De dos fotones de imágenes de Dinámica Celular en la médula espinal de ratón

Resumen

Una nueva preparación ex vivo para obtener imágenes de la médula espinal de ratón. Este protocolo permite la formación de imágenes de dos fotones de las interacciones celulares en vivo a lo largo de la médula espinal.

Resumen

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

Introducción

Los modelos de ratón de desmielinización, incluida la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) y la infección intracraneal con virus de la hepatitis del ratón neuroadapted (MHV), son excelentes herramientas para estudiar las vías moleculares y las interacciones celulares asociados con la enfermedad. Han liderado y apoyado la eficacia de las terapias farmacéuticas aprobado por la FDA, destinado principalmente a la cesación de la autoinmunidad y la inflamación ^1. Sin embargo, una vez que la remielinización endógena ha fracasado, las terapias aprobadas actualmente no reparan efectivamente lesiones de desmielinización en el sistema nervioso central. Por lo tanto, las terapias de reparación centrada en esta etapa de la enfermedad son fundamentales para el alivio de los síntomas crónicos y mejora de la calidad de vida. Recientemente, las células precursoras neuronales (CPN) han venido a la vanguardia como una modalidad terapéutica potencial regenerativo de las zonas de inflamación y desmielinización objetivo. Varios estudios han puesto de manifiesto la capacidad de los NPCs para inducir endogenonos remielinización y participar directamente en la remielinización ^2-8. Debido NPCs están involucrados en la remielinización directa, es imprescindible entender su cinética y las interacciones con las células endógenas después del trasplante. Después del trasplante, NPCs migran ventralmente a áreas de daño de la sustancia blanca, entonces rostral y caudal en relación con el sitio de trasplante de ^5,9. La cinética de la migración difieren en respuesta a señales ambientales; NPCs trasplantadas en una médula espinal dañada no tienen mayores velocidades que los NPCs trasplantadas en una médula espinal dañada ^6. Después de un período migratorio, transferidos NPC proliferan extensamente, a una tasa superior en un cable dañado la médula relativa a una médula espinal intacta ^6. Por último, la mayoría de los NPC diferenciarse en oligodendrocitos e iniciar ^4,6,9 remielinización directa.

La lesión desmielinizada es complejo y puede incluir una población diversa de células en diversas etapas de unactivation. Por ejemplo, una lesión activa la esclerosis múltiple (MS) puede incluir una importante población de células T activadas, microglia y macrófagos M1 M1, pero una lesión MS silenciosa crónica puede estar compuesto principalmente de los astrocitos reactivos con pocas células inflamatorias ^10-13. Debido a la diversidad de las células efectoras, de dos fotones (2P) de imágenes en modelos de ratón de la desmielinización es una herramienta extremadamente útil para ayudar a entender las interacciones celulares locales dentro de la lesión. En muchos modelos de investigación MS utilizados ampliamente MS y, la mayoría de las lesiones se localizan en el lado ventral de la médula espinal, una región inaccesible para formación de imágenes 2P intravital debido a la profundidad de la lesión y el alto contenido de lípidos de la médula espinal. Para evitar estos problemas y de las interacciones célula-célula estudio dentro de las lesiones de la médula espinal ventral, hemos desarrollado un sencillo preparación imágenes in vivo 2P ⁶ ex.

Este estudio da seguimiento a una publicación métodos anteriores, que mostróel procedimiento para el trasplante de proteína verde fluorescente mejorada (EGFP) NPC que expresaban en la médula espinal de ratones después de JHMV cepa de desmielinización inducida por MHV ^14. Cinco semanas de edad ratones están infectados con JHMV y trasplantados con eGFP-NPCs a nivel torácico 9 en el día 14 después de la infección. El protocolo que aquí se presenta ofrece los pasos detallados sobre cómo extraer la médula espinal, hacer una preparación ex vivo de agarosa, y de imagen trasplantado interacciones eGFP-NPC con proteína mejorada amarillo fluorescente (eYFP) axones que expresaban. Los ratones que expresan eYFP bajo el promotor Thy1-neuronal específica se utilizaron en este procedimiento ^15. Sólo algunos de los axones expresan eYFP, lo que es útil para obtener imágenes de los axones individuales. Aquí mostramos las médulas espinales retirados a los 7 días post-trasplante; sin embargo, las médulas espinales se pueden extraer en cualquier punto de tiempo después del trasplante. Mientras que mostramos interacciones de NPC con axones dañados, nuestro protocolo se puede utilizar en combinación con marcadores fluorescentes genéticosde otros tipos de células para investigar una multitud de interacciones celulares que se producen en toda la médula espinal de ratón.

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Protocolo

Declaración de Ética: NOTA: El protocolo para el manejo de animales fue aprobado por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) de la Universidad de California, Irvine, protocolo # 2010-2943.

1. La eliminación de la médula espinal

1. Coloque toallas de papel humedecidas con isoflurano líquido ~ 100%, USP en cámara de la eutanasia y colocar toallas de papel secas en la parte superior. Coloque el ratón en la cámara encima de las toallas de papel secas así ratón no está tocando el isoflurano y asegúrese de que la cámara se cubre. Espere al menos un minuto después de la interrupción de la respiración para asegurarse de que el ratón es sacrificado.
2. Realizar una transección de la médula del cuello para asegurar el ratón es sacrificado. No realice una luxación cervical ya que esto podría dañar la médula espinal.
3. Pulverizar el ratón con etanol al 70% para mojar el cabello.
4. Utilice tijeras finas afilados para quitar el pelo y la piel de la parte posterior del ratón para exponer la columna vertebral cervical de la lámina de aproximadamente 1 (C1) A la lámina sacral 4 (S4).
5. Usando un escalpelo con una cuchilla # 10, hacer incisiones a la izquierda y derecha de la columna vertebral para separarlo de músculo y grasa. Esto hará que la eliminación de la médula espinal mucho más fácil.
6. opcional: a curvas rongeurs Luer se pueden utilizar para recoger distancia carne adicional.
7. Mientras sujeta la parte superior de la columna vertebral con pinzas dentadas Graefe, inserte titanio curvado tijeras Vannas con la parte curvada hacia arriba en la columna vertebral expuesta en C1, teniendo cuidado de no tocar la médula espinal.
8. Deslice el titanio curvadas tijeras Vannas todo el camino a la derecha y hacer un pequeño corte. Un sonido crunch pequeña debe ser oído y sintió como las tijeras cortan las vértebras. Repita este corte en el extremo izquierdo de la cuerda. Tenga cuidado de no ir demasiado rápido o hacer demasiado grande de un corte como este se arriesgará a dañar el cable con las tijeras.
9. La única lámina debe ser capaz de ser levantado con las pinzas una vez que se cortan los lados de las vértebras. REPEAT este paso para cada lámina hasta S4, sin dejar de sujetar y tirar de las vértebras de la médula espinal.
   NOTA: las vértebras por encima del sitio de trasplante probablemente saldrá una vez que se corta al sitio de trasplante. Continuar el procedimiento comenzando justo debajo del sitio de trasplante.
10. opcional: sentar las vértebras hacia abajo para ver donde el sitio de trasplante es y medir y cortar ~ 20 mm rostral y caudal al sitio de trasplante.
    NOTA: Cuando el trasplante NPCs más no serán necesarios como los NPCs trasplantados generalmente no migran más de 15 mm. La cantidad de la médula espinal necesaria dependerá de experimento y de migración características de tipo celular trasplantado. Para hacer cortes rostral y caudal que son equidistantes al sitio de trasplante le permitirá al centro de trasplante que se encuentra más fácilmente durante la exploración.
11. Con un bisturí con una hoja # 11 Corte cuidadosamente los ganglios de la derecha y la izquierda de la cara ventral de la médula espinal a partir de finales rostral. Esta wenfermo permitir la médula espinal para ser removido de las vértebras ventral más fácilmente.
    NOTA: Hecho rápidamente (pasos 1.7 a 1.11), la médula espinal no se seque. Sin embargo, 1x PBS se puede administrar a la cuerda para mantenerlo húmedo.
12. Invierta el ratón y mantenga pulsado el ratón hacia arriba por lo que la médula espinal se encuentra hacia abajo. Retire con cuidado la médula espinal utilizando pinzas dentadas Graefe cerrados. Sin mellar la médula espinal, cortar cuidadosamente cualquier ganglios restantes para permitir la médula espinal para ser levantado en una sola pieza intacta.
13. Asegúrese de que la médula espinal es en RPMI-1640 y colocarlo en hielo durante el transporte al microscopio 2P.

2. Preparación de la médula espinal de la Imagen

1. Incorporación de la médula espinal en agarosa
   1. Mantenga la médula espinal aislada en RPMI-1640 enfriado en hielo antes de la imagen.
   2. Pesar de agarosa (baja temperatura de gelificación) y preparar una solución al 5% en 5 ml de PBS 1x. Microondas la solución de agarosa al 5% durante 15 s para disolver el agsurgió y dejar enfriar la disolución a 37 ° C.
   3. Preparar la médula espinal, colocándolo en una hoja de Parafilm con la cara ventral hacia arriba.
   4. Pipetear aproximadamente 5 ml de solución de agarosa al 5% sobre el lado ventral de la médula espinal. Deje que la agarosa solidifique por enfriamiento a temperatura ambiente. Solidificación completa tarda aproximadamente 5 minutos.
   5. Aplique una ligera capa de adhesivo tisular a un 22 mm tapa cuadrada de deslizamiento.
   6. Invierta la médula espinal incrustado, colocando la cara ventral de Parafilm. El lado dorsal será ahora hacia arriba. Pegue la hoja de la cubierta de la parte dorsal, y sumerja la preparación de la suspensión de agarosa incrustada médula espinal / cubierta en RMPI para solidificar el adhesivo. Eliminar el exceso de agarosa se solidifica utilizando una hoja de afeitar.
2. Montaje de la médula espinal en la platina del microscopio
   1. Aplique vaselina en la parte inferior de la hoja de la cubierta. Esto estabilizará la preparación durante la perfusión.
   2. Coloque la preparación de la médula espinal en unaobtener imágenes bien en la platina del microscopio con la parte ventral hacia arriba hacia el objetivo de inmersión 25X. El pozo de imagen hecha a la medida es de aproximadamente 20 mm de profundidad, 50 mm de largo y 50 mm de diámetro.
   3. Image mientras superfusión la preparación con calentado (37 ° C), oxigenada (95: 5 de oxígeno: dióxido de carbono carbógeno) medio RPMI-1640 sin suero.
      1. Medios Pre-caliente hasta 37 ° C en el baño de agua y conéctelo a la bomba de tubería mediante la inserción de la tubería en la botella de los medios de comunicación.
      2. Conserve la temperatura del medio a 37 ° C un dispositivo calentador en la conexión de la tubería a la cámara. Medios de comunicación a través de superfuse bien en 3 ml / min usando un tubo conectado a la bomba de tubería (Figura 1B).

3. 2P Imaging de la médula espinal ventral

1. Configuración Microscopio
   1. Adquirir imágenes desde Thy1-EYFP médula espinal utilizando un Ultra Ti Camaleón: Sapphire láser sintonizado a 900 nm. Atenuar la potencia del láser en elespécimen a <5% para asegurar un mínimo de fototoxicidad ^16. Mantener la temperatura por perfusión perfundido en oxígeno RPMI-1640 en una constante 37 ° C utilizando un único calentador de solución en línea para asegurar la formación de imagen estable, y para prevenir la deriva del tejido y daño celular.
   2. Para separar la señal fluorescente eGFP y eYFP, coloque una nm dicroico 520 de un solo filo y un solo filo nm divisor de haz dicroico 560 en serie para separar 2P emisión a tres canales, a propósito de dividir la emisión verde para mejorar la visibilidad.
      NOTA: Estos canales se conocen como azul-verde (emisión <520 nm), verde-amarillo (520-560 nm) y rojo (emisión> 560 nm). Tubos fotomultiplicadores detectan emiten luz en cada canal.
2. Localización de áreas de imagen de interés
   1. Usando el ocular y una fuente de luz de campo claro, se centran el objetivo de inmersión en el borde ventral de la médula espinal para establecer un punto de referencia.
   2. Haz fuente de luz ambiente seguro está apagado y swprurito de 2P excitación abriendo el obturador de láser.
   3. Si está disponible, en la búsqueda de tejidos para las áreas de interés, use un ajuste de resolución más baja, mayor volumen sin zoom digital, y una mayor velocidad de barrido que cuando la adquisición de las imágenes finales. La configuración típica con este sistema en la búsqueda de tejidos para una región de interés son: la resolución: 256 píxeles; volumen: x = 600 m, y = 600 m, z = 0 a 300 micras.
   4. Observar los axones EYFP cerca del borde ventral de la médula espinal. Señal armónica Segundo de colágeno (azul) será más brillante en el borde del tejido de la médula espinal. Ubicar los axones EYFP sólo dorsal a la segunda señal armónica de la señal de colágeno y eYFP se visualiza en el canal de color amarillo-verde.
   5. Localizar el sitio de trasplante en el centro longitudinal de la preparación de la médula espinal ^14. Para los ratones 1 día siguiente eGFP-NPC trasplante, localizar el sitio del trasplante, centrándose la trayectoria del haz en el plano z profundamente en el tejido. El wi sitio trasplantell variar ligeramente entre los animales, pero en general se encuentra ~ 200 m desde el borde ventral. Observar los racimos de eGFP-NPC en los tractos de sustancia blanca, más cerca de los bordes ventrales y laterales en ratones después de 1 día post-trasplante.
3. La adquisición de imágenes finales
   1. Adquirir resolución de imagen de 512 píxeles; volumen: x = 270 m, y = 212 m, y z = 100 micras utilizando software Slidebook 6. Compilar z-pilas mediante la adquisición de planos focales secuenciales en 2,5 micras incrementos.
   2. Realizar un análisis bidireccional con el offset para garantizar la rápida cuantificación de cualquier objeto que migran en la médula espinal entrelazado apropiado. Asegúrese de que la velocidad de fotogramas adquisición ideal para determinar la velocidad del celular dentro de la médula espinal es de aproximadamente 1 fotograma / seg.
      NOTA: Los ajustes de imagen se pueden cambiar las preferencias de usuario individuales, tales como la velocidad de fotogramas adquisición, resolución de imagen y volúmenes de imágenes. Volúmenes de imágenes más grandes por lo general tardan más en adquirir a un givresolución en.
   3. Analizar, cultivos, lisa, y pseudocolor archivos de imagen Slidebook con software de análisis de imágenes, tales como Bitplane Imaris 7.7. Producir vídeos finales de lapso de tiempo peinando volúmenes consecutivos de imagen utilizando un proceso automatizado en Slidebook y Imaris.

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Resultados

Aunque el protocolo de formación de imágenes de la médula espinal explantado se puede utilizar para visualizar cualquier fluorescencia dentro de la médula espinal, nuestros resultados representativos demuestran interacciones eGFP-NPC con EYFP-axones. En primer lugar, se muestra la preparación de la médula espinal ventral incrustado en la Figura 1A. A continuación, se muestra la configuración 2P microscopio y componentes clave en la Figura 1B. La Figura 2 demuestra eGFP y e...

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Discusión

En tiempo real se requiere 2P imágenes de tejido intacto para investigar la cinética de la APN y las interacciones tras el trasplante en el ratón desmielinizada médula espinal. Intravital de imágenes 2P se utiliza comúnmente para determinar la dinámica celular en el lado dorsal de la médula espinal en ratones vivos, y ha sido utilizado para estudiar la desmielinización dorsal en enfermedad desmielinizante ^17-19. Sin embargo, debido NPC trasplantados migran a la materia blanca ventral, que se encuentr...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane, USP	Piramal Critical Care, Inc	N/A
Fine scissors	Fine Science Tools	14060-09	sharp
scalpel blade #10	Fine Science Tools	10010-00
scalpel handle	Fine Science Tools	10003-12
Luer rongeurs	Fine Science Tools	16001-15
Graefe forceps	Fine Science Tools	11052-10
Vannas scissors	Fine Science Tools	15615-08
scalpel blade #11	Fine Science Tools	10011-00
RPMI-1640	Gibco	12-115F
agarose, low gelling temperature	Sigma	A9414-25G
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-12
Vetbond (tissue adhesive)	3M	1469SB
22 mm square cover slip	Fisher Scientific	12-547
25X dipping objective, 1.1 NA	Nikon	CFI Apo LWD 25XW
Single inline solution heater	Warner Instruments	64-0102
520 nm single-edge dichroic beam splitter	Semrock	FF520-Di02-25x36	Brightline
560 nm single-edge dichroic beam splitter	Semrock	FF560-FDi01-25x36	Brightline
photomultiplier tubes	Hamamatsu	R928
C/L variable-speed tubing pump	Masterflex	77122-22
digital thermometer	Comar Instruments	3501
Chameleon Ultra Ti:Sapphire laser	Coherent	N/A
Slidebook 6 software	3i	N/A
Imaris 7.7 software	Bitplane	N/A