Los andamios compuestos de fibras interfacial Polyelectrolyte para lanzamiento Temporalmente controlada de biomoléculas

Resumen

Scaffolds for tissue engineering need to recapitulate the complex biochemical and biophysical microenvironment of the cellular niche. Here, we show the use of interfacial polyelectrolyte complexation fibers as a platform to create composite, multi-component polymeric scaffolds with sustained biochemical release.

Resumen

Various scaffolds used in tissue engineering require a controlled biochemical environment to mimic the physiological cell niche. Interfacial polyelectrolyte complexation (IPC) fibers can be used for controlled delivery of various biological agents such as small molecule drugs, cells, proteins and growth factors. The simplicity of the methodology in making IPC fibers gives flexibility in its application for controlled biomolecule delivery. Here, we describe a method of incorporating IPC fibers into two different polymeric scaffolds, hydrophilic polysaccharide and hydrophobic polycaprolactone, to create a multi-component composite scaffold. We showed that IPC fibers can be easily embedded into these polymeric structures, enhancing the capability for sustained release and improved preservation of biomolecules. We also created a composite polymeric scaffold with topographical cues and sustained biochemical release that can have synergistic effects on cell behavior. Composite polymeric scaffolds with IPC fibers represent a novel and simple method of recreating the cellular niche.

Introducción

The extracellular matrix has inherent biochemical and biophysical cues that direct cell behaviors. Mimicking this physiological three-dimensional (3D) microenvironment is a widely explored strategy for regenerative medicine and tissue engineering applications. For example, both naturally-derived and synthetic substrates have been modified with topographical cues as a means to mimic the biophysical cellular environment.¹ For example, polycaprolactone (PCL) scaffolds can be easily patterned by casting on patterned PDMS substrates.² However, most synthetic scaffolds inadequately recapitulate the controlled biochemical environment in vivo. Bulk or surface modification of synthetic materials only present biochemical cues for cell attachment but still lack temporal regulation of biochemical delivery.³ Thus, there is a need for optimal scaffolds that can mimic the temporally regulated biochemical delivery system of the extracellular matrix.

Biochemical delivery systems such as microspheres are plagued by problems of loss of bioactivity and low incorporation efficiency due to the severity and complexity of multi-step synthesis process.^4-6 Alternative methods that use a one-step fabrication and incorporation method were proven to have excellent potential to create a favorable biochemical microenvironment without the accompanying inefficiency in incorporation and loss of bioactivity. One viable solution is the use of interfacial polyelectrolyte complexation (IPC) fibers to deliver and protect biological agents. When two oppositely charged polyelectrolyte aqueous solutions are brought together, IPC fibers can be drawn out from the interface. Virtually any type of hydrophlic biomolecule in aqueous solution can be added into either the negatively- or positively-charged polyelectrolyte solution, thus facilitating the incorporation of useful biomolecules into the IPC fiber during the complexation process. Furthermore, this process only requires aqueous and ambient conditions, thereby decreasing the risk of loss of bioactivity. Using this method, active growth factors^2,7 even cells^8,9 have been successfully delivered. In addition, the simple method of forming IPC fibers allows molding into any shape or orientation. The stability of such fibers has been advantageous in its incorporation into both hydrophobic² and hydrophilic polymers⁷ to create composite scaffolds. These composite scaffolds with IPC fibers are beneficial for creating a physiologically relevant biochemical environment while providing physical anchorage for cells.

In this study, we show a method to incorporate IPC fibers into a hydrophilic and a hydrophobic scaffold with topography for controlled release of active biomolecules. As a proof-of-concept, we incorporate IPC fibers made from chitosan and alginate into the biocompatible, non-immunogenic and non-antigenic pullulan-dextran hydrophilic hydrogel or the biocompatible polycaprolactone hydrophobic scaffold.

Protocolo

1. Preparación de Soluciones Polyelectrolyte

1. Purificar quitosano, como se detalla en Liao et al. Brevemente, crear un 1% (w / v) de solución de quitosano en 2% (v / v) de filtro de ácido acético y vacío usando papel de filtro de grado 93. Neutralizar el filtrado usando NaOH 5 M hasta que el pH se estabilizó a 7. Centrifugar el quitosano precipitado a 1200 xg durante 10 min. Decantar el sobrenadante y añadir agua desionizada para lavar el quitosano. Repetir la etapa de centrifugación y lavado dos veces más. Congelar el quitosano precipitado a -80 ° C y se liofiliza O / N para obtener la forma purificada. Guarde quitosano purificada en un armario deshumidificado.
2. Pesar 1 g de quitosano purificado en una placa de cultivo de tejido estéril. Coloque el quitosano en el cultivo de tejidos plato tan cerca como sea posible a la lámpara UV en la cabina de seguridad biológica y exponer a luz UV durante 15 min. Con unas pinzas estériles, coloque el quitosano esterilizados en un recipiente de vidrio. Disolver quitosano utilizando filtró 0.15M ácido acético a una concentración final entre 0,5% y 1% (w / v).
3. Pesar 0,1 g de sal sódica del ácido algínico y disolver en 10 ml agua desionizada (DDI) de agua destilada para obtener un 1% (w / v) solución. Mezclar la sal sódica del ácido algínico durante al menos 2 horas en el mezclador de vórtice para asegurar la disolución completa. Se filtra la solución de alginato a través de filtro de jeringa de 0,2 micras. Guarde la solución de alginato a 4 ° C.
4. Reconstituir factores recombinantes humanas de crecimiento como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) o beta - factor de crecimiento nervioso (NGF), según lo recomendado por el fabricante.

2. Dibujo de Fibras IPC

1. Mezclar proteínas, factores de crecimiento u otras biomoléculas en 10-20 l alícuota de la solución de polielectrolito que tiene una carga neta similar. Las moléculas biológicas con carga negativa (por ejemplo, albúmina de suero bovino [BSA]) net deben mezclarse con la solución de alginato. Las moléculas biológicas con carga positiva neta (por ejemplo, VEGF) se deben mezclar consolución de quitosano.
2. Coloque pequeñas alícuotas (10-20 mu l) de quitosano y alginato en una superficie plana y estable que está cubierta con parafilm. Las gotitas de quitosano y alginato deben ser colocados en estrecha proximidad pero no en contacto uno con el otro.
3. Ligeramente moje cada punta en un par de pinzas en las gotitas de quitosano y alginato. Traiga las gotitas de polielectrolitos juntos pellizcando los fórceps. Cuando las gotas entran en contacto uno con el otro, tire lentamente el fórceps verticalmente hacia arriba para extraer la fibra IPC desde la interfaz de las dos gotas (figura 1A).
4. Coloque con cuidado el extremo de la fibra IPC dibujado en la pinza en un colector, como un andamio polimérica plana colocada sobre un mandril giratorio (véase la sección 3 y 4). Girar el mandril a una velocidad fija de 10 mm / seg para permitir la formación de fibras uniforme y beadless IPC. El aumento de la velocidad de dibujo las fibras IPC formar perlas, lo que provocará una liberación por reventamiento de incorporadoterminación de fibra bioquímica y prematura. ¹⁰
5. Para determinar la eficiencia de incorporación, recoger todos los líquidos restantes quedan en el Parafilm diluyendo con 500 l de 1X tampón fosfato salino (PBS). Mida el contenido de proteína o factor de crecimiento en el residuo a través de ensayo BCA (para BSA), ELISA (por VEGF y NGF) o un ensayo apropiado para detectar biomolécula incorporado.

3. Fabricación de Compuesto de hidrogel Cadalso de pululano-dextrano (PD) Polisacárido y Fibras IPC

1. Fabricación marco pululano sacrificio para la recolección de fibra IPC
   1. Pesar polisacárido pululano y mezclar con agua desionizada destilada (DDI) agua para crear un 20% (w / v) solución acuosa. Mezclar la solución de pululano O / N para asegurar la homogeneidad.
   2. Reparto de 15 g de solución de pululano en un 10 cm de diámetro de cultivo de tejidos de poliestireno (TCPS) plato. Secar la solución de pululano O / N a 37 ° C. Cortar las películas de pululano en 7mm x 7 mm marcos cuadrados.
2. Preparación de solución de polisacárido pululano-dextrano
   1. Crear un 30% (w / v) solución de los polisacáridos pululano y dextrano (3: 1 ratio) en agua DDI. Mezclar O / N para asegurar la homogeneidad de la solución de polisacárido. Añadir lentamente en bicarbonato de sodio a la solución de polisacárido para lograr una concentración final de 20% (w / v). Mezclar O / N para asegurar la homogeneidad de la solución. Guarde la solución de polisacárido a 4 ° C.
3. Recogida de fibras IPC en marco pululano
   1. Fije el bastidor pululano sacrificial (sección 3.1) utilizando una pinza. Pegar la pinza de cocodrilo y el marco de pululano en el extremo del mandril giratorio con cinta adhesiva recubierta de plástico. Girar el mandril con el marco fijada a una velocidad constante de 10 mm / seg. El marco de pululano se puede fijar sobre el mandril giratorio en orientaciones deseadas.
4. Dibuje las fibras IPC utilizando un par de pinzas (sección 1) y ATTACh al final elaborado de las fibras del IPC sobre el marco pululano rotativo. Dibuje las fibras IPC a una velocidad constante. Al llegar a la terminal de la fibra de IPC, secar el constructo O fibras sobre bastidor / N a temperatura ambiente.
5. Incorporación de fibras IPC en andamio hidrogel PD
6. Para reticular cada gramo de solución de pululano dextrano, añadir 100 l de 11% (w / v) de sodio trimetafosfato solución acuosa y 100 l de hidróxido de sodio 10M. ⁷ Mezclar la solución a 60 rpm utilizando una placa agitadora durante 1 a 2 min. Después de la adición de trimetafosfato de sodio y el hidróxido de sodio, la solución de polisacárido se reticular casi inmediatamente. Vierta la solución de polisacárido viscoso en la construcción fibras sobre bastidor para incrustar totalmente las fibras del IPC. Incubar las fibras pululano-dextrano-IPC combinados (PD-IPC) a 60 ° C durante 30 minutos para formar una andamios compuestos químicamente reticulado (Figura 1B).
7. PRECAUCIÓN: Siga el paso 3.3.2 en la campana de extracción y el uso de equi protección adecuadopo como ácido acético es un corrosivo e inflamable.
8. Para inducir la formación de poros en el andamio PD-IPC, sumergir todo el andamio en 20% (w / v) de ácido acético durante 20 min.
9. Retire los reactivos que no han reaccionado por lavado andamios-PD IPC en 1X PBS durante 5 min con agitación a 100 rpm. Repita este paso 2 veces.
10. Retire el exceso de PBS y congelar inmediatamente los andamios-PD IPC a -80 ° CO / N. Liofilizar los andamios de al menos 24 horas antes de su uso en cualquier ensayos de liberación o bioactividad controladas.

4. Fabricación de Andamios Compuesto de PCL y Fibras IPC

PRECAUCIÓN: El diclorometano es un material peligroso. Utilice la campana de humos y equipo de protección personal al manipular diclorometano.

1. Creación de sustratos PDMS prístinas y estampados
   1. Crear un polidimetilsiloxano prístina (PDMS) de sustrato elastomérico con un trozo de TCPS de dimensión deseada utilizando el proceso de litografía blanda. Crear pattePDMS rned sustratos mediante el uso de métodos litográficos suaves estándar en poli (metacrilato de metilo) plantillas con la topografía deseada. ¹²
2. La fabricación de sacrificio marco PCL para la recolección de fibra IPC
   1. Pesar PCL y disolver en diclorometano para crear un 0,9% (w / v) solución. Por cada 1 cm ² área del sustrato PDMS, la caída de 500 l de solución PCL 0,9%. Permitir todo el disolvente diclorometano se evapore completamente en la campana de humos. Repetir el proceso de fundición 0,9% PCL para espesar la película hasta el grosor deseado. Retire la película PCL secado del sustrato PDMS. Crear un agujero en el marco de PCL utilizando un golpeador de dimensiones adecuadas. ²
3. El cobro de las fibras del IPC en el marco de PCL
   1. Fije el bastidor PCL sacrificial con el agujero (de 4.2.1) en una pinza. Pegue la pinza sobre el mandril de rotación mediante el uso de cinta adhesiva recubierta de plástico. Conecte el extremo del trazado de la fibra del IPC en el fram PCLe antes de iniciar la rotación a una velocidad constante de 10 mm / seg (sección 2). Tras el final de dibujo fibra IPC, secar la fibra sobre bastidor constructo O / N a 4 ° C.
4. Incorporación de fibra sobre bastidor construir en el sustrato PCL con dibujos
   1. Caída de 500 l de solución PCL 0,9% sobre el sustrato PDMS para crear una base de PCL prístina o modelado, según se requiera. Reparto de múltiples capas de solución PCL 0,9% para obtener un andamio con el espesor deseado. Permitir todo el disolvente diclorometano se evapore completamente en la campana de humos.
   2. Coloque la construcción de fibra sobre bastidor (sección 4.3.1) en la parte superior de la base de PCL. Añadir solución PCL 0,9% en los de fibra sobre bastidor construir varias veces para obtener el espesor deseado e incrustar totalmente las fibras de la CIP, la fabricación de un armazón de material compuesto PCL-IPC (Figura 1C).

5. Medición de la liberación de agentes biológicos del compuesto IPC Andamios

1. Coloque compuesta PD-IPC oAndamios PCL-IPC y autónomos fibras IPC por separado en una placa de 24 pocillos.
2. Sumerja el andamio y autónomos fibras IPC con 500 l de PBS 1X. Incubar las muestras a 37 ° C. Recoger PBS en diversos puntos temporales (medios de liberación) y reemplazar con 500 l de PBS 1X.
3. Medir la cantidad de proteína o factor de crecimiento en los medios de liberación usando un ensayo de BCA (BSA), ELISA (VEGF y NGF) u otro ensayo apropiado para calcular el perfil de liberación acumulativo para la biomolécula incorporado.

6. La siembra de células en compuestos Andamios IPC para probar bioactividad de Agentes Biológicos Liberadas

1. Esterilizar los andamios compuestos liofilizados PD-IPC o PCL-IPC utilizando luz UV en la cabina de seguridad biológica durante al menos 20 min.
2. Usar técnicas de cultivo celular estándar para obtener una suspensión celular de 2 x 10 ⁵ células en medios de crecimiento 200 l. Semillas de la suspensión celular concentrada en los andamios compuestos. After 20 min, recarga el volumen de medio de cultivo para sumergir totalmente los andamios.
3. Medir la actividad celular a través de técnicas estándar, tales como ensayo de actividad de Alamar azul metabólica, ensayo de crecimiento de neuritas PC12 o inmunofluorescencia.

Resultados

En este artículo, hemos tratado de crear los andamios compuestos con fibras de IPC para la liberación sostenida de diversas biomoléculas. Características de las biomoléculas utilizados en este estudio se encuentran en la Tabla 1. IPC fibras se incrustaron primero en un hidrogel hidrófilo PD para crear un armazón de material compuesto PD-IPC (Figura 1B). Molécula Modelo BSA fue probado primero para determinar la viabilidad de utilizar un armazón de material compuesto para la lib...

Discusión

IPC fibras se forman por la interacción de dos polielectrolitos con cargas opuestas. El proceso utiliza la extracción del complejo desde la interfaz de los polielectrolitos, facilitando un proceso de autoensamblaje para la formación de fibras estable. El mecanismo de formación de la fibra IPC asegura que cualquier biomolécula añadió en un polielectrolito cargado de manera similar se puede incorporar durante el proceso de complejación. ^10,11 A la inversa, la adición de una biomolécula en el polielect...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pullulan	Hayashibara Inc Okayama Japan		Molecular weight (MW) 200 kDa. This material is pharmaceutical grade pullulan used to make pullulan frames and PD-IPC scaffolds.
Dextran	Sigma Aldrich	D1037	MW 500 kDa. This material is no longer being produced by Sigma Aldrich. Alternative suggested is catalog number 31392 (Sigma Aldrich). This material is used to make PD-IPC scaffolds.
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761	Sodium bicarbonate must be slowly added to the pullulan-dextran polysaccharide solution. Rapid addition of sodium bicarbonate will result in precipitation.
Sodium Trimetaphosphate	Sigma Aldrich	T5508	This chemical is hygroscopic and must be stored in the dehumidifying cabinet. Aqueous solution of sodium trimetaphosphate must always be made fresh.
Sodium Hydroxide	Sigma Aldrich	S5881	This material is hazardous and must be handled with proper protective equipment such as nitrile gloves.
Chitosan	Sigma Aldrich	448877	MW 190-310 kDa. Acetylation degree of 75% to 85%. Purification of chitosan is required to create stable IPC fibers.
Acetic Acid	Merck		This can be replaced by another brand type. This material is corrosive and flammable. Protective equipment such as face shield, nitrile gloves, lab coat and shoe cover must be worn when handling this chemical in the fume hood.
Alginic acid sodium salt from brown algae, low viscosity	Sigma Aldrich	A2158	Dissolve in water overnight. Filter through sterile 0.2 µm syringe filter before use. Store at 4 °C.
Bovine Serum Albumin	Sinopharm Chemical Reagent		Dissolve in sterile PBS and filter using 0.2 µm syringe filter before use.
BCA assay kit	Pierce	23225	This kit was used to measure BSA release from PD-IPC scaffolds.
Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor	R&D systems	293-VE	Dissolve growth factor in 0.2% heparin solution to a final concentration of 5 mg/ml.
Heparin Sodium Salt From Porcine	Sigma Aldrich	H3393	This can be replaced by another brand type. Dissolve heparin salt in sterile water at a final concentration of 1% and filter through 0.2 µm syringe filter before use.
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)	Lonza	C2517A	This primary cell type was used in the assay to determine VEGF bioactivity after release from PD-IPC scaffolds.
Alamar blue	Life Technologies	DAL1025	This is used to measure cell metabolic activity. Incubate Alamar blue with cells and maintain in standard cell culture conditions for 2 to 4 hours. Measure absorbance at 570 nm to determine Alamar blue percent reduction, which is correlated to the cell activity.
ScanVac Coolsafe Lyophilizer	Labogene	7.001.200.060	This is a non-programmable freeze dryer that operates at -105 to -110 °C. This can be replaced by other standard lab lyophilizers.
Polycaprolactone (PCL)	Sigma Aldrich	181609	MW 65 kDa. This is no longer being manufactured by Sigma Aldrich. This can be replaced by Sigma Aldrich catalog number 704105.
Dichloromethane	Sigma Aldrich	V800151	This can be replaced by another brand type. This material is hazardous and must be handled in the fume hood. Protective equipment must be worn at all times when handling this chemical.
Polydimethylsiloxane (PDMS; 184 Silicone Elastomer Kit)	Dow Corning	(240)4019862	The elastomer kit comes with polymer base and crosslinker. Mixing the polymer base and crosslinker in different ratios will result in different stiffness of the PDMS.
Human Recombinant Beta-Nerve Growth Factor (NGF)	R&D systems	256-GF	Reconstituted in sterile DI water to a final concentration of 100 µg⁠/⁠ml. Aliquot and store in -20 °C until use.
Human Mesenchymal Stem Cells (hMSC)	Cambrex		This cell type was used in the assay to determine synergistic effect of NGF and nanotopography.
Rat PC12 Pheochromocytoma Cells	ATCC		This cell type was used in the neurite outgrowth assay to determine bioactivity of NGF. After exposure to release media with NGF, measure number of cells with neurite extensions and normalize to total number of cells.
Grade 93 filter paper	Whatman	Z699675	This is used for the purification of chitosan after its precipitation with sodium hydroxide at pH 7.
Swing bucket centrifuge	Eppendorf	5810R	To be used during the purification of chitosan using 1,200 x g speed.
Motor with mandrel rotating at constant speed	Rhymebus	RM5E	The motor is used for the fabrication of IPC fibers on pullulan or PCL frame.
Phosphate buffered saline	FirstBase		Sterilize through filtration (0.2 µm filter) and autoclave.
10-mm diameter Tissue Culture Polystyrene Dish (TCPS)	Greiner		The TCPS dish is used for casting of pullulan frame.
Human VEGF ELISA kit	R&D systems	DVE00	The ELISA kit is used for detection of VEGF in the release medium.
Human NGF ELISA kit	R&D systems	DY256	The ELISA kit is used for detection of NGF in the release medium.
Plastic Coated Adhesive Tape	Bel-Art	9040336	The adhesive tape is used to securely stick the alligator clip to the rotating mandrel