posición longitudinal mediante la traducción de todo el bastidor de elevación respecto a la mesa. Este acoplamiento puede ser un tornillo o de cremallera y piñón de engranaje de plomo.
5. Conectar un sistema de control remoto a los motores paso a paso para permitir el ajuste de la posición de cámara de observación durante la formación de imágenes y reducir al mínimo Investigator exposición a la radiación.
6. Interfaz de mano botones de control remoto con un chip microcontrolador para controlar la activación y la dirección de cada motor paso a paso.

Figura 5:. Mesa elevadora de tijera con mando a distancia Izquierda: vista lateral de la mesa elevadora de tijera. Derecha: mesa elevadora con cámara de observación situado en fluoroscopio. La mesa elevadora se ajusta la posición de la cámara de observación para mantener los ratones en el campo de visión. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

5. Realice Acondicionamiento del Comportamiento antes de la prueba VFSS para asegurar la participación máxima

1. 1-2 semanas antes de VFSS pruebas, los ratones sometidos a una noche a la mañana (16.12 h) Período de regulación del agua para inducirsed, durante el cual, el agua es retenida de la jaula. El objetivo de la regulación del agua es para los animales a tener sed, no deshidratarse. Los animales deben permanecer alerta y receptivo. Este marco de la duración y el tiempo es esencial para prevenir la deshidratación, que puede ocurrir como resultado de episodios de regulación 2 de agua dentro de 1 semana (es decir, uno para el acondicionamiento de comportamiento y otro para las pruebas de VFSS).
2. Coloque un único "tubo de suministro" (con un extremo cerrado por un tapón terminal) en el suelo de una jaula que contiene material de cama fresca. El extremo cerrado debe ser más cercana a la abertura de salida en el techo de la cámara. Este paso asegura una ventilación adecuada, mientras que el sueño ratones múltiple acurrucado dentro de la profundidad de la cámara durante la noche. El extremo abierto permite que los ratones entren libremente / salen de la cámara.
3. Retire otro material de enriquecimiento (por ejemplo, nestlet y caseta) para fomentar los ratones para explorar y dormir en la cámara durante la noche (Figura 6). Este paso asegura que los ratonesestán aclimatadas a estar en la cámara para largas duraciones antes del ensayo VFSS.
4. Proporcionar una sola bola de comida estándar por ratón en el suelo de la jaula para comer durante la noche; no proporcionan agua o de otras fuentes de hidratación.
5. Utilice una tapa de filtro estándar para contener los ratones en la jaula durante la noche, como las dimensiones de la cámara de observación impiden una tapa de alambre estándar de montaje en la jaula. Almacenar la tapa retirada de alambre (que contiene la alimentación y la botella de agua) en la parte superior de la parte superior del filtro a pesar abajo la tapa y evitar que los ratones escapen.
6. Realizar palatabilidad probar la mañana siguiente, se describe como sigue.
   1. Hacer una solución de prueba con sabor a chocolate en una botella de 30 ml tubo para sorber, sin añadir agente de contraste (es decir, agua sustituto de iohexol). Esta receta se describe en la Tabla 1. Haz una botella por jaula para ser probado.
   2. Retire la cámara de observación y reemplazar la tapa de cableado estándar. Ofrecer el chocolate con saborsolución (temperatura ambiente, ~ 22 ° C) durante 2 min por jaula, insertado a través de la tapa de alambre.
   3. Evaluar palatabilidad observando comportamientos con la bebida durante el período de prueba de 2 min.
   4. Puntuación palatabilidad de acuerdo con los siguientes criterios:
      1. Latencia hasta que las primeras bebidas ratón en el surtidor durante al menos 5 segundos sin interrupción.
      2. Porcentaje de ratones por jaula que beben la solución.
      3. Número de ratones que beben simultáneamente en el surtidor.
   5. La solución se considera aceptable si la mayoría de los ratones en cada jaula tiene múltiples largo (> 5 seg) episodios de beber y si varios ratones beben simultáneamente desde la boquilla (Figura 7).
   6. Si la solución con sabor a chocolate no es aceptable, repetir las pruebas de palatabilidad con otros potenciadores del sabor a diversas concentraciones para identificar una única solución preferida.
   7. Ofrecen hasta cuatro soluciones diferentes (a varias concentraciones) de uno en unoen orden aleatorio a varias jaulas de ratones en un solo día de la prueba, sin un período de lavado o solución de lavado. Sabores potenciadores adecuados a tener en cuenta para los ratones son el azúcar, el queso, la mantequilla de maní, varios sabores de frutas y nueces, y la leche.
      NOTA: No realice la palatabilidad prueba más de una vez por semana para evitar la deshidratación por episodios repetidos de regulación hídrica.
   8. Puede tomar varias semanas para identificar con éxito la solución preferida para cada cepa de ratones. El objetivo es identificar los sabores candidatos que resultan en múltiples larga (> 5 seg) episodios de beber por los ratones de inmediato (<30 segundos) después de la exposición, ya que estas calificaciones se consideran esenciales para la obtención de resultados VFSS exitosas.
7. Después se identifica una solución sabor preferido, volver la cámara de observación para cada jaula de inicio para continuar acondicionado de comportamiento, que se describe como sigue.
   1. Conecte un extremo-cap a la cámara de observación en el extremo más cercano alovalada (caño) agujero.
   2. Presente ratones la solución con sabor a chocolate durante 2-3 hr mediante la inserción de la botella tubo para sorber a través del agujero ovalado en la parte superior de la cámara. Este paso asegura que todos los ratones han sido condicionados a beber profundamente dentro de la cámara de observación.
   3. Retire la tapa de alambre para dar cabida a la cámara de observación.
   4. Coloque 1 bolita de comida por ratón en el suelo de la jaula para el consumo ad libitum durante el periodo de prueba.
   5. Cubrir la jaula con una tapa de filtro estándar para evitar que los ratones escapen durante el resto del período de acondicionamiento de comportamiento. Almacenar la tapa retirada de alambre (que contiene la alimentación y la botella de agua) en la parte superior de la parte superior del filtro a pesar abajo la tapa.
8. Proporcionar agua y comida ad libitum en la jaula cuando se completa el condicionamiento conductual.
9. Lave las cámaras de observación (tubos y tapas finales) y botellas de tubo succionador (caños y tubos de centrifugación) con agua y jabón; esterilizar en autoclave según sea necesario. Evitarutilizando acetona para limpiar los tubos, ya que provoca un efecto de enturbiamiento permanente que hace que el tubo opaco en lugar de translúcida.

Figura 6:. Ratones Exploración de Observación Cámaras ratones son naturalmente inclinados a buscar refugio en espacios pequeños. Como resultado de ello, entran libremente y explorar el tubo de observación cuando se coloca en la jaula hogar. La mayoría de los ratones se encuentran durmiendo en la cámara de la mañana. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

INGREDIENTES	Solución de chocolate (para Pruebas palatabilidad)	Con sabor a chocolate Iohexol (para Pruebas VFSS)
jarabe de chocolate	3 ml	3 ml
Iohexol (350 mg de yodo / ml)	0 ml	15 ml
Agua (DI o filtrada)	Ajuste a 30 ml de volumen final (27 ml)	Ajuste a 30 ml de volumen final (12 ml)
Volumen final	30 ml	30 ml

Tabla 1: Chocolate con sabor a la solución de ensayo Preferido por C57 y C57 / SJL mouse cepas.

Figura 7:. Pruebas de palatabilidad Un indicador de preferencia de sabor durante la prueba de palatabilidad es el número de ratones que beben simultáneamente desde un único pico en la jaula hogar. Esta imagen muestra cuatro ratones potable simultáneamente una solución con sabor a chocolate, que se identificó como elpotenciador del sabor preferido por cepas C57 y C57 / SJL.

6. VFSS Preparación de Pruebas

1. Ratones sujeto a un período de regulación del agua durante la noche (es decir, retienen agua durante 12 a 16 horas), tal como se describe en el paso 5 anterior.
   1. Coloque un único "tubo de ventilación" (con un extremo cerrado por un tapón terminal) en el suelo de una jaula que contiene material de cama fresca. El extremo cerrado debe ser más cercana de los orificios de ventilación en el techo de la cámara. Este paso asegura una ventilación adecuada, mientras que el sueño ratones múltiple acurrucado dentro de la profundidad de la cámara durante la noche. El extremo abierto permite que los ratones entren libremente / salen de la cámara.
2. A la mañana siguiente, retire cámaras de observación de las jaulas sucias y enjuagar brevemente con agua del grifo y completamente seco en preparación para las pruebas de VFSS.
   1. Quite y limpie sólo una cámara a la vez para evitar que se mezclen hasta cámaras entre las jaulas, lo que puede causar conductas exploratorias excesivas queinterferir significativamente con las pruebas VFSS.
   2. Si "tubos caño" se utilizan en lugar de los "tubos de ventilación" para las pruebas VFSS, inserte un tapón de silicona en la abertura de salida del techo de la cámara de observación para prevenir conductas de exploración (Figura 8).
   3. Etiqueta de cada cámara (por ejemplo, con el número de jaula) para evitar confusión.
      NOTA: Use un marcador de borrado en seco para etiquetar cada tubo limpiado antes de colocarlo de nuevo en la jaula. Marcador permanente se debe evitar, ya que es absorbida por el material del tubo y no se lava fuera, incluso con alcohol o acetona.
3. Preparar la solución yohexol sabor a chocolate (u otra solución apetecible).
   1. Hacer una sola receta (30 ml) de la solución de ensayo (Tabla 1) durante varias jaulas.
   2. PRECAUCIONES PARA El IOHEXOL: Guarde los frascos sin abrir iohexol a temperatura ambiente, protegido de la luz. Uso abrió botellas iohexol en 24hr, como la viscosidad y sabor pueden cambiar dentro de un día o dos después de la exposición al aire. Alternativamente, congelar alícuotas de-porciones individuales (15 ml) en tubos de centrífuga para el almacenamiento a largo plazo. Soluciones de prueba iohexol preparados deben utilizarse dentro de un par de horas para garantizar la frescura y evitar la evasión por los ratones. Administrar soluciones iohexol a temperatura ambiente para evitar la confusión del estudio debido a los efectos de la temperatura en función de golondrina. No congele cualquier solución de ensayo preparada restante, como el sabor del chocolate se vuelve amarga con la congelación y los resultados en la evitación de los ratones.
4. Preparar el entorno fluoroscopia.
   1. Utilice un repuesto cámara de observación (vacío) y peg-bol (o caño tubo para sorber) para determinar la altura óptima y la posición dentro del haz fluoroscopio que permite la visualización de beber en el plano lateral (horizontal).
   2. Ajuste la velocidad de fotogramas de fluoroscopia a 30 fotogramas por segundo; más altos (pero no inferior) velocidades de cuadro se pueden usar si está disponible.
   3. Esegurar que un marcador de calibración radiopaco se coloca apropiadamente en la cámara fluoroscopio / detector de modo que sea visible en el monitor de visualización durante toda la prueba. Este paso es necesario para permitir la calibración de las mediciones de longitud se utilizan para cuantificar parámetros de golondrina.

Figura 8:. Cuando silicona Plug utilizando PEG-Bowls Izquierda: tapón de silicona. Derecha: Un tapón de silicona se tira a través de la abertura del tubo succionador en la parte superior de la cámara de observación. Este plug impide a los ratones se distraiga por la abertura de salida cuando se utiliza un tazón clavija en lugar de tubo para sorber durante las pruebas VFSS. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

7. Las pruebas VFSS de ratones

1. Observe cada jaula para identificar cuando un ratón entra libremente la cámara de observación.
   1. Levante la cámara fuera de la jaula y suavemente conecte el extremo-cap ^2º (con peg-bol adjunto, si no va a utilizar un tubo para sorber), teniendo cuidado de no pellizcar el ratón (especialmente la cola).
      NOTA: Este método minimiza la respuesta de estrés del ratón debido a la manipulación, que es especialmente importante para los ratones que se están probando por primera vez.
   2. Con repetidas pruebas, los ratones pueden ser fácilmente persuadidas a entrar en la cámara cuando se coloca delante de ellos dentro de la jaula, o cuando suspendido por la cola sobre la abertura de la cámara.
2. Coloque la cámara de observación (que contiene el ratón) dentro de la máquina fluoroscopia para comenzar la prueba VFSS en el plano lateral (es decir, haz horizontal de rayos X).
3. Proporcionar la solución yohexol sabor a chocolate (Tabla 1) a través de peg-bol o botella tubo para sorber.
   1. Si está usando un tazón peg, Ofrecer la solución a través del sistema de entrega de la jeringa se describe en el paso 3 anterior. Este sistema permite la recarga rápida y fácil de la peg-bol, según sea necesario.
   2. Si se utiliza una botella tubo para sorber, inserte el tubo para sorber a través de la abertura ovalada en la parte superior de la cámara de observación. Incline la botella para que la boquilla se dirige hacia el centro de la cámara.
4. Inicie la grabación videofluoroscopia cuando el ratón comienza a beber.
   1. Ajustar la posición de la cámara de observación (usando la mesa elevadora de tijera de control remoto se describe en el Paso 4), de modo que el mecanismo de la deglución es visible en el campo de visión.
   2. Pausa en la grabación cada vez que el ratón se aleja de la peg-bol o boquilla para reducir al mínimo la duración de la exposición a la radiación.
   3. Reanudar la grabación cuando el ratón se vuelve al surtidor o peg-bol.
   4. Vuelva a llenar el peg-bol, según sea necesario.
   5. Deje de probar si el ratón no bebe dentro de 5 min. El objetivo es registrar varios long (> 5 seg) episodios de beber continua, que es típico para la mayoría de los ratones dentro de la primera 2 min de la prueba.
   6. Volver ratones no cumplen las normas de la jaula de alojamiento (sin agua) para volver a las pruebas en un momento más tarde el mismo día; no sobrepasar un período de regulación del agua las 24 horas. Los ratones que permanecen no cumplen las normas para los tres ensayos se retiran del estudio.
5. Si es necesario, cambiar la posición del fluoroscopio para poner a prueba los ratones en el plano dorsal-ventral (es decir, el haz de rayos X vertical). Este plano se utiliza para identificar las desviaciones en el flujo de bolo a través de la faringe y el esófago durante la deglución.
6. Al probar varios ratones de la misma jaula:
   1. Limpie el tazón peg (y la punta de la tubería de PE) o caño tubo para sorber con una toalla de papel seca entre los ratones.
   2. Limpie la cámara de observación, según sea necesario entre los ratones para eliminar cualquier yohexol salpicada en las paredes de la cámara. Enjuague la cámara con agua del grifo y secar con una toalla de papel.
7. Al probar ratones froma diferente jaula:
   1. Use un nuevo peg-bol (o cambiar el tubo de suministro de sorber). De lo contrario, los ratones pueden ser distraídos por el olor de otros ratones que bebieron de la misma peg-bol o tubo para sorber. PEG-cuencos y tubos sipper deben ser etiquetados para evitar confusiones.
8. Cuando se haya completado la prueba de todos los ratones en una jaula individual, proporcionar agua y alimentos en la jaula.
9. Lave las cámaras de observación (tubos y tapas finales), PEG-cuencos, sistema de suministro de jeringas y botellas de tubo succionador (caños y tubos de centrífuga, si los utiliza) con agua y jabón; esterilizar en autoclave según sea necesario.
10. Deseche cualquier solución yohexol restante según las indicaciones de las normas de seguridad; disposición de drenaje puede ser aceptable en la mayoría de las instalaciones.

8. Análisis de vídeo

1. Utilice un programa de software de edición de vídeo que permite el análisis fotograma a fotograma de las grabaciones videofluoroscopía para cuantificar los parámetros de golondrina de interés (Tabla 2).
2. Identificar al menos dos revisores capacitados para analizar cada video de una manera ciega: Un revisor principal y uno o dos revisores secundarias.
   1. Revisor primario: Ver cada vídeo para identificar y analizar 3-5 largos (aproximadamente 5 segundos) borracheras. Este criterio se basa en estudios de golondrina no radiográficos publicados con ratones ^13,14 y VFSS con ratas muestran que ¹² 3-5 medidas por parámetro golondrina son suficientes para los análisis estadísticos.
   2. Los colaboradores secundarios: analizar de forma independiente los 3-5 medidas por parámetro trago para cada ratón que inicialmente fueron identificados y analizados por el revisor principal.
3. Identificar las discrepancias de los viajeros para cada ratón. Vuelva a analizar todas las discrepancias, como grupo revisor para alcanzar el 100% de consenso.
4. Promedio de los valores 3-5 consenso (es decir, indiscutibles) para cada tragan parámetro para obtener el valor medio de cada ratón para su uso en los análisis estadísticos. Cuando menos de 3 measurES se obtienen de un solo parámetro trago para un ratón dado, introducir un valor que falta (es decir, no cero) en la base de datos estadísticos para el parámetro golondrina correspondiente.

PARÁMETROS TRAGO	DESCRIPCIÓN
Inter-Swallow Intervalo (ISI)	El número de cuadros de video entre dos, golondrinas sin interrupciones sucesivas. El fotograma inicial para calcular ISI es el "sistema de reposo" que precede inmediatamente a la transferencia visible del bolo de la valléculas al esófago. El bastidor del extremo es el "sistema de reposo" del próximo trago. El número de fotogramas entre los dos golondrinas sucesivas se divide por 30 cuadros por segundo (fps) para convertir a tiempo (seg).
Mandíbula Excursión Rate (Tasa Lick Equivalente)	La lengua no es claravisible durante VFSS para permitir la cuantificación de la tasa de lamer; Sin embargo, la tasa de excursión de la mandíbula es fácilmente cuantificable. Durante lamiendo, la mandíbula debe abrir para permitir que la lengua para sobresalir de la boca. Por lo tanto, el número de la mandíbula de apertura / cierre (excursión) ciclos por segundo (30 cuadros), mientras que beber es equivalente a lamer tasa. Cada ciclo comienza con la mandíbula excursión de la mandíbula máximamente abierto (que coincide con protrusión de la lengua) y termina cuando la mandíbula vuelve a la posición abierta al máximo. Ciclos subsecuentes de la clausura de la mandíbula y reapertura se cuentan como episodios de excursión mandíbula individual.
Mandíbula Excursión Distancia	La distancia de la mandíbula se abre durante los ciclos de excursiones mandibulares, medida en mm entre los incisivos superiores e inferiores.
Relación de Lick-Swallow	El número de ciclos de excursión de la mandíbula que se producen durante cada ISI (es decir, entre dos, golondrinas ininterrumpidas sucesivas).
Swallow Rate	El número de golondrinas que ocurren durante cada episodio 2 seg de beber sin interrupción en el surtidor.
El tiempo de tránsito faríngeo (PTT)	El tiempo que tarda el bolo a tragarse a través de la faringe. El cuadro inicial es idéntico al cuadro de inicio ISI (es decir, el "sistema de reposo" que precede inmediatamente a la transferencia visible del bolo de la valléculas). El bastidor del extremo es cuando la cola del bolo ha pasado completamente la vértebra 2 nd cervical (C2), que es el punto de referencia anatómica más obvia en la columna cervical del ratón. El número de fotogramas entre los fotogramas inicial y final se divide por 30 fps y se convierte en milisegundos (ms).
Velocidad bolo a través de la faringe	Faríngea velocidad de bolo se mide en relación con PTT (descrito anteriormente). El uso de software ImageJ, se mide la distancia (mm) de la valléculas a la vértebra C2, escala usando un marcador de calibración. Este distance (mm) se divide entonces por PTT (ms) para determinar la velocidad de bolo (mm / ms).
El tiempo de tránsito esofágico (ETT)	El fotograma de inicio ETT es idéntica a la estructura final PTT (descrito anteriormente). El bastidor del extremo ETT es cuando el bolo ha entrado completamente el estómago, que se define como la desaparición del bolo desde el esófago. El número de fotogramas entre los fotogramas de inicio y fin ETT se divide por 30 fps y se convierte en ms.
Velocidad bolo a través de Esófago	Velocidad de bolo esofágico se mide en relación con ETT (descrito anteriormente). El uso de software ImageJ, la distancia (mm) medida es de la vértebra C2 a la unión gastroesofágica, escalada utilizando marcador de calibración. Esta distancia (mm) se divide entonces por ETT (ms) para determinar la velocidad de bolo (mm / ms).
Bolo de velocidad a través de la faringe y el esófago	Este parámetro se utiliza cuando C2 no es un punto de referencia anatómico fácilmente visible; Por lo tanto,no es posible distinguir entre la faringe y del esófago etapas de la deglución. En tales casos, la velocidad de bolo a través de la faringe y la laringe se combina en un solo parámetro golondrina. El cuadro inicial es idéntico al cuadro de inicio PTT (es decir, el "sistema de reposo" que precede inmediatamente a la transferencia visible del bolo de la valléculas). El bastidor del extremo es idéntico al bastidor del extremo ETT (es decir, cuando el bolo ha entrado completamente el estómago). El número de fotogramas entre estos dos eventos se divide por 30 fps y se convierte en ms.
Bolo Area	El uso de software ImageJ, área de bolo se mide en el "sistema de reposo" vallecular antes de la iniciación de golondrina faríngea, escaló utilizando un marcador de calibración.
Faríngea Residuos Zona	Área residuo faríngeo se mide utilizando el software ImageJ, escaló utilizando un marcador de calibración.
Volumen de Ser Liquidmed	El volumen de líquido consumido de una botella de tubo para sorber es difícil de estimar debido a fugas de la boquilla. Sin embargo, el volumen de líquido consumido desde un cuenco de PEG se puede calcular con más precisión como sigue: 1) determinar la densidad (es decir, la relación de peso a volumen) del volumen calibrado de líquido que se administró en el PEG-cuenco, 2 ) determinar el peso de la PEG-cuenco que contiene el líquido residual, 3) introducir estos valores en un peso al convertidor de volumen (por ejemplo, http://www.thecalculatorsite.com/conversions/weighttovolume.php .

Tabla 2: Trago parámetros cuantificables Durante murino VFSS.

Resultados

Hemos diseñado con éxito un novedoso y protocolo VFSS-murino específico replicable que incluye cámaras de prueba que permiten la auto-alimentación, recetas para dar sabor a los agentes de contraste por vía oral, y un protocolo de paso a paso de la prueba que permite la cuantificación de la fisiología golondrina. La capacidad de nivel de energía del sistema de fluoroscopia determinó que tragan parámetros podrían ser investigados en ratones. Inicialmente se utilizó fluoroscopios alta energía diseñados para su uso con las personas y los animales más grandes (por ejemplo, GE Advantx, GE OEC 9600, y Omega cardiaco de la catedral CS-25, cada uno a 30 fotogramas por segundo). Sin embargo, estos sistemas tenían capacidades de aumento insuficientes para los ratones de prueba, lo que resultó en el llenado de los animales sólo una pequeña porción del campo de visión (Figura 9). Como resultado, la calidad de imagen era excepcionalmente pobre, lo que hace que sea imposible visualizar la mayoría de las estructuras del mecanismo de deglución. A pesar de esta limitación, se identificaron 7 objetivo VFSS tragar parámetros que eran consistentemente cuantificable para los ratones cuando se utiliza un fluoroscopio convencional (es decir, alta energía) en combinación con el nuevo protocolo VFSS murino (Tabla 3). Además, hemos identificado el espacio vallecular como el punto de disparo anatómico para tragar en ratones adultos sanos (3-17 meses de edad), así como los ratones con las condiciones de edad avanzada (> 18 meses) y ALS en fase terminal.

Figura 9:. Altos sistemas de fluoroscopia Energía Izquierda: imagen representativa de un ratón obtenido utilizando alta energía (es decir, los convencionales) sistemas de fluoroscopia. Tenga en cuenta que el ratón se llena sólo una pequeña porción del campo de fluoroscopia de vista, lo que demuestra la capacidad de aumento insuficiente de fluoroscópios convencionales para roedores de imagen. Derecha: La misma imagen ampliada post-capture usando un programa de software de edición de vídeo. Flecha Negro: tragar punto de disparo (valléculas). Flecha blanca:. Bolo en el esófago distal, inmediatamente antes de pasar a través de la unión GE (asterisco blanco) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

PARÁMETROS TRAGO	Sistema de Alta Energía	Low Energy System
Inter-Swallow Intervalo (ISI)	X	X
Mandíbula Excursión Rate (Tasa Lick Equivalente)	X	X
Mandíbula Excursión Distancia	X	X
Relación de Lick-Swallow	X	X
Swallow Rate	X	X
PharyngEl tiempo de tránsito eal (PTT)		X
Velocidad bolo a través de la faringe		X
El tiempo de tránsito esofágico (ETT)		X
Velocidad bolo a través de Esófago		X
Bolo de velocidad a través de la faringe y el esófago	X	X
Bolo Area		X
Faríngea Residuos Zona		X
El volumen de líquido consumido	X	X

Tabla 3: Swallow parámetros cuantificables Usando alta Versus Sistemas de fluoroscopia Energía Bajos.

Recientemente hemos obtenido un sistema de fluoroscopia bajo aumento de energía llamado El Labscope (Glenbrook Technologies, Randolph, NJ) que fue diseñado específicamente para nuestro laboratorio para su uso conratones y otros roedores pequeños (Figura 10). Sin embargo, los marcadamente mayores niveles de ampliación de este sistema hicieron imposible para ver todo el mecanismo de la deglución de un ratón en un solo campo de visión. En lugar de ello, se requieren dos posiciones de prueba, como se muestra en la Figura 11. Posición 1 permite la visualización de toda la región de cabeza y torácica proximal. Esta posición es necesaria para evaluar las fases oral y faríngea de la deglución. Posición 2 permite la visualización del punto de disparo golondrina (es decir, valléculas) al gastroesofágico (GE) de conexiones. Esta posición es necesaria para evaluar la etapa esofágica de la deglución. El trabajo preliminar utilizando la Labscope en combinación con el nuevo protocolo VFSS murino ha identificado 13 parámetros golondrina objetivas que son consistentemente cuantificables en ratones, lo cual es casi el doble del número que se obtiene utilizando alta energía fluoroscopios (es decir, convencionales) (Tabla 3). Este o ESULTADO se atribuye a la capacidad de ampliación avanzada de la Labscope, que permite la visualización de numerosas estructuras anatómicas (Figura 12) que eran esencialmente invisibles cuando se utilizan sistemas convencionales: por ejemplo, el hueso hioides, la tráquea y las vértebras cervicales. Como resultado, también pudimos analizar los videos de pruebas de penetración laríngea y aspiración. Tampoco se observó penetración ni aspiración de cualquier ratón en este estudio, independientemente de las condiciones de salud o enfermedad.

Figura 10:. El Labscope Izquierda: El Labscope realiza como un fluoroscopio escritorio para animales pequeños. Derecha: Vista cercana de El Labscope con componentes etiquetados. La mesa elevadora de tijera está posicionando una cámara de observación dentro del campo fluoroscopio de vista. tp_upload / 52319 / 52319fig10highres.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 11: Sistema de fluoroscopia. Low Energy Imágenes de un ratón obtenido mediante un sistema de fluoroscopia de baja energía. Tenga en cuenta que la capacidad de alta magnificación impide la visualización de todo el mecanismo golondrina dentro del campo de vista fluoroscopia. Izquierda: Posición 1 - permite la visualización de toda la cabeza y región torácica proximal. El punto de disparo golondrina (flecha negro) se centra esencialmente en el campo de visión. Derecha: Posición 2 - permisos de visualización desde el punto de disparo golondrina (flecha negro) a la unión GE (asterisco blanco). Nota que el bolo pasa a través del esófago distal (flecha blanca). g11highres.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 12:. Estructuras anatómicas Visible El uso de un sistema de fluoroscopia de baja energía incluso en el ajuste de aumento más bajo (izquierda), las estructuras óseas de la cabeza y el cuello de un ratón son fácilmente visibles utilizando nuestro sistema de fluoroscopia de baja energía (es decir, el Labscope). Se muestran las estructuras anatómicas en el cuadrado negro (y etiquetados) a mayor aumento a la derecha. Mejora de la visualización de las estructuras óseas permite la cuantificación de varios parámetros golondrina adicionales que eran imposibles de analizar el uso de fluoroscopios alta energía. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

t "> Swallow tasa y el intervalo entre golondrina son parámetros VFSS representativas que se pueden cuantificar ya sea utilizando sistemas de bajas o altas de fluoroscopia de energía en combinación con el nuevo protocolo VFSS murino Estos dos parámetros golondrina se cuantificaron por tres grupos de ratones:. SOD1-G93A (SOD1) ratones transgénicos (es decir, un modelo de ELA) en la enfermedad en etapa terminal entre 4-5 meses de edad, los ratones C57 de edad (18 a 24 meses de edad), y un grupo de control de jóvenes sanos (4-8 meses de edad) ratones C57 y camadas no transgénicas de la colonia SOD1. Todos los datos se refieren a pitón para beber solamente, utilizando un sistema de baja o alta fluoroscopia energía. No se encontraron diferencias significativas entre los jóvenes ratones C57 y no transgénicos control) ratones jóvenes (a partir de la SOD1 colonia con respecto a estos dos parámetros golondrina;. Por lo tanto, los datos se combinaron en un general "control" grupo de ratones jóvenes sanos para la comparación con ratones de edad C57 y ratones SOD1 en etapa terminal tasa Swallow (es decir,el número de golondrinas durante 2 segundos consecutivos de beber ininterrumpida) fue significativamente más lento para los ratones SOD1 en comparación con los ratones y los controles de edad C57. Intervalo entre golondrina (es decir, el tiempo entre dos tragos sucesivos) no fue significativamente diferente entre los grupos. Estos hallazgos apoyan la idea de que los perfiles de disfagia es probable que sean claramente diferentes para cada condición de la enfermedad (Figura 13).

Figura 13:. Resultados Preliminares Esta figura muestra los resultados preliminares representativos de dos parámetros golondrina VFSS cuantificados usando el protocolo VFSS murino: tasa (izquierda) y el intervalo entre golondrina (derecha) tragar. Tasa Swallow fue significativamente más lento para los ratones SOD1 en comparación con los ratones y los controles de edad C57. No se identificaron diferencias significativas entre los grupos de inter inter-golondrinaval. Líneas en la parte superior de las barras indican diferencias estadísticamente significativas (p <0,05) entre los grupos, identificados mediante las comparaciones por pares de Bonferroni. Las barras de error representan ± 1 SEM. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Cientos de modelos murino (ratón y rata) están disponibles comercialmente para estudiar enfermedades humanas. Sin embargo, sólo tres modelos murinos de enfermedades se han investigado específicamente en relación con disfagia: un modelo de ratón de la ELA y la rata ^13,14 modelos de la enfermedad de Parkinson ^12,15-17 y accidente cerebrovascular ^18. Cada uno de estos estudios preliminares utilizaron diferentes metodologías para evaluar la disfagia, lo que hace imposible deducir comparaciones significativas entre las especies y enfermedades. Esta importante limitación puede superarse en los estudios futuros utilizando el protocolo VFSS murino de nuevo desarrollo que permite la cuantificación objetiva de numerosos parámetros de golondrina en animales de auto-alimentación.

Resultados VFSS exitosas dependen de tres componentes fundamentales: 1) cámaras de prueba que permiten la auto-alimentación mientras está de pie sin restricciones en un espacio cerrado, 2) recetas que enmascaran el sabor aversivo / olor a la venta en tiendas ag contraste oralpadres, y 3) un protocolo de paso a paso de la prueba que permite la cuantificación de la fisiología golondrina. El efecto combinado produce un bajo estrés, ambiente cómodo, de autoalimentación examen que evoca la alimentación típica y comportamientos para tragar. Eliminación de uno o más de estos componentes tendrá un impacto negativo en los resultados del estudio. Ejemplos de resultados negativos incluyen la incapacidad para mantener los animales en el campo de la fluoroscopia de vista, comportamientos indeseables que lo distraigan de la bebida, la aversión al agente de contraste oral, y la imposibilidad de cuantificar parámetros golondrina debido a episodios de consumo insuficientes.

Un reto importante en la obtención de resultados óptimos VFSS estaba diseñando una cámara de prueba adecuado. Numerosas revisiones del diseño de nuestro prototipo culminaron en una cámara de observación que mantiene suficientemente ratones en el campo de visión y previene comportamientos que distraen de la bebida. Las cámaras se hicieron utilizando fresadoras para obtener dimensiones uniformes de los XXtubos y e-tapas de los extremos, garantizando así la intercambiabilidad de componentes para varias cámaras de observación del mismo diámetro. Las dimensiones interiores (diámetro y longitud) se emparejaron a ser ligeramente más grande que el tamaño del cuerpo de un ratón adulto, lo que resultó en una cámara de prueba suficientemente estrecho que permite caminar en línea recta y darse la vuelta. El diseño estrecho, en combinación con el posicionamiento estratégico de la boquilla y PEG-tazón sólo en el extremo, mantiene la cabeza y el cuerpo de los ratones alineados a lo largo de la longitud de la cámara, mientras que beber. Una vez enganchado en el agua potable, los ratones permanecen notablemente auto-estabilizado en la boquilla o recipiente durante varios segundos a la vez, lo que resulta en un mínimo de artefactos de movimiento para interferir con la prueba. Así, es posible obtener, la observación de cerca / grabación de vídeo sin distorsiones e imágenes videofluoroscópico de los ratones, mientras que beber en los planos laterales y dorsal-ventral.

Ratones (y otros roedores pequeños) son naturalmente inclinados a verk refugio en espacios pequeños. Como resultado, ellos libremente entran en la cámara de prueba (con un extremo ya cerrado por una tapa posterior) cuando se coloca en la jaula de alojamiento, eliminando así el estrés / ansiedad causado por la manipulación (es decir, recoger manualmente el animal para colocarlo en la cámara). Una vez que el ratón entra en la cámara, el otro extremo está cerrado por unir un tapón terminal 2 ^nd. Este diseño evita el escape mientras se crea una cámara de prueba de la ansiedad baja para los ratones para explorar libremente.

La forma cuadrada de la cámara proporciona incorporado en la estabilidad de movimiento que permite que sea utilizado de manera independiente, eliminando así la necesidad de pruebas dentro de una jaula de roedores estándar. Todo el aparato es ligero, portátil, apilable con fines de almacenamiento, resistentes, fáciles de limpiar, y puede esterilizarse en autoclave. Mientras que las cámaras fueron diseñadas inicialmente para su uso con fluoroscopia, también son compatibles con la radiografía lugar de película, de neuroimagen (por ejemplo, MRI, PET, CT), y visual observación / grabación de video de varios comportamientos.

Un segundo gran reto que superar fue enmascarar el sabor aversivo / olor de agentes de contraste por vía oral (es decir, sulfato de bario o iohexol). Teniendo en cuenta que la sensibilidad del gusto varía ampliamente entre las cepas de ratón ^19-21 y tal vez con ^22,23 años de edad, era necesario para identificar una solución de prueba individual que era aceptable para todos los ratones, independientemente de cepa y edad. Este resultado es esencial para permitir comparaciones directas de la función golondrina / disfunción través de las cepas y las edades, mientras que la eliminación de resultados de confusión debido a diferencias en reológico (por ejemplo, viscosidad, densidad, etc.) y las propiedades químicas de las soluciones de ensayo. Con este fin, hemos desarrollado un enfoque de detección simple, palatabilidad rápida para identificar el potenciador del sabor preferido para enmascarar el sabor aversivo / olor de agentes de contraste por vía oral durante VFSS murino. Métodos fueron modelados después de la breve prueba de exposición, lo que requiere una manoometer (es decir, sensor de lamer) para registrar las tasas de lamer durante los primeros 2 minutos después de un período de regulación del agua (es decir, agua durante la noche retención) para inducir la sed ^24,25. A lickometer no estaba disponible para este estudio; Por lo tanto, la preferencia se evaluó mediante observaciones de comportamiento, así como los métodos de grabación de vídeo estándar para la tasa de lamer que han sido validado previamente en nuestro laboratorio de ^13,14. El uso de este enfoque de detección palatabilidad, chocolate fue identificado como el potenciador del sabor preferido por cepas C57 y C57 / SJL. Específicamente, 100% de los ratones en cada jaula bebió fácilmente soluciones con sabor a chocolate dentro de 30 segundos de exposición, con múltiples ratones potable simultáneamente en el surtidor. Sin embargo, la adición de bario dio lugar a sólo borracheras breves por la mayoría de los ratones, independientemente de la concentración de bario o chocolate.

Una alternativa al bario es yohexol, un agente de contraste a base de yodo que sólo recientemente ha sido reconocido como un suitabla alternativa a sulfato de bario para VFSS humano ^10; Por lo tanto, aún no se ha estandarizado para este propósito. Varias concentraciones diferentes de iohexol con sabor de chocolate se les ofreció a los ratones. Recetas que contienen hasta un 50% de solución de stock iohexol (350 mg de yodo por ml) se bebían fácilmente por la mayoría de los ratones después de un período de regulación del agua durante la noche. Las concentraciones más altas resultaron en conductas de evitación. Un yohexol 50% (350 mg de yodo por ml) produce suficiente radiodensidad mientras era devorado por los ratones, mientras que las concentraciones más bajas fueron marcadamente menos visible y obstaculizaron la cuantificación de la fisiología golondrina. Por lo tanto, la solución de prueba óptimo para VFSS con los ratones fue identificado como una solución iohexol 50% con sabor a chocolate añadió. Pruebas de palatabilidad Repita no dio lugar a conductas de evitación o eventos adversos.

Un tercer reto a superar impedía a los ratones de torneado / inclinando su cabeza mientras que beber, que oscurece la visualizacióndel mecanismo de la deglución durante VFSS. Beber de un tazón clavija posicionada justo por encima del suelo en un extremo de la cámara resuelve este problema. Hay varias ventajas adicionales de la utilización de un cuenco de PEG en vez de una botella de tubo para sorber. Por ejemplo, un volumen calibrado de líquido se puede verter en la PEG-tazón a través de un orificio de ventilación en el tapón terminal del tubo de observación. Este enfoque permite la cuantificación del volumen minuto de solución de ensayo consumida durante la breve duración de la prueba VFSS. Además, el aumento del área de superficie de la solución de prueba en el PEG-cuenco, en comparación con una pequeña abertura del tubo succionador, pueden proporcionar aumento de la estimulación olfativa para motivar a más de beber. PEG-cuencos pueden ser más adecuados para el estudio de ratones jóvenes o menores de deformación, como la altura tazón es una distancia normalizada del suelo. En contraste, las longitudes de tubo para sorber deben ajustarse para dar cabida a los ratones de tamaño diferente, lo que añade otra variable potencialmente de confusión a considerar. Además, el modo de ratónls de enfermedades neurológicas pueden tener dificultades para llegar a una botella tubo para sorber debido a alteraciones motoras de las extremidades, mientras que pueden llegar fácilmente a un tazón de palo. Los ratones con la lengua y / o disfunción de la mandíbula puede ser incapaz de presionar lo suficiente el balón en el pico para acceder al líquido; utilizando PEG-cuencos puede eliminar este factor de confusión. Por estas razones, el uso de PEG-cuencos sobre botellas de tubo para sorber es el método preferido de la prueba VFSS murino. Sin embargo, las cámaras de observación fueron diseñados para acomodar pitón para beber según sea necesario. Una advertencia importante a considerar es que las tasas de lamer se sabe que difieren entre pico y tazón potable ^13,26. Por lo tanto, la opción de caño o peg-bol para VFSS debe ser coherente dentro y entre los experimentos.

Un cuarto desafío fue identificar parámetros golondrina cuantificables para los ratones que son comparables a los parámetros VFSS comúnmente utilizados en los estudios de investigación en humanos y la práctica clínica. Nuestros resultados preliminares mostraron que eltipo de sistema de fluoroscopia determina que tragan parámetros pueden ser investigados en ratones. La mayoría de los centros de investigación y los centros médicos tienen alta energía (75-95 kV, 1.5 mA) fluoroscopios diseñado para su uso con las personas y los animales más grandes, que dan lugar excepcionalmente pobre calidad de imagen cuando se prueban los ratones y otros animales pequeños. A modo de ejemplo, un estudio reciente utilizando un fluoroscopio de alta energía con ratas fue capaz de identificar sólo 4 parámetros cuantificables golondrina ^12, y hemos sido capaces de identificar sólo 7 parámetros de tragar para los ratones en el presente estudio. Para superar esta limitación principal, que recientemente obtuvo un sistema de fluoroscopia de baja energía llamada El Labscope (Glenbrook Technologies). El sistema es un fluoroscopio en miniatura que genera un cono de haz continuo de rayos X con energías de fotones entre 15 y 40 kV y una corriente del tubo de pico de 0,2 mA (8 W potencia máxima). Los niveles de energía más bajos de este sistema están mejor atenuadas por el hueso delgado y el tejido blando de los ratones y por lo tanto proporcionan higheresolución de contraste de r (es decir, de alta energía) convencional fluoroscopios. El haz de rayos X de La Labscope se dirige a un intensificador de imagen 5 cm de diámetro, que es notablemente más pequeño que el 15 a 57 cm de diámetro intensificador de imagen de fluoroscopios convencionales. La distancia mínima de fuente a intensificador (SID) de El Labscope es ~ 6 cm (en contraste con ~ 30 cm para fluoroscopios convencionales), que proporciona una mayor capacidad de ampliación. Además, El Labscope utiliza tecnología patentada que amplía digitalmente la imagen hasta 40 veces en tiempo real, sin alterar el SID. El resultado es, en esencia, un microscopio de rayos X que puede ampliar y reducir en tiempo real de ver las pequeñas regiones de interés, como el mecanismo de la deglución de un ratón.

Una ventaja importante de este sistema de fluoroscopia de baja energía se mejora la seguridad radiológica. Además de los animales que recibieron dosis de radiación inferior con el Labscope, los investigadores utilizan el sistema están expuestos a significativamente less dispersión de radiación. La exposición a la radiación directamente en frente de la unidad en el panel de control es de 10,3 mR / hr. A una distancia de 1 m en frente de la unidad, la exposición se reduce a 580 μR / hr. La mayoría de los otros lugares de la habitación tienen una muy baja exposición por debajo de 10 μR / hr. A pesar de esta mejora, hemos tomado medidas adicionales para mejorar la seguridad radiológica. Por ejemplo, el blindaje de acrílico con plomo se ha añadido alrededor de La Labscope bloquear fotones dispersados ​​de rayos X, lo que permite a los investigadores a realizar pruebas VFSS murino sin usar protección personal (por ejemplo, delantales de plomo, escudos de tiroides, y vasos). Además, el acrílico transparente permite la visualización del ratón desde la distancia. Además de la seguridad radiológica es proporcionada por una mesa elevadora de tijera motorizada, que se controla de forma remota por el investigador. Desde una distancia de hasta 3 m del fluoroscopio, los investigadores pueden utilizar el dispositivo de control remoto para ajustar la posición vertical y horizontal de la cámara de observación dentro del bea de rayos Xm. Como resultado, las regiones anatómicas de interés se pueden mantener dentro del campo de vista de fluoroscopia mientras el ratón se mueve libremente dentro de la cámara de observación. Aunque la plataforma de tijeras fue diseñado para su uso con el Labscope, también es compatible para su uso con fluoroscopios convencionales para mejorar la seguridad radiológica para los investigadores. Un paso final para mejorar la seguridad de radiación durante murino VFSS implica el uso de un sistema de entrega de la jeringa para líquidos. Este sistema incluye un pie 3-4 (o más, si es necesario) longitud de tubo de PE, que permite la entrega rápida y eficiente de los líquidos en el PEG-cuenco de una distancia. Este sistema de entrega de la jeringa para líquidos, en combinación con las cámaras de observación, también se puede utilizar con fluoroscópios convencionales.

El trabajo preliminar utilizando la Labscope, en combinación con el nuevo protocolo VFSS murino, demuestra una gran ventaja de los sistemas convencionales: el número de parámetros que se pueden tragar i cuantificado confiablementes casi se duplicó. Sin embargo, las estructuras de los tejidos blandos del mecanismo de la deglución (por ejemplo, lengua, velo del paladar, de la pared posterior de la faringe, y la epiglotis) de los ratones no son fácilmente visibles cuando se utilizan sistemas de fluoroscopia de baja o de alta energía. Por lo tanto, nos centramos en la cuantificación de las medidas de flujo de bolo en lugar de la biomecánica de la deglución. Estábamos predominantemente interesados ​​en parámetros que podrían cuantificarse en base a unidades de tiempo, área, distancia, volumen, etc., en lugar de utilizar medidas de la escala tipo Likert. Numerosos parámetros de flujo de bolo cumplimiento de este requisito se han descrito en la literatura VFSS humano, tales como el tiempo de tránsito oral, ^{27-29, 27-33} faríngea tiempo de tránsito, y el tiempo de tránsito esofágico ^34-36, por nombrar sólo unos pocos. Transporte bolo a través de la cavidad oral no era fácilmente visible en ratones, probablemente debido al pequeño tamaño de bolo durante potable espontánea. Sin embargo, hemos sido capaces de cuantificar de manera fiable la faringe y de tránsito esofágico veces, asícomo varias otras medidas relacionadas con el flujo y el aclaramiento de bolo. Se espera que la identificación de parámetros adicionales golondrina de traducción que optimizamos las capacidades de El Labscope.

Los resultados de este estudio mostraron que los ratones que toman varios lame rítmicos por golondrina durante potable espontánea, con cada pequeño secuencialmente bolo líquido que llena el espacio vallecular antes de desencadenar la golondrina faríngea. Este comportamiento, que es típico de los mamíferos que utilizan lamiendo como el principal medio de la ingestión de líquido ^{37 a 40,} se asemeja al patrón rítmico succión-deglución de deglución infantil humano y todos los mamíferos infantiles en general. Infant fisiología tragar se caracteriza por varios rítmica succiones seguidas de una golondrina faríngea reflexiva, comúnmente descrito como el ciclo de succión-deglución ^37,41-43. Por lo tanto, la lengua y la mandíbula movimientos rítmicos involucrados en las conductas lamiendo ingestiva de ratones pueden ser más comparable a ingestiva chupadores comportamientos de zumbidoun niños pequeños en lugar de beber la taza de los niños y adultos. Por ello, hemos estado cuantificando la razón de tasas y lamer-golondrina lamer de los ratones para comparaciones futuras con la relación de chupar tasa y succión-deglución de los bebés humanos. Tal vez la investigación VFSS murino proporcionará información sobre los trastornos de deglución de desarrollo.

Como con cualquier nuevo método de investigación, se han identificado las áreas de mejora. Por ejemplo, el protocolo VFSS murino fue desarrollado utilizando sólo las cepas C57 y C57 / SJL de ratón; todavía no ha sido probado con ratas. Tendrá que ser reducido en tamaño (diámetro y longitud) para acomodar el tamaño de cuerpo más grande de las ratas Las cámaras de observación. Además, se desconoce si iohexol con sabor de chocolate es adecuada como una solución de ensayo VFSS murino universal. Por lo tanto, las pruebas de mayor escala con múltiples cepas de ratones y ratas se justifica para este propósito. Además, el uso de bario como agente de contraste para murino VFSS no debe ser descartada. Ratones prefiere claramente la iohexol recetas más de bario; intentos sin embargo más rigurosos y sistemáticos en enmascarar el sabor aversivo / olor de bario pueden proporcionar alternativas sabrosas a yohexol. Futuros estudios que comparan los efectos del sulfato de bario y iohexol (así como otros medios de contraste orales potenciales) sobre la preferencia y gusto tragan fisiología en ratones y ratas que, sin duda, proporcionar información importante que es directamente relevante y traslacional para VFSS humano.

VFSS con seres humanos incluye varias consistencias de alimentos y líquidos, y disfagia es más evidente al tragar líquidos delgados, y los alimentos sólidos secos ^44,45. Por consiguiente, el protocolo de VFSS murino se está ampliando para incluir consistencias adicionales que pueden facilitar la detección y cuantificación de la disfagia en modelos de enfermedad. También será necesario llevar a cabo pruebas de viscosidad de las recetas líquidas para VFSS murino con el fin de ajustar las viscosidades para que coincida con los utilizados durante VFSS humano. Abordar estos límiteciones facilitarán la identificación de biomarcadores VFSS traslación de disfagia que se pueden comparar directamente entre los ratones, ratas y seres humanos.

La utilidad de VFSS murino se puede mejorar significativamente mediante la implantación de marcadores radiopacos en las estructuras de los tejidos blandos del mecanismo de deglución que de otra manera no son visibles, permitiendo de este modo la investigación de la biomecánica de la deglución. Este enfoque ha sido utilizado con éxito durante muchos años para estudiar la biomecánica de la deglución en los cerdos infantiles, usando una variedad de clips de metal y alambres ^37,42. Esperamos que el uso de marcadores similares, pero más pequeñas, en ratones permitiría cuantificación de varios parámetros de golondrina adicionales para la comparación con los mamíferos más grandes, incluyendo los seres humanos. Actualmente estamos desarrollando una metodología para implantar marcadores radiopacos en la lengua, paladar blando, faringe, laringe y esófago proximal de ratones para probar esta hipótesis.

La grabacion de videog velocidad de fotogramas del fluoroscopios Labscope y convencionales es limitado a 30 fotogramas por segundo (fps). Sin embargo, nuestros resultados preliminares mostraron que la totalidad de la fase faríngea de la deglución para ratones sanos se produce en menos de 66 ms (es decir, 2 frames), que es aproximadamente 10 veces más rápido que los humanos. Por lo tanto, la fase faríngea de la deglución en los ratones se produce tan rápidamente que los detalles no son apreciables con una cámara de 30 fps. Una mayor velocidad de cuadro (probablemente> 100 fps) será necesario visualizar suficiente y cuantificar los movimientos muy rápidos y complejos de la fase faríngea de la deglución en ratones y otros roedores. En conjunción con una mayor velocidad de cuadro, la incorporación de tecnología biplano para fluoroscopia 3D sin duda ampliaría el murino utilidad VFSS. Por lo tanto, las futuras consideraciones de diseño deben incluir una cámara de mayor velocidad de cuadro y capacidades de imagen biplanares.

Por último, bajas dosis de radiación se ha demostrado que causa esterilidad enratones hembra C57, resultando en niveles alterados de hormonas ováricas estimulado que pueden confundir los estudios de vida útil ^46. Los resultados relativos específicamente a los efectos de la exposición a la radiación de baja dosis repetida asociado con las pruebas de VFSS aún no se han investigado en ratones, otros animales, o seres humanos. Sin embargo, la disfunción ovárica (no relacionada con la exposición a la radiación) en hembras humanas se ha relacionado con trastornos de motilidad gastrointestinal, y específicamente a la disfagia en algunos casos ^47, que proporciona otra advertencia a considerar en el diseño de estudios futuros VFSS que incluyen hembras (animales y humanos ). La exclusión de las mujeres se debe evitar, ya que las diferencias de género significativas en la función golondrina se ha informado de personas y ^48,49 serían importantes para detectar y caracterizar en modelos de enfermedades de los animales también. Por lo tanto, los resultados de los estudios longitudinales VFSS en ratones y ratas de ambos sexos tienen un enorme potencial de la traducción para los seres humanos en relación con dysphagia, así como a los riesgos de exposición a la radiación de baja dosis asociados con las pruebas VFSS de repetición.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polycarbonate tubing for observation chambers	McMaster-Carr	3161T41	Body of observation tubes, 2"X2" diameter, 0.080" thick wall
Polycarbonate sheet  for observation chambers	McMaster-Carr	9115K71	End-caps for observation tubes, 2"x12"x3/4"
Polycarbonate sheet  for observation chambers	McMaster-Carr	8574K281	Peg-bowls for observation tubes
Silicone O-rings  for end-caps of observation chambers	McMaster-Carr	9396K108	S1138 AS568-029, pack of 25 http://www.mcmaster.com/#o-rings/=t0wt5r
Silicone stoppers for observation chambers	McMaster-Carr	2903K22	Package of 10 stoppers to plug the oval opening in the top of the observation chamber when using a peg-bowl http://www.mcmaster.com/#catalog/120/3803/=t0y5at
Centrifuge tubes for sipper tube bottles	Evergreen Scientific	222-3530-G80	30 ml freestanding centrifuge tubes, with caps, sterile https://www.evergreensci.com/labware-catalog/tubes-and-vials/30-and-50-ml-centrifuge-tubes/
Silcone stoppers for sipper tube bottles	Saint-Gobain Performance Plastics	DX263031-10	Number 31D, size: 26 mm bottom, 32 mm top, 30 mm high; 10 pack;  http://www.labpure.com/en/Products.asp?ID=179&PageBrand=STOPPERS
Stopper borers for sipper tube bottles	Thomas Scientific	3276G40	Cork Borer Set that ranges from 3/16-15/16 inch  http://www.thomassci.com/Supplies/Corks/_/CORK-BORER-SET-316-1516-IN?q=Humboldt
Drinking tubes for sipper tube bottles	Ancare	TD-100	2 1/2” long drinking tubes with 5/16” opening, straight ball-spout http://www.ancare.com/products/watering-equipment/open-drinking-tubes/straight-tubes-ball-point
Iohexol for making oral contrast agent solution	GE Healthcare		350 mg iodine per ml http://www3.gehealthcare.com/en/products/categories/contrast_media/omnipaque
Chocolate syrup for flavoring oral contrast agent	Herseys
10 ml syringe for syringe delivery system	Becton, Dickinson and Company	309604	Luer lock tip syringe without needle, 100 per box http://www.bd.com/hypodermic/products/syringeswithoutneedles.asp
Catheter tubing for syringe delivery system	Becton, Dickinson and Company	427451	Polyethylene Tubing (Non-Sterile) (PE 240) 100' http://www.bd.com/ds/productCenter/427451.asp
Needle for syringe delivery system	Becton, Dickinson and Company	427560	15-gauge needle, fits into PE 240 catheter tubing http://www.bd.com/ds/productCenter/427560.asp
Delrin acetal resin rod for syringe delivery system	McMaster-Carr	8576K15	1/2 inch diameter, black http://www.mcmaster.com/#catalog/120/3609/=t0wvaf
Acrylic sheeting for scissor lift	Ponoko		Laser cut http://www.ponoko.com
3D printed ABS frame	Engineering Rapid Prototyping Facility, University of Missouri
Brass rods for scissor lift	Amazon	TTRB-03-12-03	made into axles http://www.amazon.com/Brass-Seamless-Round-Tubing-Length/dp/B000FN898M
Drawer slide for scissor lift	Richelieu	10292G116	Attaches to base of scissor lift http://www.lowes.com/pd_380986-93052-T35072G16_0__?productId=50041754
28BYJ-48 stepper motor for scissor lift			2 each
ULN2003 Darlington transistor array for scissor lift	Toshiba	ULN2003APG	Used as stepper drivers (2 each)
ATTINY85 microcontroller for scissor lift	Atmel	ATTINY85-20PU	2 each http://www.taydaelectronics.com/attiny85-attiny85-20pu-8-bit-20mhz-microcontroller-ic.html
Nylon spur gear	McMaster-Carr	57655K34	2 each http://www.mcmaster.com/#57655k34/=t0yaqz
Nylon spur gear rack	McMaster-Carr	57655K62	2 each http://www.mcmaster.com/#57655k62/=t0ybh9
4-40 nylon machine screws	McMaster-Carr	95133A315	Lift assembly http://www.mcmaster.com/#95133a315/=t0yd8q
4-40 nylon hex nuts	McMaster-Carr	94812A200	Lift assembly http://www.mcmaster.com/#94812a200/=t0ye29
Buna-N O-Ring AS568A Dash No. 104	McMaster-Carr	9452K318	Lift assembly http://www.mcmaster.com/#9452k318/=t0yem7