Lateral sistema inducible Raíz en<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Y maíz

Resumen

The Lateral Root Inducible System (LRIS) allows for synchronous induction of lateral roots and is presented for Arabidopsis thaliana and maize.

Resumen

Lateral root development contributes significantly to the root system, and hence is crucial for plant growth. The study of lateral root initiation is however tedious, because it occurs only in a few cells inside the root and in an unpredictable manner. To circumvent this problem, a Lateral Root Inducible System (LRIS) has been developed. By treating seedlings consecutively with an auxin transport inhibitor and a synthetic auxin, highly controlled lateral root initiation occurs synchronously in the primary root, allowing abundant sampling of a desired developmental stage. The LRIS has first been developed for Arabidopsis thaliana, but can be applied to other plants as well. Accordingly, it has been adapted for use in maize (Zea mays). A detailed overview of the different steps of the LRIS in both plants is given. The combination of this system with comparative transcriptomics made it possible to identify functional homologs of Arabidopsis lateral root initiation genes in other species as illustrated here for the CYCLIN B1;1 (CYCB1;1) cell cycle gene in maize. Finally, the principles that need to be taken into account when an LRIS is developed for other plant species are discussed.

Introducción

El sistema radicular es crucial para el crecimiento de las plantas, ya que asegura el anclaje y la absorción de agua y nutrientes del suelo. Debido a la expansión de un sistema de raíces se basa principalmente en la producción de raíces laterales, su iniciación y la formación se han estudiado ampliamente. Raíces laterales se inician en un subconjunto específico de células pericycle, llamadas células fundadoras ^1. En la mayoría de las dicotiledóneas, tales como Arabidopsis thaliana, estas células se encuentran en los polos protoxilema ^2, mientras que en las monocotiledóneas, tales como maíz, que se encuentran en los polos del floema ^3. Células fundadoras están marcados por un aumento de la respuesta auxina ^4, seguido por la expresión de genes específicos del ciclo celular (por ejemplo, ciclina B1; 1 / CYCB1; 1), después de lo cual se someten a una primera ronda de divisiones anticlinales asimétricos ^5. Después de una serie de divisiones anticlinales y periclinales coordinadas, se forma un primordio raíces laterales que finalmente emerger como un araíces laterales utonomous. La ubicación y el momento de la iniciación de las raíces laterales, sin embargo no son predecibles, ya que estos eventos no son ni abundantes ni sincronizada. Esto impide el uso de enfoques moleculares tales como la transcriptómica para estudiar este proceso.

Para hacer frente a esto, un sistema lateral inducible Root (LRIS) se ha desarrollado ^{6, 7.} En este sistema, las plántulas se tratan primero con N -1-naftilftalámico (NPA), que inhibe el transporte de auxina y la acumulación, en consecuencia, el bloqueo de la iniciación de las raíces laterales ^8. Por posteriormente transferir la plántula al medio que contiene la auxina sintética ácido acético 1-naftaleno (NAA), toda la capa periciclo responde a los niveles de auxina elevadas de ese modo masivamente raíz iniciar divisiones celulares laterales inductores ^6. Como tal, este sistema conduce a las raíces rápidos, síncronos y extensas iniciaciones laterales, permitiendo una fácil colección de muestras de raíces enriquecidos para una etapa específica en los últimos tiemposdesarrollo de las raíces ral. Posteriormente, estas muestras se pueden utilizar para determinar los perfiles de expresión de todo el genoma durante la formación de raíces laterales. El LRIS ha dado conocimiento ya significativa sobre la iniciación lateral raíces en Arabidopsis y maíz ^9-13, pero la necesidad de aplicar este sistema a otras especies de plantas se hace más evidente a medida que más genomas se secuencian y hay un interés creciente para transferir conocimientos a económica importante especies.

Aquí, se dan los protocolos detallados de la Arabidopsis y LRISs maíz. A continuación, se proporciona un ejemplo de la utilización del sistema, ilustrando cómo se pueden usar los datos obtenidos de la transcriptómica LRIS maíz para identificar homólogos funcionales que tienen una función conservada durante la iniciación de raíces laterales a través de diferentes especies de plantas. Por último, las directrices para optimizar la LRIS para se proponen otras especies de plantas.

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Protocolo

1. Arabidopsis Protocolo LRIS

Nota: El texto se refiere a "pequeños" o "grandes" experimentos a escala. Experimentos a pequeña escala, tales como el análisis de línea de marcador y la tinción histológica ^{6, 14,} requieren sólo unas pocas muestras. Experimentos a gran escala, tales como cuantitativa en tiempo real QRT-PCR, micro-arrays ^9-11 o de secuenciación de RNA, requieren una mayor cantidad de muestras. Como tal, una cantidad de ~ 1000 plántulas por muestra fue utilizado por Vanneste et al. ¹¹ para realizar microarray experimento después de la disección segmento de raíz.

DÍA 1

1. Esterilización de semillas de Arabidopsis
   Nota: Seleccione uno de los siguientes procedimientos para la esterilización de semillas. Cualquiera de ellos es adecuado para los siguientes pasos del protocolo. Esterilización de gas (1.1.2) presenta dos ventajas principales sobre la esterilización de líquidos (1.1.1): se tarda menos tiempo en el manejo de una gran entumecidaer de semillas, ya que ninguna de pipeteo tiene que ocurrir para las muestras individuales; y las semillas esterilizadas se pueden almacenar durante un período más largo. Sin embargo, requiere un desecador y un manejo cuidadoso.
   1. La esterilización de líquidos
      1. Vierta la cantidad deseada de semillas en tubos de microcentrífuga. Utilice un máximo de 20 mg (~ 800 semillas) en un tubo de 1,5 ml o 40 mg (~ 1600 semillas) en unos 2 ml tubos de microcentrífuga.
      2. Añadir 1 ml de etanol al 70%. Invertir o agite suavemente durante 2 min.
      3. Sustituir el 70% de etanol con 1 ml de solución de esterilización para 15 min. (Preparar la solución de esterilización fresca: 3,85 ml de hipoclorito de sodio (NaOCl) stock (12%) (PRECAUCIÓN: El uso de humos campana), 5 l de Tween 20, hasta 10 ml con agua invertir los tubos varias veces para asegurarse de que todas las semillas vienen. en contacto con la solución.
      4. En una cabina de flujo de aire laminar, sustituir la solución de esterilización con 1 ml de agua destilada estéril y enjuagar las semillas 5 veces durante 5 min por repetidaLy sustituir con 1 ml de agua destilada estéril fresco.
   2. Esterilización Gas
      1. Verter el número deseado de semillas en un tubo de microcentrífuga de 2 ml. Utilice tubos individuales cuando se trabaja con varias líneas independientes, y organizar los abrieron en una caja o soporte de plástico tubos de microcentrífuga. Si el número de semillas en un tubo excede 500 (12,5 mg), subdividir las semillas en el número apropiado de tubos para asegurar la esterilización exitosa. Asegúrese de que las tapas de los tubos vecinos no cubren unos a otros. Encajar la tapa de la caja en la parte inferior, ya que tiene que estar en el desecador, así como para la esterilización.
      2. Coloque la caja en el plato de un desecador, junto con un vaso de vidrio (PRECAUCIÓN: El uso de humos campana).
      3. Llenar el vaso de precipitados con 100 ml de 12% NaOCl (PRECAUCIÓN: Use campana extractora de gases). Ponga la tapa en el desecador, pero deja una pequeña abertura donde se coloca el vaso de precipitados.
      4. Añadir 3 ml de ácido clorhídrico al 37% (furioso) (CAUCIÓN: Uso humos campana) al vaso de precipitados a través de la pequeña abertura y cierre rápidamente el desecador. La burbuja voluntad solución para algún tiempo debido a la formación de Cl ₂ -gas. Deja el sistema cerrado O / N (o por lo menos 8 horas).
      5. Retire la tapa del desecador. Saque la caja y cubrirlo con la tapa para evitar la contaminación durante el transporte.
      6. Ponga la caja en una cabina de flujo laminar de aire, quitar la tapa y dejar las semillas durante aproximadamente 1 hora a RT para permitir la liberación de gas.
         Nota: Las semillas se pueden almacenar de forma segura en seco en tubos de microcentrífuga cerradas hasta por 2 semanas a 4 ° C.
2. La inducción de raíz lateral en Arabidopsis
   1. Lateral Raíz Inhibición (NPA Personal)
      1. Preparar medio de crecimiento para el crecimiento in vitro. El medio contiene medio de Murashige y Skoog de ​​fuerza mezcla de sal ^15, 0,1 g / L de mio-inositol, 10 g / L de sacarosa, y se tampona con 0,5g / L 2- (N-morfolino) etanosulfónico (MES).
      2. Ajustar el pH a 5,7 con 1 M de KOH. Añadir 8 g / L de agar tejido de la planta y el medio en autoclave durante 20 min a 121 ° C.
      3. Preparar una solución madre 25 mM de NPA en dimetilsulfóxido (DMSO) (PRECAUCIÓN: Use guantes). En una cabina de flujo de aire laminar, enfriar el medio en autoclave hasta aproximadamente 65 ° C (que es la temperatura a la que la botella se hace con la mano), y añadir 25 solución madre mM NPA para obtener una concentración final de 10 mM NPA.
      4. Homogeneizar la adición agitando suavemente la botella durante 10 segundos. Verter 50 ml de medio por placa de Petri cuadrada (12 cm x 12 cm).
         Nota: En caso de experimento a gran escala, aplicar una malla de nylon (20 micras) para garantizar la transferencia fácil. Preparar una malla (9 cm x 9 cm) por tratamiento en autoclave (Figura 1A). Cuando autoclave, aplicar la malla al medio de crecimiento con unas pinzas estériles (Figura 1B). Empuje suavemente la malla para el medio de cultivo utilizando un sterilized drigalsky para asegurarse de que está en buen contacto con el medio de crecimiento (Figura 1B) (PRECAUCIÓN: El trabajo en condiciones estériles).
      5. Siembre las semillas en los NPA placas.
         Nota: En caso de que se planea un experimento a gran escala, siembran 2 filas densas y bien alineados de 50 semillas para facilitar la toma de muestras (véase 1.2.2.3).
         1. En el caso de la esterilización líquido, sembrar las semillas en NPA placas utilizando una pipeta de 200 l. Corte 3 - 4 mm del final de las puntas de pipeteado en condiciones estériles (o antes de la esterilización de las puntas) con el fin de ser capaz de pipetear las semillas. Pipetear hacia arriba y abajo un par de veces para volver a suspender las semillas, a continuación pipetear agua aproximadamente 150 l estéril con 10 - 20 semillas y esperar hasta que el sedimento semillas en la parte inferior de la punta. (PRECAUCIÓN: El trabajo en condiciones estériles)
            Nota: Al tocar el agar o la malla suavemente con la punta, una gota de agua con una semilla se dará a conocer de ella (Figura 1C).
         2. En el caso de la esterilización por gas, sembrar las semillas usando autoclave toothpicks.Pinch el palillo de dientes en el agar antes de tomar las semillas para asegurar una superficie pegajosa. Recoge la semillas una por una con el palillo de dientes y distribuir las semillas en las placas (Figura 1D). Alternativamente, añadir agua estéril para las semillas y sembrar como se describe en 1.2.1.5.1 (PRECAUCIÓN: El trabajo en condiciones estériles).
      6. Sellar las placas con cinta adhesiva transpirable y almacenarlos placas a 4 ° C en la oscuridad durante al menos 2 días y un máximo de una semana. Esto es necesario para la estratificación y garantiza sincronizados y germinación más eficiente.
         Nota: Como alternativa, las semillas pueden ser estratificados antes de la siembra, se sumergieron en agua destilada en tubos micro-centrífuga, lo que requiere menos espacio en el refrigerador. En este caso, almacenar los tubos durante al menos una semana a 4 ° C, y se mueven las placas al gabinete crecimiento inmediatamente después de la siembra (véase 1.2.1.7).
         DÍA 3
      7. Mover las placas para el gabinete de crecimiento (luz continua (110 E · m ^-2 s ^-1), 21 ° C) durante 5 días (2 días de la germinación y 3 días de crecimiento) en una posición casi vertical (80 a 90 °) para garantizar el crecimiento de raíces en adelante, y no en el medio.
         DÍA 8
   2. Lateral Raíz de inducción (NAA Personal)
      1. Preparar el mismo medio de crecimiento como se describe en 1.2.1.1 y 1.2.1.2. Preparar una solución de 50 mM balance de NAA en DMSO (PRECAUCIÓN: Use guantes). Enfriar el medio en autoclave a 65 ° C y añadir una solución NAA al medio para obtener una concentración final de 10 mM NAA (PRECAUCIÓN: El trabajo en condiciones estériles).
         1. Homogeneizar la adición agitando suavemente la botella durante 10 segundos. Verter 50 ml de medio por placa de Petri cuadrada (12 cm x 12 cm).
      2. La transferencia de los plantones de las placas que contienen medio de cultivo suplementado con 10 mM NPA a los supcomplementado con 10 mM NAA.
         1. Enganche los brazos de pinzas curvas debajo de los cotiledones de la plántula y retire suavemente de la placa. Sólo transferir plantas de semillero de la cual las raíces han crecido totalmente en contacto con el medio NPA-crecimiento y, preferiblemente, hacia abajo.
         2. Rozar la raíz sobre la superficie del medio de crecimiento que contiene NAA-over una pequeña distancia. Asegúrese de que las raíces de las plantas están en buen contacto con el medio de crecimiento. Si es necesario, pulse la raíz suavemente a la superficie de medio de crecimiento con las pinzas.
            Nota: En caso de un experimento a gran escala, eliminar todas las plántulas que no están en contacto con la malla y la transferencia mediante el levantamiento de la malla en las dos esquinas superiores con unas pinzas. Asegúrese de que la malla está en buen contacto con el medio que contiene NAA-con una lectura rápida de la malla sobre la superficie del agar sobre una pequeña distancia (Figura 1E).
      3. Sellar las nuevas placas con cinta transpirable y colocarlos en el gabinete de crecimiento (conluz continua (110 E · m ^-2 s ^-1), 21 ° C) en posición vertical durante el tiempo deseado después de la inducción hasta el muestreo.
         Nota: En caso de un experimento a gran escala, el uso de un bisturí para cortar los segmentos de raíz todos a la vez directamente sobre la malla y probar ellos raspando suavemente la superficie de la malla.

2. LRIS Protocolo Maíz

1. Estratificación de maíz Núcleos
   1. Incubar los granos de maíz a 4 ° C en la oscuridad durante al menos 1 semana.
      Nota: Este protocolo se ha desarrollado utilizando la línea consanguínea B73 maíz.
2. Esterilización de maíz Núcleos
   DÍA 1
   Nota: Aunque las plántulas de maíz no tienen que ser cultivadas en condiciones estériles, se recomienda para esterilizar los granos de maíz y trabajar con material estéril para evitar el crecimiento de hongos en el rollo de papelsistema.
   1. Ponga el número necesario de granos de maíz en un vaso de precipitados de vidrio esterilizado.
   2. Añadir 100 ml de solución de esterilización (6% NaOCl en agua) (PRECAUCIÓN: El uso campana de humos).
   3. Añadir una barra de agitación magnética y colocar el vaso de precipitados sobre un agitador magnético a baja velocidad de agitación (aproximadamente 250 rpm) a temperatura ambiente durante 5 min.
   4. Enjuague cinco veces durante 5 min mediante la sustitución de la solución con 100 ml de agua estéril fresco.
3. Siembra de maíz Núcleos
   1. Póngase los guantes para reducir el riesgo de contaminación, y tomar un rollo de toallas de papel.
   2. Arranque dos tramos de papel de toalla de mano con una longitud total de dos hojas (aproximadamente 92 cm x 24 cm) y colocarlos en la parte superior de uno al otro en una superficie limpia (Figura 2).
   3. Doblar las hojas dobles en toda la longitud (aproximadamente 92 cm x 12 cm) (Figura 2A).
   4. Use pinzas para distribuir 10 núcleos en aproximadamente 2 cm de la parte superior sobre tque toda la longitud del papel, mientras se mantiene un espacio intermedio de 8 cm entre cada núcleo y 8 cm libre en ambos extremos (Figura 2B). Asegúrese de que la radícula del kernel esté hacia abajo y hacia el papel (Figura 2B).
   5. Rodar suavemente el papel en toda la longitud, manteniendo las semillas en su lugar (Figura 2B). Para facilitar la rodadura, es opcional para pulverizar primero el papel con agua estéril.
   6. Coloque los rollos de papel en tubos de vidrio esterilizados de unos 6 cm de diámetro y 14 cm de altura (por ejemplo, 250 ml tubos de centrífuga) y colocarlos en una rejilla (Figura 2C).
4. La inducción de raíz lateral de maíz
   1. Preparar una solución de 50 mM NPA acciones (disuelto en DMSO) (PRECAUCIÓN: Use guantes).
   2. Para cada tubo, hacer una solución NPA 50 M mediante la adición de 125 l de la solución madre mM NPA 50 a 125 ml de agua estéril en un vaso de vidrio esterilizado.
   3. Mezclar bien yverter 125 ml de la solución 50 mM NPA sobre el rollo de papel en el tubo. El rollo de papel absorberá la solución y llegar a ser completamente empapado.
      Nota: Cuando se utiliza rollos de papel y tubos con otras dimensiones, ajustar el volumen en consecuencia. El líquido debe llegar hasta la mitad del tubo para asegurar una buena absorción.
   4. Coloque el sistema de rollo de papel en un armario de crecimiento durante tres días (27 ° C, luz continua, humedad relativa del 70%). Asegúrese de que los rollos de papel quedan empapados añadiendo extra de solución 50 mM NPA, ya que la solución se evapora con el tiempo (Figura 2D).
      DÍA 4
   5. Preparar una solución de 50 mM NAA acciones (disuelto en DMSO) (PRECAUCIÓN: Use guantes).
   6. Para cada tubo, preparar una solución de NAA 50 M mediante la adición de 125 l de las acciones mM NAA 50 a 125 ml de agua estéril en un vaso de vidrio esterilizado.
   7. Apriete suavemente la mayor parte de la solución NPA restante de los rollos de papel y coloque elm en agua estéril durante 5 min para lavar a cabo (PRECAUCIÓN: Use guantes). Apriete suavemente la mayor parte del agua de los rollos de papel. Repita este paso de lavado tres veces.
   8. Mezcle bien y vierta la solución NAA 50 M en los rollos de papel en los tubos. Asegúrese de que estén completamente empapados.
   9. Coloque el sistema de rollo de papel en el gabinete de crecimiento (27 ° C, luz continua, 70% de humedad relativa) durante la duración deseada después de la inducción.
5. La inducción de raíz lateral de raíces adventicias de la Corona de maíz
   Nota: El LRIS como se describe anteriormente induce raíces laterales en la raíz primaria. Sin embargo, en maíz y otros monocotiledóneas, la raíz primaria y las raíces seminales embrionarias, junto con sus raíces laterales, son principalmente importante durante el desarrollo de las plántulas. En una etapa posterior en el crecimiento de la planta, las raíces adventicias post-embrionarias surgen en el vástago y también desarrollan raíces laterales para formar un nuevo sistema de raíces ^16. El LRIS también puede ser usod para inducir raíces laterales en estas raíces adventicias corona post-embrionarias siguiendo algunos ajustes menores a la LRIS en la raíz primaria embrionaria.
   1. Para hacer que los rollos de papel, crear un sándwich de papeles con respectivamente dos capas de papel toalla de mano en el lado exterior, y dos capas de papel dentro de la germinación. Coloca los granos esterilizados (vea los pasos 02.01 a 02.02) en entre las dos hojas de papel de germinación. Papel de germinación, en comparación con el papel toalla de mano, será menos propenso a ser penetrado por los pelos radiculares y raíces laterales, lo que hará la apertura de la rollos de papel más fácil después. Por otro lado, las dos capas externas de papel toalla de mano se facilitar la absorción del líquido.
   2. Inserte los rodillos en 700 ml tubos de vidrio y verter agua estéril sin NPA sobre ellos. Asegúrese de que estén completamente empapados.
   3. Germinar los granos esterilizados en el gabinete de crecimiento (véase el paso 2.4.9).
   4. Crezca las plantas de semillero hasta las raíces adventicias de la coronacomenzar a surgir (6 días para B73). Asegúrese de que los rollos de papel se mantienen húmeda en todo momento mediante la adición de agua estéril cuando sea necesario.
   5. Transferencia a una solución de 25 mM NPA durante 4 días (consulte los pasos 2.4.1 a 2.4.4), seguido de una inducción similar de la iniciación de la raíz lateral mediante la sustitución de la solución NPA con una solución NAA 50 mM después de una etapa de lavado (véase el paso 2.4 0.5 a 2.4.9).

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Resultados

Aplicación del LRIS a Realizar Transcriptómica comparativos del lateral Proceso Raíz Iniciación

Una aplicación de la LRIS es la comparación y correlación de los perfiles de expresión génica durante la formación de raíces laterales en diferentes especies. Transcriptómica comparativos acerca a crear la posibilidad de identificar los genes ortólogos involucrados en el proceso de desarrollo de las ra?...

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Discusión

En el protocolo de Arabidopsis LRIS, es importante sólo para transferir las plántulas que han crecido totalmente en contacto con el medio de crecimiento que contiene NPA. Esto asegura que la iniciación de la raíz lateral está bloqueado en toda la longitud de la raíz. A fin de evitar herir las plántulas durante la transferencia, los brazos de las pinzas curvas pueden ser conectados en virtud de los cotiledones de la plántula. Tras la transferencia, asegúrese de que las raíces de las plántulas están e...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
ARABIDOPSIS LRIS
Seeds
Arabidopsis seeds			Col-0 ecotype
Gas sterilization of seeds
micro-centrifuge tubes 1.5 ml	SIGMA-ALDRICH	0030 125.215	Eppendorf microtubes 3810X, PCR clean
micro-centrifuge tubes 2 ml	SIGMA-ALDRICH	0030 120.094	Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes
hydrochloric acid	Merck KGaA	1,003,171,000	37% (fuming) for analysis EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eu
glass desiccator	SIGMA-ALDRICH		Pyrex
glass beaker
plastic micro-centrifuge tubes box or holder
Bleach sterilization of seeds
ethanol	Chem-Lab nv	CL00.0505.1000	Ethanol, abs. 100% a.r. dilute to 70%
sodium hypochlorite (NaOCl)	Carl Roth	9062.3	12%
Tween 20	SIGMA-ALDRICH	P1379
sterile water
Growth medium
Murashige and Skoog salt mixture	DUCHEFA Biochemie B.V.	M0221-0050
myo-inositol	SIGMA-ALDRICH	I5125-100G
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)	DUCHEFA Biochemie B.V.	M1503.0100
sucrose	VWR, Internation LLC	27483.294	D(+)-Sucrose Ph. Eur.
KOH	Merck KGaA	1050211000	pellets for analysis (max. 0.002% Na) EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur
Plant Tissue Culture Agar	LabM Limited	MC029
Lateral root induction chemicals
N-1-naphthylphthalamic acid (NPA)	DUCHEFA Biochemie B.V.	No. N0926.0250	10 µM (Arabidopsis)
1-naphthalene acetic acid (NAA)	DUCHEFA Biochemie B.V.	No. N0903.0050	10 µM (Arabidopsis)
dimethylsulfoxide (DMSO)	SIGMA-ALDRICH	494429-1L
Making a mesh for transfer
nylon mesh	Prosep byba		Synthetic nylon mesh 20 µm
Sowing and seedling handling
square petri dish plates	GOSSELIN	BP124-05	12 x 12 cm
50 ml DURAN tubes	SIGMA-ALDRICH	CLS430304	Corning 50 ml centrifuge tubes
drigalski	Carl Roth	K732.1
pipette
cut pipette tips	Daslab	162001X	Universal 200, cut off 5 mm of tip before autoclaving
breathable tape	3M Deutschland GmbH	cat. no. 1530-1
tweezers	Fiers nv/sa	K342.1; K344.1	Dumont tweezers type a nr 5; Dumont tweezers type e nr 7
Growth conditions
growth room			21 °C, continuous light
Materials	Company	Catalog	Comments
MAIZE LRIS
Seeds
Maize kernels			B-73
Bleach sterilization of kernels
glass beaker
magnetic stirrer	Fiers nv/sa	C267.1
sodium hypochlorite (NaOCl)	Carl Roth	9062.3	12%
sterile water
Lateral root induction chemicals
N-1-naphthylphthalamic acid (NPA)	DUCHEFA Biochemie B.V.	No. N0926.0250	50 µM (maize primary root), 25 µM (maize adventitious root)
1-naphthalene acetic acid (NAA)	DUCHEFA Biochemie B.V.	No. N0903.0050	50 µM (maize)
dimethylsulfoxide (DMSO)	SIGMA-ALDRICH	494429-1L
Sowing and seedling handling
paper hand towels	Kimberly-Clark Professional*	6681	SCOTT Hand Towels - Roll / White; sheet size (24 x 46 cm)
seed germination paper	Anchor Paper Company		10 X 15 38# seed germination paper
tweezers	Fiers nv/sa	K342.1; K344.1	Dumont tweezers type a nr 5; Dumont tweezers type e nr 7
250 ml (centrifuge) tubes	SCHOTT DURAN	2160136	approx. 5.6 cm diameter and 14.7 cm height
700 ml tubes	DURAN GROUP	213994609	cylinders, round foot tube, D 60  x 250
rack			for maize tubes, home made
sterile water
Growth conditions
growth cabinet			27 °C, continuous light, 70% relative humidity