生体分子の時間的に制御された放出のための界面高分子電解質繊維の複合足場

要約

Scaffolds for tissue engineering need to recapitulate the complex biochemical and biophysical microenvironment of the cellular niche. Here, we show the use of interfacial polyelectrolyte complexation fibers as a platform to create composite, multi-component polymeric scaffolds with sustained biochemical release.

要約

Various scaffolds used in tissue engineering require a controlled biochemical environment to mimic the physiological cell niche. Interfacial polyelectrolyte complexation (IPC) fibers can be used for controlled delivery of various biological agents such as small molecule drugs, cells, proteins and growth factors. The simplicity of the methodology in making IPC fibers gives flexibility in its application for controlled biomolecule delivery. Here, we describe a method of incorporating IPC fibers into two different polymeric scaffolds, hydrophilic polysaccharide and hydrophobic polycaprolactone, to create a multi-component composite scaffold. We showed that IPC fibers can be easily embedded into these polymeric structures, enhancing the capability for sustained release and improved preservation of biomolecules. We also created a composite polymeric scaffold with topographical cues and sustained biochemical release that can have synergistic effects on cell behavior. Composite polymeric scaffolds with IPC fibers represent a novel and simple method of recreating the cellular niche.

概要

The extracellular matrix has inherent biochemical and biophysical cues that direct cell behaviors. Mimicking this physiological three-dimensional (3D) microenvironment is a widely explored strategy for regenerative medicine and tissue engineering applications. For example, both naturally-derived and synthetic substrates have been modified with topographical cues as a means to mimic the biophysical cellular environment.¹ For example, polycaprolactone (PCL) scaffolds can be easily patterned by casting on patterned PDMS substrates.² However, most synthetic scaffolds inadequately recapitulate the controlled biochemical environment in vivo. Bulk or surface modification of synthetic materials only present biochemical cues for cell attachment but still lack temporal regulation of biochemical delivery.³ Thus, there is a need for optimal scaffolds that can mimic the temporally regulated biochemical delivery system of the extracellular matrix.

Biochemical delivery systems such as microspheres are plagued by problems of loss of bioactivity and low incorporation efficiency due to the severity and complexity of multi-step synthesis process.^4-6 Alternative methods that use a one-step fabrication and incorporation method were proven to have excellent potential to create a favorable biochemical microenvironment without the accompanying inefficiency in incorporation and loss of bioactivity. One viable solution is the use of interfacial polyelectrolyte complexation (IPC) fibers to deliver and protect biological agents. When two oppositely charged polyelectrolyte aqueous solutions are brought together, IPC fibers can be drawn out from the interface. Virtually any type of hydrophlic biomolecule in aqueous solution can be added into either the negatively- or positively-charged polyelectrolyte solution, thus facilitating the incorporation of useful biomolecules into the IPC fiber during the complexation process. Furthermore, this process only requires aqueous and ambient conditions, thereby decreasing the risk of loss of bioactivity. Using this method, active growth factors^2,7 even cells^8,9 have been successfully delivered. In addition, the simple method of forming IPC fibers allows molding into any shape or orientation. The stability of such fibers has been advantageous in its incorporation into both hydrophobic² and hydrophilic polymers⁷ to create composite scaffolds. These composite scaffolds with IPC fibers are beneficial for creating a physiologically relevant biochemical environment while providing physical anchorage for cells.

In this study, we show a method to incorporate IPC fibers into a hydrophilic and a hydrophobic scaffold with topography for controlled release of active biomolecules. As a proof-of-concept, we incorporate IPC fibers made from chitosan and alginate into the biocompatible, non-immunogenic and non-antigenic pullulan-dextran hydrophilic hydrogel or the biocompatible polycaprolactone hydrophobic scaffold.

プロトコル

高分子電解質溶液の調製

1. 簡単に言えば。リャオらに詳述されるように、キトサンを精製し、グレード93濾紙を使用して、2％キトサンの1％（w / v）の溶液（v / v）の酢酸、真空フィルタを作成します。 pHは10分間1200×gで7遠心沈殿したキトサンに安定するまで5MのNaOHを使用して、ろ液を中和します。上清を除去し、キトサンを洗浄し、脱イオン水を加えます。遠心分離および洗浄工程をさらに2回繰り返します。 -80℃で析出したキトサンを凍結し、精製された形態を得るために、O / Nを凍結乾燥。除湿されたキャビネットに精製されたキトサンを保管してください。
2. 無菌の組織培養皿に精製されたキトサン1gを量り分けます。生物学的安全キャビネット内のUVランプにできるだけ近い組織培養皿にキトサンを置き、15分間UV光にさらします。滅菌ピンセットを使用し、ガラス容器に滅菌キトサンを配置します。 0を使用して濾過し、キトサンを溶解します。（w / v）の0.5％と1％の間の最終濃度15M酢酸。
3. アルギン酸ナトリウム塩を0.1gを秤量し、1％（w / v）の溶液を得、脱イオン（DDI）を蒸留水10mlに溶解します。完全な溶解を確実にするために、ボルテックスミキサー上に少なくとも2時間、アルギン酸ナトリウム塩を混ぜます。 0.2μmのシリンジフィルターを通してアルギン酸塩溶液をフィルタリングします。 4℃でのアルギン酸塩溶液を保管してください。
4. 製造業者によって推奨されるように、神経成長因子（NGF）、 - 例えば、血管内皮増殖因子（VEGF）またはベータなどのヒト組換え増殖因子を再構成します。

IPC繊維の2デッサン

1. 同様の正味の電荷を有する高分子電解質溶液の10〜20μlのアリコートに、タンパク質、成長因子または他の生体分子を混ぜます。正味の負電荷（例えば、ウシ血清アルブミン[BSA]）との生物学的分子は、アルギン酸塩溶液と混合されるべきです。正味の正電荷（例えば、VEGF）と生体分子と混合されるべきですキトサン溶液。
2. パラフィルムで覆われている安定した平らな面にキトサンおよびアルギン酸塩の少量のアリコート（10〜20μl）を配置します。キトサンおよびアルギン酸塩の液滴が近接していないが、互いに接触して配置されるべきです。
3. 軽くキトサンおよびアルギン酸液滴に鉗子のペアで各チップを浸します。鉗子をつまんで一緒に高分子電解質の液滴をもたらします。液滴が互いに接触すると、ゆっくりと2滴（ 図1A）の界面からIPC繊維を描画するために垂直上方鉗子を引きます。
4. （セクション3と4を参照）、このような回転マンドレル上に固定された平らな高分子足場として集電体上に鉗子、上に描かれたIPCのファイバの端部を慎重に配置します。均一のとIPC繊維ビードレス形成を可能にするために10ミリメートル/秒の一定速度でマンドレルを回転させます。 IPC繊維の描画速度を増加させると、Incorporatedのバースト放出の原因となる、ビーズを形成します生化学的および早期ファイバ終端^。10
5. 取り込み効率を決定するために、残りのすべての液体が1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を500μlで希釈して、パラフィルム上に残さ集めます。 BCAの（BSAのための）アッセイ、（VEGFおよびNGFのための）ELISAまたは組み込まれた生体分子を検出するための適切なアッセイを介して残留物中のタンパク質または成長因子の含有量を測定します。

プルラン、デキストラン（PD）多糖類とIPC繊維の複合ヒドロゲル足場の3製作

1. IPC繊維コレクションの犠牲プルランフレームを製作
   1. プルラン多糖を秤量し、20％（w / v）の水溶液を作成するために、蒸留脱イオン（DDI）水と混ぜます。均一性を確保するためにプルラン溶液O / Nを混ぜます。
   2. 直径10cmの組織培養ポリスチレン（TCPS）皿にプルラン溶液の15グラムをキャストします。 37℃でのプルラン溶液O / Nを乾燥させます。 7へのプルランフィルムをカット×7 mm角フレームミリ。
2. プルラン、デキストラン多糖溶液を調製します
   1. DDI水中：（1比3）プルランおよびデキストラン多糖の30％（w / v）の溶液を作成します。多糖溶液の均一性を確保するために、O / Nを混ぜます。ゆっくりと（w / v）の20％の最終濃度を達成するために、多糖溶液に炭酸水素ナトリウムを追加。溶液の均一性を確保するために、O / Nを混ぜます。 4℃での多糖溶液を保管してください。
3. プルランフレームにIPC繊維の収集
   1. ワニ口クリップを使用して犠牲プルランフレーム（3.1節）を貼り付けます。プラスチック被覆粘着テープを使用して、回転マンドレルの先端にワニ口クリップとプルラン枠を貼り付けます。 10ミリメートル/秒の一定速度で取り付けられたフレームと、マンドレルを回転させます。プルランフレームは、所望の方向で回転するマンドレル上に固定することができます。
4. ピンセット（セクション1）とATTACを使用してIPC繊維を描きます時間回転プルランフレームにIPC繊維の描かれた終わり。一定速度でIPC繊維を描画します。 IPCファイバの終端に到達すると、RTでファイバ·オン·フレーム構築O / Nを乾燥させます。
5. PDヒドロゲル足場にIPC繊維を埋め込みます
6. プルラン、デキストラン溶液のすべてのグラムを架橋するために、ナトリウムトリメタホスフェート水溶液と100μlの10M水酸化ナトリウム（w / v）の11％の100μlを添加する^。7 1〜2分間stirplateを用いて60 rpmで溶液を混合。トリメタリン酸ナトリウムおよび水酸化ナトリウムを添加した後、多糖類溶液は、ほとんどすぐに架橋します。 IPC繊維を完全に埋め込むための繊維·オン·フレーム構造物上に粘性多糖溶液を注ぎます。化学架橋複合足場（ 図1B）を形成するために30分間60℃で混合プルラン、デキストランIPC繊維（PD-IPC）をインキュベートします。
7. 注意：ヒュームフードのステップ3.3.2を実行し、適切な保護エクイを使用酢酸等のpmentは腐食性、可燃性です。
8. PD-IPC足場における細孔の形成を誘導するために、20分間、20％（w / v）の酢酸を全体足場を沈めます。
9. 100rpmで振とうしながら5分間、1×PBSでPD-IPC足場を洗浄することにより未反応試薬を除去します。このステップを2回繰り返します。
10. 過剰のPBSを除去し、直ちに-80°CO / NでPD-IPC足場を凍結。足場に任意の制御放出または生物活性アッセイに使用する前に少なくとも24時間を凍結乾燥。

PCLおよびIPC繊維の複合骨格の4製作

注意：ジクロロメタンは危険物です。ジクロロメタンを取り扱う際にヒュームフードや個人用保護具を使用します。

1. 自然のままとパターン化PDMS基板を作成
   1. ソフトリソグラフィプロセスを使用して所望の寸法のTCPの一部を使用して、自然のままのポリジメチルシロキサン（PDMS）エラストマー基板を作成します。パットの作成希望の地形とテンプレートポリ（メチルメタクリレート）で、標準的なソフトリソグラフィ法を用いて、rned PDMS基板を¹²
2. IPC繊維収集のための犠牲PCLフレームを製作
   1. PCLを秤量し、（w / v）の溶液を、0.9％を作成するために、ジクロロメタンに溶解します。 PDMS基板の各1cm ^2の面積については、0.9％のPCL溶液500μlをドロップします。ジクロロメタン溶媒の全てが完全にドラフト内で蒸発することができます。所望の厚さに膜を厚くするために0.9％のPCLの鋳造プロセスを繰り返します。 PDMS基板から乾燥PCLフィルムを取り外します。適切にサイズのパンチャーを使用してPCLフレームに穴を作成します^。2
3. PCLフレームにIPC繊維の収集
   1. ワニ口クリップで（4.2.1）から穴犠牲PCLフレームを貼り付けます。プラスチック被覆粘着テープを使用して、回転マンドレル上にワニ口クリップを貼り付けます。 PCL FRAMにIPC繊維の描かれた端を取り付け10ミリメートル/秒（セクション2）の一定速度で回転を開始する前に、E。 IPC繊維描画終了後、4℃での繊維·オン·フレーム構造物O / Nを乾燥させます。
4. 埋め込み繊維·オン·フレームは、パターン化されたPCL基板内に構築します
   1. 必要に応じて、自然のままの、またはパターン化されたPCLベースを作成するために、PDMS基板上に0.9％のPCL溶液500μlをドロップします。所望の厚さの足場を得るために、0.9％のPCL溶液の複数の層をキャスト。ジクロロメタン溶媒の全てが完全にドラフト内で蒸発することができます。
   2. PCLベースの上に、繊維·オン·フレームの構築物（4.3.1）を配置します。所望の厚さを得るために複数回を構築するファイバ·オン·フレームの上に0.9％のPCL溶液を添加し、完全にPCL-IPC複合骨格（ 図1C）の製造、IPC繊維を埋め込 ​​みます。

コンポジットIPC足場からの生物学的薬剤の放出5.測定

1. 複合PD-IPCを置きますかPCL-IPC足場とスタンドアロンIPC繊維を別々に24ウェルプレート中。
2. 足場を浸し、スタンドアローンIPC繊維を1×PBSを500μlと。 37℃でサンプルをインキュベートします。種々の時点（リリースメディア）でPBSを収集し、1×PBSを500μlと交換してください。
3. 組み込まれた生体分子の累積放出プロフィールを計算するためにBCAアッセイ（BSA）、ELISA（VEGFおよびNGF）又は他の適切なアッセイを使用して、放出媒体中のタンパク質または成長因子の量を測定します。

コンポジットIPC足場上の細胞の6播種リリース生物学的薬剤の生物活性をテストします

1. 少なくとも20分間、生物学的安全キャビネット内のUV光を用いて凍結乾燥したPD-IPCまたはPCL-IPC複合足場を滅菌します。
2. 200μlの増殖培地中に2×10 ⁵細胞の細胞懸濁液を得るために、標準的な細胞培養技術を使用します。複合足場の上に濃縮された細胞懸濁液をシード。 AFTER 20分、完全に足場を水没する増殖培地のトップアップボリューム。
3. このようなアラマーブルー代謝活性アッセイ、PC12神経突起伸長アッセイまたは免疫蛍光などの標準的な技術を介して細胞活性を測定します。

結果

本稿では、様々な生体分子の持続放出のためのIPC繊維との複合足場を作成しようとしました。本研究で用いた生体分子の特性を表1に見出される。IPC繊維が最初PD-IPC複合足場（ 図1B）を作成するために、親水性PDヒドロゲル中に包埋しました。モデル分子BSAは、第1の被制御生体分子の放出のための複合足場を使用することの実現可能性を決定するために試験しました?...

ディスカッション

IPC繊維は、2つの反対に帯電した高分子電解質との相互作用によって形成されます。プロセスが安定した繊維形成のための自己組織化プロセスを容易にする、高分子電解質の界面からの複合体の抽出を利用します。 IPCの繊維形成の機構は同様に荷電した高分子電解質に添加される任意の生体分子は、錯体形成プロセス中に組み込むことができることを保証する^。10,11逆に、反対に荷電...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pullulan	Hayashibara Inc Okayama Japan		Molecular weight (MW) 200 kDa. This material is pharmaceutical grade pullulan used to make pullulan frames and PD-IPC scaffolds.
Dextran	Sigma Aldrich	D1037	MW 500 kDa. This material is no longer being produced by Sigma Aldrich. Alternative suggested is catalog number 31392 (Sigma Aldrich). This material is used to make PD-IPC scaffolds.
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761	Sodium bicarbonate must be slowly added to the pullulan-dextran polysaccharide solution. Rapid addition of sodium bicarbonate will result in precipitation.
Sodium Trimetaphosphate	Sigma Aldrich	T5508	This chemical is hygroscopic and must be stored in the dehumidifying cabinet. Aqueous solution of sodium trimetaphosphate must always be made fresh.
Sodium Hydroxide	Sigma Aldrich	S5881	This material is hazardous and must be handled with proper protective equipment such as nitrile gloves.
Chitosan	Sigma Aldrich	448877	MW 190-310 kDa. Acetylation degree of 75% to 85%. Purification of chitosan is required to create stable IPC fibers.
Acetic Acid	Merck		This can be replaced by another brand type. This material is corrosive and flammable. Protective equipment such as face shield, nitrile gloves, lab coat and shoe cover must be worn when handling this chemical in the fume hood.
Alginic acid sodium salt from brown algae, low viscosity	Sigma Aldrich	A2158	Dissolve in water overnight. Filter through sterile 0.2 µm syringe filter before use. Store at 4 °C.
Bovine Serum Albumin	Sinopharm Chemical Reagent		Dissolve in sterile PBS and filter using 0.2 µm syringe filter before use.
BCA assay kit	Pierce	23225	This kit was used to measure BSA release from PD-IPC scaffolds.
Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor	R&D systems	293-VE	Dissolve growth factor in 0.2% heparin solution to a final concentration of 5 mg/ml.
Heparin Sodium Salt From Porcine	Sigma Aldrich	H3393	This can be replaced by another brand type. Dissolve heparin salt in sterile water at a final concentration of 1% and filter through 0.2 µm syringe filter before use.
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)	Lonza	C2517A	This primary cell type was used in the assay to determine VEGF bioactivity after release from PD-IPC scaffolds.
Alamar blue	Life Technologies	DAL1025	This is used to measure cell metabolic activity. Incubate Alamar blue with cells and maintain in standard cell culture conditions for 2 to 4 hours. Measure absorbance at 570 nm to determine Alamar blue percent reduction, which is correlated to the cell activity.
ScanVac Coolsafe Lyophilizer	Labogene	7.001.200.060	This is a non-programmable freeze dryer that operates at -105 to -110 °C. This can be replaced by other standard lab lyophilizers.
Polycaprolactone (PCL)	Sigma Aldrich	181609	MW 65 kDa. This is no longer being manufactured by Sigma Aldrich. This can be replaced by Sigma Aldrich catalog number 704105.
Dichloromethane	Sigma Aldrich	V800151	This can be replaced by another brand type. This material is hazardous and must be handled in the fume hood. Protective equipment must be worn at all times when handling this chemical.
Polydimethylsiloxane (PDMS; 184 Silicone Elastomer Kit)	Dow Corning	(240)4019862	The elastomer kit comes with polymer base and crosslinker. Mixing the polymer base and crosslinker in different ratios will result in different stiffness of the PDMS.
Human Recombinant Beta-Nerve Growth Factor (NGF)	R&D systems	256-GF	Reconstituted in sterile DI water to a final concentration of 100 µg⁠/⁠ml. Aliquot and store in -20 °C until use.
Human Mesenchymal Stem Cells (hMSC)	Cambrex		This cell type was used in the assay to determine synergistic effect of NGF and nanotopography.
Rat PC12 Pheochromocytoma Cells	ATCC		This cell type was used in the neurite outgrowth assay to determine bioactivity of NGF. After exposure to release media with NGF, measure number of cells with neurite extensions and normalize to total number of cells.
Grade 93 filter paper	Whatman	Z699675	This is used for the purification of chitosan after its precipitation with sodium hydroxide at pH 7.
Swing bucket centrifuge	Eppendorf	5810R	To be used during the purification of chitosan using 1,200 x g speed.
Motor with mandrel rotating at constant speed	Rhymebus	RM5E	The motor is used for the fabrication of IPC fibers on pullulan or PCL frame.
Phosphate buffered saline	FirstBase		Sterilize through filtration (0.2 µm filter) and autoclave.
10-mm diameter Tissue Culture Polystyrene Dish (TCPS)	Greiner		The TCPS dish is used for casting of pullulan frame.
Human VEGF ELISA kit	R&D systems	DVE00	The ELISA kit is used for detection of VEGF in the release medium.
Human NGF ELISA kit	R&D systems	DY256	The ELISA kit is used for detection of NGF in the release medium.
Plastic Coated Adhesive Tape	Bel-Art	9040336	The adhesive tape is used to securely stick the alligator clip to the rotating mandrel