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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Eine neue ex vivo Herstellung zum Abbilden der Rückenmark der Maus. Dieses Protokoll ermöglicht die Zwei-Photonen-Bildgebung von lebenden zellulären Interaktionen ganzen Rückenmark.

Zusammenfassung

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

Einleitung

Mausmodelle der Demyelinisierung, einschließlich experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) und intrakranielle Infektion mit neuroadapted Maus-Hepatitis-Virus (MHV), sind ausgezeichnete Werkzeuge zur molekularen Signalwege und zellulären Interaktionen mit der Krankheit zu studieren. Sie haben dazu geführt, und unterstützt die Wirksamkeit der FDA zugelassenen pharmazeutischen Therapien, die sich vornehmlich an Einstellung der Autoimmun- und Entzündungs ​​1. Sobald jedoch endogenen Remyelinisierung ausgefallen ist, die gegenwärtig zugelassenen Therapien nicht wirksam beheben demyelinisierten Läsionen im zentralen Nervensystem. Daher sind die Reparaturorientierten Therapien in diesem Stadium der Erkrankung kritisch für die Linderung von chronischen Symptomen und Verbesserung der Lebensqualität. In letzter Zeit wurden neurale Vorläuferzellen (NPCs) in den Vordergrund als eine mögliche regenerative Therapieform gekommen, um Bereiche der Entzündung und Demyelinisierung Ziel. Mehrere Studien haben die Fähigkeit der NPCs zu endogeno induzieren hervorgehobenRemyelinisierung uns und machen Sie direkt in die Remyelinisierung 2-8. Da NPCs in direktem Remyelinisierung beteiligt sind, ist es unerlässlich, die Kinetik und Wechselwirkungen mit körpereigenen Zellen nach der Transplantation zu verstehen. Nach der Transplantation, wandern NPCs ventral Bereichen der weißen Substanz Schaden, dann rostral und kaudal in Bezug auf die Transplantatstelle 5,9. Die Kinetik der Migration unterschiedlich in Reaktion auf Umweltreize; NSC in einen nicht beschädigten Rückenmark transplantiert größere Geschwindigkeiten als NSC in einen beschädigten Bandkabel 6 transplantiert. Nach einer Wanderungsperiode übertragen NSC proliferieren umfassend, mit einer höheren Geschwindigkeit in einer beschädigten Wirbelsäule relativ zu intaktem Rückenmark 6. Schließlich sind die meisten NPCs differenzieren sich in Oligodendrozyten und initiieren direkten Remyelinisierung 4,6,9.

Die demyelinisierten Läsion ist komplex und kann eine vielfältige Population von Zellen in verschiedenen Stadien einer umfassenctivation. Zum Beispiel kann ein aktiver Multipler Sklerose (MS) Läsion eine signifikante Population von aktivierten T-Zellen, M1 Mikroglia und M1 Makrophagen, aber eine chronische Stumm MS Läsion kann hauptsächlich aus reaktiven Astrozyten mit wenig Entzündungszellen 10-13 umfaßt, umfassen. Aufgrund der Vielfalt von Effektorzellen, Zwei-Photonen (2P) Bildgebung in Mausmodellen der Demyelinisierung ist ein äußerst nützliches Werkzeug zur besseren Verständlichkeit lokalen zellulären Interaktionen innerhalb der Läsion. MS und vielen intensiv genutzt MS Forschungsmodellen wird die Mehrzahl von Läsionen an der Bauchseite des Rückenmarks, einer Region unzugänglich intravitalen 2P Abbildungs ​​aufgrund Läsionstiefe und dem hohen Lipidgehalt des Rückenmarks. Um diese Probleme und Untersuchung der Zell-Zell-Wechselwirkungen innerhalb Läsionen entlang der ventralen Rückenmark umgehen haben wir ein einfaches ex vivo 2P Abbildungs ​​Zubereitung 6 entwickelt.

Diese Studie folgt auf eine frühere Veröffentlichung Methoden, die zeigten,die Prozedur zur Verpflanzung enhanced green fluorescent protein (eGFP) exprimierenden NSC in das Rückenmark von Mäusen nach JHMV Stamm von MHV-induzierten Demyelinisierung 14. Fünf Wochen alten Mäusen mit JHMV infiziert und mit eGFP-NPCs transplantiert bei thorakalen Ebene 9 am Tag 14 nach der Infektion. Die hier vorgestellte Protokoll enthält detaillierte Anweisungen zum Extrahieren des Rückenmarks, geben Sie ein Ex-vivo-Agarose Vorbereitung und Bild transplantiert eGFP-NPC-Interaktionen mit verbesserten gelb fluoreszierendes Protein (eYFP) exprimierenden Axone. Mäuse, eYFP unter der neuronalen spezifischen Thy1 Promotor In diesem Verfahren wurden 15 verwendet. Nur ein Teil der Axone zum Ausdruck eYFP, so dass es nützlich für die Abbildung einzelner Axone. Hier zeigen wir, Rückenmark nach 7 Tagen nach der Transplantation entfernt; jedoch kann das Rückenmark zu jedem Zeitpunkt nach der Transplantation gewonnen werden. Während wir zeigen, Wechselwirkungen von NPCs mit beschädigten Axone können unsere Protokoll in Kombination mit genetischen Fluoreszenzmarker eingesetzt werdenvon anderen Zelltypen in einer Vielzahl von zellulären Interaktionen ganzen Rückenmark der Maus vorkommen untersuchen.

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Protokoll

HINWEIS: Ethics Statement: Das Protokoll für die Behandlung der Tiere wurde von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) von der University of California, Irvine, Protokoll # 2010-2943 genehmigt.

1. Entfernen des Rückenmarks

  1. Zeigen Papierhandtücher mit ~ 100% Flüssigkeit Isofluran USP benetzt in euthanizing Kammer und legen trockenen Papierhandtücher auf. Zeigen Maus in Kammer auf der Oberseite des trockenen Papiertüchern so Maus die Isofluran nicht berühren, und sicherstellen, dass die Kammer bedeckt. Frühestens nach einer Minute nach dem Atemstillstand zu gewährleisten, dass die Maus euthanasiert.
  2. Führen Sie einen Rückendurchtrennung des Halses, um sicherzustellen, wird die Maus getötet. Haben einen Genickbruch nicht durchführen, da dies das Rückenmark beschädigt werden.
  3. Sprühen Sie die Maus mit 70% Ethanol, um das nasse Haar.
  4. Scharfe Feine Schere, um die Haut und Haar von der Rückseite der Maus zu entfernen, um die Wirbelsäule von etwa Gebärmutterhalskrebs Lamina 1 aussetzen (C1) Zu sakralen Lamina 4 (S4).
  5. Mit einem Skalpell mit einer # 10 Klinge, stellen Schnitte auf der linken und rechten Seite der Wirbelsäule, um es von Muskeln und Fett zu trennen. Dadurch wird die Entfernung von dem Rückenmark erleichtert.
  6. optional: eine gekrümmte Luer Rongeure kann zur Schaufel entfernt zusätzliche Fleisch werden.
  7. Halten Sie die Spitze der Wirbelsäule mit Wellen Graefe Pinzette, legen Titan gebogenen Vannas Schere mit der gewölbten Seite nach oben in das freiliegende Wirbelsäule an C1, man aufpassen, das Rückenmark nicht zu berühren.
  8. Schieben Sie den Titan gebogenen Vannas Schere ganz nach rechts und machen einen kleinen Schnitt. Eine kleine Crunch-Sound zu hören sein und fühlte, wie die Schere die Wirbel. Wiederholen Sie diesen Schnitt auf der äußersten linken Seite des Kabels. Achten Sie darauf, nicht zu schnell zu gehen oder zu groß, von einem Schnitt, da dies das Risiko eine Beschädigung der Schnur mit der Schere.
  9. Die einzelnen Plättchens sollte mit der Pinzette angehoben, nachdem die Seiten der Wirbelsäule geschnitten zu werden. REPEAT Sie diesen Schritt für jede Schicht bis S4, weiterhin zu halten und ziehen Sie die Rückenmarkswirbel.
    Hinweis: die Wirbel oberhalb der Transplantatstelle wahrscheinlich ab, wenn man ihn auf die Transplantatstelle geschnitten kommen. Fahren Sie den Vorgang ab knapp unter der Transplantation Website.
  10. optional: legen Sie den Wirbel nach unten um zu sehen, wo die Transplantation Website hat und zu messen und schneiden ~ 20 mm rostral und kaudal der Transplantation Website.
    HINWEIS: Bei der Transplantation von NPCs mehr nicht als transplantierten NPC benötigt in der Regel nicht weiter migrieren als 15 mm sein. Die Höhe der Wirbelsäule benötigt wird abhängig vom Experiment und Migrationseigenschaften der Zelltyp verpflanzt. Machen rostralen und kaudalen Schnitte, die zur Transplantation Website gleich weit sind die Transplantation Website, um während der Bildgebung leichter entfernt werden können.
  11. Mit einem Skalpell mit einer # 11 Klinge sorgfältig geschnitten Ganglien auf der rechten und linken Seite der Bauchseite der Wirbelsäule ausgehend von der rostralen Ende. Dies wkrank ermöglichen das Rückenmark aus dem ventralen Wirbel leichter entfernt werden.
    HINWEIS: Fertig schnell (Schritte von 1,7 bis 1,11), wird das Rückenmark nicht austrocknen. Allerdings kann 1x PBS auf die Schnur verabreicht werden, um sie feucht zu halten.
  12. Drehen Sie die Maus und halten Sie die Maus nach oben, damit das Rückenmark nach unten zeigt. Schieben Sie vorsichtig das Rückenmark mit geschlossenen gezackten Graefe Pinzette. Ohne nicking das Rückenmark, sorgfältig geschnitten verbleibende Ganglien, damit das Rückenmark in einem einzigen intakten Stück angehoben werden.
  13. Stellen Sie sicher, das Rückenmark in RPMI-1640 und auf Eis für den Transport zum 2P Mikroskop.

2. Herstellung von Spinal Cord for Imaging

  1. Einbetten des Rückenmarks in Agarose
    1. Halten Sie die isolierten Rückenmark in gekühlt RPMI-1640 auf Eis vor der Bildgebung.
    2. Abwiegen Agarose (niedrige Geliertemperatur) und euch eine 5% ige Lösung in 5 ml 1x PBS. Mikrowelle den 5% igen Lösung für 15 Sekunden, um den ag lösenmachte sich auf und lassen Sie die Lösung abkühlen auf 37 ° C.
    3. Bereiten Sie das Rückenmark, indem Sie sie auf ein Blatt Parafilm mit der Bauchseite nach oben ein.
    4. Pipette ca. 5 ml 5% Agarose-Lösung über die Bauchseite der Wirbelsäule. Lassen die Agarose verfestigt durch Abkühlen auf Raumtemperatur. Voll Erstarrung dauert ca. 5 min.
    5. Eine dünne Schicht von Gewebekleber auf eine 22 mm Quadratdeckglas.
    6. Kehren Sie die eingebettete Rückenmark, indem die Bauchseite auf Parafilm. Die Rückenseite wird nun nach oben zeigen. Halten Sie das Deckglas auf der Rückenseite, und tauchen Sie die Agarose eingebettet Rückenmark / Deckglas Vorbereitung in RMPI, den Klebstoff zu verfestigen. Entfernen Sie das überschüssige erstarrte Agarose mit einer Rasierklinge.
  2. Montage des Rückenmarks auf dem Mikroskoptisch
    1. Vaseline auf die Unterseite des Deckglases. Dies stabilisiert die Vorbereitung während der Perfusion.
    2. Stellen Sie das Rückenmark Zubereitung in eineAbbilden und auf dem Mikroskoptisch mit der ventralen Seite nach oben in Richtung des 25X Tauchobjektivseite. Die speziell angefertigten Bild auch ca. 20 mm tief, 50 mm lang und 50 mm breit.
    3. Bild während Superfusion der Vorbereitung mit wärmten (37 ° C), mit Sauerstoff angereichert (95: 5 Sauerstoff: Kohlendioxid-Carbogen) RPMI-1640-Medium ohne Serum.
      1. Vorwärmen Medien bis 37 ° C im Wasserbad und an der Schlauchpumpe, indem Sie den Schlauch in die Medienflasche.
      2. Behalten die Flüssigkeitstemperatur bei 37 ° C eine Heizvorrichtung an der Verbindung der Rohrleitung mit der Kammer. Superfuse Medium durch gut bei 3 ml / min unter Verwendung von Schläuchen auf die Schlauchpumpe (1B) verbunden ist.

3. 2P Imaging des ventralen Rückenmark

  1. Mikroskop-Setup
    1. Erwerben Sie Bilder von Thy1-eYFP Rückenmark mit einem Chameleon Ultra-Ti: Saphir-Laser bis 900 nm eingestellt. Dämpfen Laserleistung auf dieProbe auf <5%, um minimale Phototoxizität 16 zu gewährleisten. Haltetemperatur durch Perfusion sauerstoff perfundiert RPMI-1640 mit einer konstanten 37 ° C unter Verwendung einer einzelnen Inline-Lösung Heizvorrichtung stabile Bildgebung zu gewährleisten und um Gewebe Drift und Zellschäden zu verhindern.
    2. Um eGFP und eYFP Fluoreszenzsignal zu trennen, setzen Sie ein 520 nm Single-Rand dichroitischen und eine 560 nm Single-Rand dichroitischer Strahlteiler in Reihe 2P Emission in drei Kanäle zu trennen, absichtlich Spaltung der grüne Emission, um die Sichtbarkeit zu verbessern.
      HINWEIS: Diese Kanal werden als blau-grün (Mission <520 nm), grün-gelb (520-560 nm) und rot (Emissions> 560 nm) bezeichnet. Photomultiplierröhren detect emittierte Licht in jedem Kanal.
  2. Lokalisierung Bildgebung Bereiche von Interesse
    1. Mit dem Okular und eine Hellfeld-Lichtquelle, konzentrieren sich die Tauchziel am ventralen Rand des Rückenmarks, ein Referenzpunkt gesetzt.
    2. Stellen Sie sicher, Umgebungslichtquelle ausgeschaltet ist und swJuckreiz an 2P Anregung durch Öffnen der Laserverschluß.
    3. Falls verfügbar, bei der Suche Gewebe für Bereiche von Interesse, verwenden Sie eine niedrigere Auflösung, höhere Lautstärke ohne Digitalzoom und eine höhere Abtastrate als beim Erwerb von endgültigen Bilder. Typische Einstellungen mit diesem System bei der Suche Gewebe für eine Region von Interesse sind: Auflösung: 256 Pixel; Volumen: x = 600 & mgr; m, y = 600 um, z = 0 bis 300 & mgr; m.
    4. Beachten Sie die eYFP Axone in der Nähe des ventralen Rand des Rückenmarks. Signal der zweiten Harmonischen aus Kollagen (blau) am hellsten in der Rückenmarksgewebe Rand. Suchen Sie die eYFP Axone nur auf die zweite harmonische Signal dorsal aus dem Kollagen und eYFP Signal wird in der grün-gelb Kanal visualisiert.
    5. Finde die Transplantatstelle in der Längsmitte des Rückenmarks Präparation 14. Bei Mäusen 1 Tag nach eGFP-NPC-Transplantation, suchen Sie die Transplantation Website durch die Fokussierung des Strahlengangs in der z-Ebene tief in das Gewebe. Die Transplantation Website will unterscheiden sich leicht zwischen den Tieren, sondern ist in der Regel ~ 200 & mgr; m von der ventralen Rand entfernt. Beachten Sie die Cluster von eGFP-NPCs in der weißen Substanz Wege, näher an der ventralen und Seitenränder in Mäusen nach Tag 1 nach der Transplantation.
  3. Der Erwerb endgültigen Bilder
    1. Erwerben Bildauflösung von 512 Bildpunkten; Volumen: x = 270 & mgr; m, y = 212 & mgr; m und z = 100 & mgr; m mit 6 Slidebook Software. Kompilieren z-Stacks durch den Erwerb von sequenziellen Fokusebenen in Schritten von 2,5 um.
    2. Führen Sie eine bidirektionale Abtastung mit der richtigen Zeilensprung-Offset, um eine schnelle Quantifizierung eventueller Migrieren von Objekten im Rückenmark zu gewährleisten. Sicherzustellen, dass die ideale Erfassungsbildrate zellulären Geschwindigkeit zu bestimmen, innerhalb des Rückenmarks ist ungefähr 1 Rahmen / sec.
      HINWEIS: Imaging-Einstellungen können auf individuelle Benutzereinstellungen, wie beispielsweise Erfassungsbildrate, Bildauflösung und Bildmengen geändert werden. Größere Bildmengen werden in der Regel länger, um in einem giv erwerbenen Auflösung.
    3. Analysieren, Ernte, glatt und Pseudoslidebook-Bilddateien mit Bildanalyse-Software wie Bitplane Imaris 7.7. Produzieren letzte Zeitraffer-Videos durch Kämmen aufeinanderfolgenden Bildgebungsvolumen mittels eines automatisierten Verfahrens in Slidebook und Imaris.

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Ergebnisse

Während die explantiert Rückenmark Bildgebungsprotokoll kann verwendet werden, um jede Fluoreszenz innerhalb des Rückenmarks zu visualisieren, unser Vertreter Ergebnisse zeigen eGFP-NPC-Interaktionen mit eYFP-Axone. Zunächst zeigen wir die eingebetteten ventralen Rückenmark Zubereitung in 1A. Als nächstes zeigen wir die 2P Mikroskopaufbau und Schlüsselkomponenten in der 1B, Fig. 2 zeigt eGFP und eYFP Fluoreszenz in einem Z-Stapel innerhalb des ventralen Rückenmark. Erwerb ...

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Diskussion

Echtzeit-2P Bildgebung von intaktem Gewebe ist erforderlich, um NPC Kinetik und Interaktionen nach der Transplantation in die demyelinisierten Maus Rückenmark zu untersuchen. Intravital Imaging-2P wird häufig verwendet, um zelluläre Dynamik auf der Rückenseite des Rückenmarks in lebenden Mäusen zu bestimmen und wurde genutzt, um Rücken Demyelinisierung in demyelinisierende Erkrankung 17-19 studieren. Da transplantierte NPCs wandern zur ventralen weißen Substanz, die zu tief, um Bild in situ mit 2P-Mik...

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Offenlegungen

The authors have no competing interests.

Danksagungen

This work was supported in part by National Institutes of Health (NIH) Grants R01 GM-41514 (to M.D.C.), R39 GM-048071 (to I.P.), and R01 NS-074987 (to T.E.L.) and the National Multiple Sclerosis Society (NMSS) Collaborative Center Research Award CA1058-A-8 (to C.M.W., T.E.L. and M.D.C.), NMSS Grant RG4925, NIH Training Grant T32-AI-060573 (to M.L.G.), NMSS Postdoctoral Fellowship FG 1960-A-1 (to J.G.W.), and funding from the George E. Hewitt Foundation for Medical Research (M.P.M.).

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Isoflurane, USPPiramal Critical Care, IncN/A
Fine scissorsFine Science Tools14060-09sharp
scalpel blade #10Fine Science Tools10010-00
scalpel handleFine Science Tools10003-12
Luer rongeursFine Science Tools16001-15
Graefe forcepsFine Science Tools11052-10
Vannas scissorsFine Science Tools15615-08
scalpel blade #11Fine Science Tools10011-00
RPMI-1640Gibco12-115F
agarose, low gelling temperatureSigmaA9414-25G
ParafilmFisher Scientific13-374-12
Vetbond (tissue adhesive)3M1469SB
22 mm square cover slipFisher Scientific12-547
25X dipping objective, 1.1 NANikonCFI Apo LWD 25XW
Single inline solution heaterWarner Instruments64-0102
520 nm single-edge dichroic beam splitterSemrockFF520-Di02-25x36Brightline
560 nm single-edge dichroic beam splitterSemrockFF560-FDi01-25x36Brightline
photomultiplier tubesHamamatsuR928
C/L variable-speed tubing pumpMasterflex77122-22
digital thermometerComar Instruments3501
Chameleon Ultra Ti:Sapphire laser CoherentN/A
Slidebook 6 software3iN/A
Imaris 7.7 softwareBitplaneN/A

Referenzen

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