מערכת עין מתנהל שורש לרוחב ב<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; ותירס

Summary

The Lateral Root Inducible System (LRIS) allows for synchronous induction of lateral roots and is presented for Arabidopsis thaliana and maize.

Abstract

Lateral root development contributes significantly to the root system, and hence is crucial for plant growth. The study of lateral root initiation is however tedious, because it occurs only in a few cells inside the root and in an unpredictable manner. To circumvent this problem, a Lateral Root Inducible System (LRIS) has been developed. By treating seedlings consecutively with an auxin transport inhibitor and a synthetic auxin, highly controlled lateral root initiation occurs synchronously in the primary root, allowing abundant sampling of a desired developmental stage. The LRIS has first been developed for Arabidopsis thaliana, but can be applied to other plants as well. Accordingly, it has been adapted for use in maize (Zea mays). A detailed overview of the different steps of the LRIS in both plants is given. The combination of this system with comparative transcriptomics made it possible to identify functional homologs of Arabidopsis lateral root initiation genes in other species as illustrated here for the CYCLIN B1;1 (CYCB1;1) cell cycle gene in maize. Finally, the principles that need to be taken into account when an LRIS is developed for other plant species are discussed.

Introduction

מערכת השורשים היא קריטית לצמיחת צמח, שכן הוא מבטיח מעגן וספיגה של מים וחומרים מזינים מהאדמה. בגלל ההתרחבות של מערכת שורשים בעיקר מסתמכת על הייצור של שורשים לרוחב, הייזום והקמה שלהם נחקרו בהרחבה. שורשים לרוחב הם יזמו בתת-קבוצה מסוימת של תאי pericycle, הנקראים תאי מייסד ^1. ברוב dicots, כגון thaliana ארבידופסיס, תאים אלה נמצאים בקטבי protoxylem ^2, ואילו בmonocots, כגון תירס, שהם נמצאים בקטבי השיפה ^3. תאי מייסד מסומנים על ידי תגובת אוקסין עלה ^4, ואחריו ביטוי של גני מחזור התא ספציפיים (למשל, cyclin B1; 1 / CYCB1; 1), לאחר שהם עוברים סיבוב ראשון של חטיבות anticlinal סימטריות ^5. לאחר סדרה של חטיבות anticlinal וpericlinal מתואמות, primordium שורש לרוחב נוצר שסופו של דבר יתגלה כשורש לרוחב utonomous. המיקום והעיתוי של תחילת שורש לרוחב עם זאת לא צפויים, שכן אירועים אלה הם לא בשפע ולא מסונכרנים. זה מונע את השימוש של גישות מולקולריות כגון transcriptomics ללמוד את התהליך הזה.

כדי להתמודד עם זה, מערכת לרוחב שורש עין מתנהל (LRIS) פותחה ^{6, 7.} במערכת זו, מטופלים שתילים ראשון עם N חומצת -1-naphthylphthalamic (רט"ג), אשר מעכב תחבורת אוקסין וצבירה, וכתוצאה מכך חסימת ייזום שורש לרוחב ^8. על ידי המשך העברת השתיל למדיום המכיל את חומצת אוקסין הסינתטי 1-נפתלין אצטית (NAA), כל שכבת pericycle מגיבה לרמות הגבוהות אוקסין כך מסיבית חטיבות התרמה לרוחב שורש ייזום תא ^6. ככזה, מערכת זו מובילה לחניכות שורשים לרוחב מהירות, סינכרוני ונרחבים, המאפשרת איסוף קל של דגימות שורש מועשרים לשלב ספציפי של מנוחפיתוח שורש RAL. בהמשך לכך, ניתן להשתמש בדוגמאות אלה כדי לקבוע פרופילי ביטוי הגנום במהלך היווצרות שורש לרוחב. LRIS הניב ידע משמעותי כבר על התחלה לרוחב שורש בארבידופסיס ותירס ^9-13, אבל הצורך ליישם במערכת זו כדי מיני צמחים אחרים הופך ברור יותר ככל שיותר הגנומים רצף ויש עניין גובר להעברת ידע לחשוב חסכוניים מִין.

הנה, הפרוטוקולים מפורטים של ארבידופסיס וLRISs התירס מקבלים. בשלב הבא, דוגמא של השימוש במערכת מסופקת, על ידי הממחיש כיצד ניתן להשתמש בנתוני transcriptomics צברו מLRIS התירס לזהות homologs הפונקציונלי שיש להם תפקיד שימור בייזום שורש לרוחב על פני מיני צמחים שונים. לבסוף, הנחיות כדי לייעל את LRIS למיני צמחים אחרים מוצעים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. ארבידופסיס LRIS פרוטוקול

הערה: הטקסט מתייחס לניסויים בקנה מידה "קטנים" או "גדולים". ניסויים בקנה מידה קטנים, כגון ניתוח קו הסמן וצביעה היסטולוגית ^{6, 14,} דורשים רק כמה דוגמאות. ניסויים בקנה מידה גדולים, כגון בזמן אמת כמותי qRT-PCR, מיקרו-מערכי ^9-11 או רצף RNA, דורשים כמות גדולה יותר של דגימות. ככזה, סכום של ~ 1000 שתילים לדגימה שימש אל Vanneste et. ¹¹ לבצע ניסוי microarray לאחר נתיחת קטע השורש.

יום 1

1. עיקור של זרעי ארבידופסיס
   הערה: בחר באחד מההליכים לעיקור הזרע הבאים. כל אחד מהם מתאים לשלבים הבאים של הפרוטוקול. עיקור גז (1.1.2) מציג שני יתרונות עיקריים על פני עיקור נוזלי (1.1.1): זה לוקח פחות זמן בעת ​​טיפול בתחושה גדולהאה של זרעים, שכן אין pipetting צריך להתרחש לדגימות בודדות; וניתן לאחסן את הזרעים המעוקרים לתקופה ארוכה יותר. עם זאת, זה דורש ייבוש וטיפול זהיר.
   1. עיקור נוזל
      1. יוצקים את המספר הרצוי של זרעים בצינורות מיקרו צנטריפוגות. השתמש עד 20 מ"ג (~ 800 זרעים) בצינור 1.5 מיליליטר או 40 מ"ג (~ 1,600 זרעים) ב2 צינורות מיליליטר מיקרו צנטריפוגות.
      2. הוסף 1 מיליליטר של אתנול 70%. היפוך או בעדינות לנער במשך 2 דקות.
      3. החלף את אתנול 70% עם פתרון עיקור 1 מיליליטר במשך 15 דקות. (הכן פתרון עיקור טרי: 3.85 מיליליטר hypochlorite נתרן (מניית NaOCl) (12%) (זהירות: שימוש בעשן מכסה המנוע), 5 μl 20 Tween, עד 10 מיליליטר עם מים להפוך את הצינורות כמה פעמים כדי לוודא שכל הזרעים לבוא. במגע עם הפתרון.
      4. בזרימה אוויר קבינט מינרית, להחליף את פתרון העיקור במים מזוקקים סטריליים 1 מיליליטר ולשטוף את הזרעים 5 פעמים במשך 5 דקות על ידי חוזר ונשנהly החלפה עם 1 מיליליטר של מים מזוקקים סטריליים טריים.
   2. עיקור גז
      1. יוצקים את המספר הרצוי של זרעים בצינור מיקרו צנטריפוגות 2 מיליליטר. השתמש בצינורות בודדים כאשר עובדים עם כמה שורות עצמאיות, ולסדר אותם פתח בתיבת צינורות מיקרו צנטריפוגות פלסטיק או בעל. אם מספר הזרעים בצינור אחד עולה על 500 (12.5 מ"ג), לחלק את הזרעים במספר המתאים של צינורות כדי להבטיח עיקור מוצלח. ודא כמוסות של צינורות שכנים לא לכסות אחד את השני. מתאים זה לזה את המכסה של התיבה בתחתית, כפי שהוא צריך להיות בתא הייבוש, כמו גם לעיקור.
      2. מניחים את התיבה בקערה של ייבוש, יחד עם כוס זכוכית (זהירות: שימוש בעשן מכסה המנוע).
      3. מלא את הכוס עם 12% NaOCl 100 מיליליטר (זהירות: מנדף שימוש). שים את המכסה על הייבוש, אבל להשאיר פתח קטן שבו הכוס ממוקמת.
      4. להוסיף 3 מיליליטר של 37% חומצה הידרוכלורית (רותח) (CAUהמוזכרות: השתמשו עשן מכסה המנוע) לכוס דרך פתח הקטן ולסגור את הייבוש במהירות. בועת הפתרון לכמה זמן עקב היווצרות Cl ₂ -gas. השאר את המערכת סגורה O / N (או לפחות 8 שעות).
      5. הסר את מכסה תא ייבוש. קח את הקופסה ולכסות אותו עם המכסה, כדי למנוע זיהום במהלך הובלה.
      6. לשים את הקופסה בזרימה אוויר קבינט מינרית, להסיר את המכסה ולהשאיר את הזרעים כ 1 שעות על RT כדי לאפשר שחרור גז.
         הערה: זרעים יכולים להיות מאוחסנים בבטחה יבש בצינורות מיקרו צנטריפוגות סגורים עד 2 שבועות ב 4 מעלות צלזיוס.
2. אינדוקציה שורש לרוחב בארבידופסיס
   1. רוחב שורש עיכוב (רשות הטבע והגנים טיפול)
      1. הכן מדיום גידול לצמיחה במבחנה. הבינוני מכיל מחצית כוח תערובת Murashige וSkoog מלח ^15, מיו-אינוסיטול L / 0.1 G, 10 גר '/ סוכרוז L, והוא נאגר עם 0.5g / L חומצת ethanesulfonic 2 (N-morpholino) (MES).
      2. התאם את ה- pH 5.7 עם 1 M KOH. הוסף 8 גרם / L של אגר רקמות צמח וחיטוי הבינוני במשך 20 דקות ב 121 מעלות צלזיוס.
      3. הכן פתרון מניות מ"מ 25 של רשות הטבע והגנים בdimethylsulfoxide (DMSO) (זהירות: כפפות שימוש). בזרימה אוויר קבינט מינרית, לקרר את מדיום autoclaved עד כ 65 מעלות צלזיוס (שהיא הטמפרטורה בה הבקבוק יכול להיות מוחזק ביד), ולהוסיף 25 פתרון מניות מ"מ רשות הטבע והגנים כדי להשיג ריכוז סופי של 10 מיקרומטר רשות הטבע והגנים.
      4. Homogenize על ידי בעדינות רועדת בנוסף הבקבוק במשך 10 שניות. יוצקים 50 מיליליטר של מדיום לצלחת פטרי רבוע (12 סנטימטרים X 12 סנטימטרים).
         הערה: במקרה של ניסוי בקנה מידה גדול, תחול רשת ניילון (20 מיקרומטר) כדי להבטיח העברה קלה. הכן רשת (9 סנטימטרים x 9 סנטימטרים) למעוקר (איור 1 א). כאשר autoclaved, להחיל את הרשת למדיום הגידול באמצעות פינצטה סטרילית (איור 1). דחף בעדינות את הרשת למדיום הגידול באמצעות STErilized drigalsky כדי לוודא שהוא נמצא בקשר טוב עם מדיום הגידול (איור 1) (זהירות: עבודה בתנאים סטריליים).
      5. לזרוע את הזרעים ברשות הטבע והגנים-הצלחות.
         הערה: במקרה ניסוי בקנה מידה גדול מתוכנן, לזרוע 2 שורות צפופות ומיושרים היטב של 50 זרעים כדי להקל על הדגימה (ראה 1.2.2.3).
         1. במקרה של עיקור נוזל, לזרוע את הזרעים ברשות טבע וגנים-צלחות באמצעות pipet 200 μl. חותך את 3 - 4 מ"מ של סוף הטיפים pipetting בתנאים סטריליים (או לפני העיקור של הטיפים) כדי להיות מסוגל pipet הזרעים. Pipet למעלה ולמטה כמה פעמים מחדש להשעות את הזרעים, ואז pipet מים כ 150 μl סטרילי עם 10 - 20 זרעים ולחכות עד משקעי זרעים בתחתית של הקצה. (זהירות: עבודה בתנאים סטריליים)
            הערה: כאשר נוגע באגרה או הרשת בעדינות עם הקצה, טיפת מים עם זרע תשוחרר ממנו (איור 1 ג).
         2. במקרה של עיקור גז, לזרוע את הזרעים באמצעות toothpicks.Pinch autoclaved הקיסם לתוך אגר לפני שלקח את הזרעים על מנת להבטיח משטח דביק. להרים את הזרעים האחד אחד באמצעות הקיסם ולהפיץ את הזרעים על הצלחות (1D איור). לחלופין, להוסיף מים סטריליים לזרעים, ולזרוע כמתואר ב1.2.1.5.1 (זהירות: עבודה בתנאים סטריליים).
      6. לאטום את הצלחות עם נייר דבק לנשימה ולאחסן אותם צלחות על 4 מעלות צלזיוס בחושך במשך לפחות 2 ימים ובשבוע אחד לכל היותר. זה נחוץ לריבוד ומבטיח מסונכרנים ונביטה יעילה יותר.
         הערה: לחלופין, ניתן ריבוד זרעים לפני הזריעה, שקועים במים מזוקקים בצינורות מיקרו צנטריפוגות, אשר דורש מרחב מקרר פחות. במקרה זה, לאחסן הצינורות לפחות שבוע אחד ב 4 ° C, ולהעביר את הצלחות לארון הצמיחה מייד לאחר הזריעה (ראה 1.2.1.7).
         יום 3
      7. הזז את הצלחות לארון הגידול (אור רציף (110 מטר של ^{-2 -1),} ג '21 ° μE) במשך 5 ימים (2 ימים של נביטה וצמיחה של 3 ימים) במצב כמעט אנכי (80 עד 90 מעלות) על מנת להבטיח צמיחת שורש ב, ולא בטווח הבינוני.
         יום 8
   2. רוחב שורש אינדוקציה (NAA טיפול)
      1. הכן את אותו מדיום הגידול כפי שתואר ב1.2.1.1 ו1.2.1.2. הכן פתרון 50 מ"מ מניות של NAA בDMSO (זהירות: כפפות שימוש). מגניב בינוני autoclaved עד 65 מעלות צלזיוס ולהוסיף פתרון NAA למדיום כדי להשיג ריכוז סופי של 10 מיקרומטר NAA (זהירות: עבודה בתנאים סטריליים).
         1. Homogenize על ידי בעדינות רועדת בנוסף הבקבוק במשך 10 שניות. יוצקים 50 מיליליטר של מדיום לצלחת פטרי רבוע (12 סנטימטרים X 12 סנטימטרים).
      2. העבר את השתילים מהצלחות המכילות מדיום גידול בתוספת 10 מיקרומטר רשות הטבע והגנים לsup אלהליישמם עם 10 מיקרומטר NAA.
         1. הוק זרועות פינצטה מעוקלת תחת הפסיגים של השתיל ובעדינות מסירה אותו מהצלחת. להעביר רק שתילים שהשורשים גדלו כולו במגע עם רשות הטבע והגנים בינוניים-צמיחה ורצוי כלפי מטה.
         2. לרחף השורש על פני מדיום גידול המכיל NAA על פני מרחק קטן. ודא ששורשי הצמח נמצאים בקשר טוב עם מדיום הגידול. במידת הצורך, לחץ על השורש בעדינות אל פני השטח מדיום גידול עם פינצטה.
            הערה: במקרה של ניסוי בקנה מידה גדולה, להסיר את כל השתילים שאינם במגע עם הרשת והעברה על ידי הרמת הרשת בשתי פינות העליונות עם פינצטה. ודא הרשת נמצאת בקשר טוב עם המדיום המכיל NAA על ידי רפרוף הרשת על פני אגר על פני מרחק קטן (איור 1E).
      3. לאטום את הצלחות החדשות עם קלטת לנשימה ולמקם אותם בארון הצמיחה (קוןאור tinuous (110 מטר של ^{-2 -1} μE), ג '21 °) במצב אנכי לזמן הרצוי לאחר אינדוקציה עד דגימה.
         הערה: במקרה של ניסוי בקנה מידה גדולה, להשתמש באזמל כדי לחתוך קטעי השורש בבת אחת ישירות על הרשת ולדגום אותם בעדינות על ידי גירוד פני השטח של הרשת.

2. LRIS תירס פרוטוקול

1. ריבוד של גרעיני תירס
   1. דגירה גרעיני התירס ב 4 ° C בחושך במשך השבוע לפחות 1.
      הערה: פרוטוקול זה פותח באמצעות הקו טהור תירס B73.
2. עיקור של גרעיני תירס
   יום 1
   הערה: למרות ששתילי תירס לא צריכים להיות מבוגרים בתנאים סטריליים, מומלץ לעקר את גרעיני התירס ולעבוד עם חומר סטרילי כדי למנוע צמיחת פטרייה בגליל הניירמַעֲרֶכֶת.
   1. שים את המספר הדרוש של גרעיני תירס בכוס זכוכית מעוקרת.
   2. להוסיף לפתרון עיקור (6% NaOCl במים) (זהירות: מנדף שימוש) 100 מיליליטר.
   3. הוסף בר ומערבבים מגנטיים ומניח את הכוס על בוחש מגנטי במהירות ערבוב נמוכה (כ 250 סל"ד) על RT במשך 5 דקות.
   4. לשטוף חמש פעמים במשך 5 דקות על ידי החלפת הפתרון עם מים סטריליים טריים 100 מיליליטר.
3. זריעת גרעיני תירס
   1. שים את כפפות כדי להפחית את הסיכון לזיהום, ולקחת גליל של מגבות נייר.
   2. לקרוע את שתי רצועות של נייר מגבת יד באורך כולל של שני גיליונות (כ 92 סנטימטרים X 24 סנטימטרים) ומניח אותם על גבי זה על משטח נקי (איור 2 א).
   3. מקפלים את היריעות להכפיל על פני האורך (92 סנטימטרים X 12 סנטימטרים בערך) (איור 2 א).
   4. להשתמש בפינצטה כדי להפיץ 10 גרעינים בכ 2 סנטימטר מהחלק העליון מעל tהוא כל אורך הנייר, תוך שמירה על חלל ביניים של 8 סנטימטר בין כל ליבה ו8 סנטימטר חופשי בשני קצותיו (איור 2). ודא radicle של הקרנל פונה כלפי מטה וכלפי הנייר (איור 2).
   5. בעדינות לגלגל את הנייר על פני האורך, תוך שמירה על הזרעים במקום (איור 2). כדי להקל על הגלגול, זה הוא אופציונלי לראשון לרסס את הנייר עם מים סטריליים.
   6. שים את גלילי נייר בצינורות זכוכית מעוקרות של כ 6 סנטימטרים קוטר וגובה סנטימטר 14 (לדוגמא, 250 צינורות צנטריפוגה מיליליטר) ולמקם אותם במעמד (איור 2 ג).
4. אינדוקציה שורש לרוחב בתירס
   1. הכן פתרון 50 מ"מ רשות הטבע והגנים מניות (מומס DMSO) (זהירות: כפפות שימוש).
   2. לכל צינור, להפוך את רשות הטבע והגנים פתרון 50 מיקרומטר על ידי הוספת 125 μl מפתרון מניות מ"מ רשות הטבע והגנים 50 עד 125 מיליליטר מים סטריליים בכוס זכוכית מעוקרת.
   3. מערבבים היטב ולשפוך 125 מיליליטר של פתרון רט"ג 50 מיקרומטר על גליל נייר בצינור. גליל הנייר יספוג את הפתרון ולהיות ספוגים לגמרי.
      הערה: כאשר משתמשים בגלילי נייר וצינורות עם ממדים אחרים, להתאים את עוצמת הקול בהתאם. הנוזל צריך להגיע באמצע הצינור כדי להבטיח ספיגה מספיקה.
   4. הנח את מערכת גליל נייר בקבינט צמיחה במשך שלושה ימים (27 מעלות צלזיוס, אור רציף, 70% לחות יחסית). ודא שגלילי הנייר יישארו ספוגים על ידי הוספת פתרון רט"ג 50 מיקרומטר נוספים, שכן הפתרון מתאדה לאורך הזמן (איור 2 ד).
      יום 4
   5. הכן פתרון 50 מ"מ NAA מניות (מומס DMSO) (זהירות: כפפות שימוש).
   6. לכל צינור, להכין פתרון NAA 50 מיקרומטר על ידי הוספת 125 μl ממניות 50 מ"מ NAA למים סטריליים 125 מיליליטר בכוס זכוכית מעוקרת.
   7. יש ללחוץ בעדינות את רוב פתרון רט"ג שנותר מגלילי נייר ומניחמ 'במים סטריליים במשך 5 דקות כדי לשטוף אותו החוצה (זהירות: כפפות שימוש). יש ללחוץ בעדינות את רוב המים מגלילי הנייר. חזור על שלב זה כביסה שלוש פעמים.
   8. מערבבים היטב ויוצקים את פתרון NAA 50 מיקרומטר מעל גלילי נייר בצינורות. לוודא שהם ספוגים לגמרי.
   9. הנח את מערכת גליל נייר בקבינט הצמיחה (27 מעלות צלזיוס, אור רציף, 70% לחות יחסית) למשך הרצוי לאחר אינדוקציה.
5. אינדוקציה שורש לרוחב בשורשים adventitious כתר של תירס
   הערה: LRIS כפי שתואר לעיל גורם שורשים לרוחב בשורש הראשוני. עם זאת, בתירס וmonocotyledons אחר, השורש היסודי ושורשי הזרע העובריים, יחד עם השורשים לרוחבם, הם בעיקר חשובים בשתיל פיתוח. בשלב מאוחר יותר בגידול צמחים, שורשי adventitious פוסט-עובריים להתעורר על הגזע וגם לפתח שורשים לרוחב כדי ליצור מערכת שורשים חדשה ^16. LRIS יכול להיות גם שימושד כדי לגרום לשורשים לרוחב על שורשי כתר adventitious פוסט-עובריים אלה על ידי ביצוע כמה שינויים קלים לLRIS על השורש העיקרי העוברי.
   1. כדי להפוך את גלילי נייר, ליצור כריך של ניירות עם בהתאמה שתי שכבות של נייר מגבת יד בצד החיצוני, ושתי שכבות של נייר נביטה בתוך. מניחים את הגרעינים המעוקרים (ראה צעדים 2.1-2.2) בין שני גיליונות נייר נביטה. נייר נביטה, בהשוואה לנייר מגבת, יהיה פחות נוטה לעבירות לשערות שורש ושורשים לרוחב, אשר תהפוך את הפתיחה של הנייר מתגלגלת קלה יותר בהמשך. מצד השני, שתי שכבות חיצוניות של נייר מגבת יד תקל קליטה של ​​הנוזל.
   2. הכנס את הלחמניות ב700 מיליליטר צינורות זכוכית ויוצקים מים סטריליים ללא רשות הטבע והגנים עליהם. לוודא שהם ספוגים לגמרי.
   3. לנבוט גרעינים המעוקרים בקבינט הצמיחה (ראה שלב 2.4.9).
   4. לגדול השתילים עד שורשי כתר adventitiousמתחיל לצוץ (6 ימים לB73). ודא גלילי נייר נשמרים רטובים כל הזמן על ידי הוספת מים סטריליים בעת צורך.
   5. העברה לפתרון 25 מיקרומטר רשות הטבע והגנים במשך 4 ימים (ראה צעדים 2.4.1 ל2.4.4), ואחריו אינדוקציה דומה חניכה שורש לרוחב על ידי החלפת פתרון רט"ג עם פתרון NAA 50 מיקרומטר לאחר שלב כביסה (ראה שלב 2.4 .5 ל2.4.9).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

יישום של LRIS לבצע transcriptomics השוואתי של תהליך רוט ייזום הרוחב

אחד יישומים של LRIS הוא ההשוואה וההתאמה של פרופילי ביטוי גנים במהלך היווצרות שורש לרוחב במינים שונים. transcriptomics השוואתי גישות ל?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

בפרוטוקול ארבידופסיס LRIS, חשוב להעביר רק את השתילים שצמחו כולו במגע עם מדיום גידול רשות הטבע והגנים המכיל. הדבר מבטיח כי ייזום שורש לרוחב חסום על אורך השורש כל. כדי למנוע פציעת שתילי במהלך העברה, זרועות המלקחיים המעוקלים יכולות להיות מכור תחת הפסיגים של השתיל. עם ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ARABIDOPSIS LRIS
Seeds
Arabidopsis seeds			Col-0 ecotype
Gas sterilization of seeds
micro-centrifuge tubes 1.5 ml	SIGMA-ALDRICH	0030 125.215	Eppendorf microtubes 3810X, PCR clean
micro-centrifuge tubes 2 ml	SIGMA-ALDRICH	0030 120.094	Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes
hydrochloric acid	Merck KGaA	1,003,171,000	37% (fuming) for analysis EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eu
glass desiccator	SIGMA-ALDRICH		Pyrex
glass beaker
plastic micro-centrifuge tubes box or holder
Bleach sterilization of seeds
ethanol	Chem-Lab nv	CL00.0505.1000	Ethanol, abs. 100% a.r. dilute to 70%
sodium hypochlorite (NaOCl)	Carl Roth	9062.3	12%
Tween 20	SIGMA-ALDRICH	P1379
sterile water
Growth medium
Murashige and Skoog salt mixture	DUCHEFA Biochemie B.V.	M0221-0050
myo-inositol	SIGMA-ALDRICH	I5125-100G
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)	DUCHEFA Biochemie B.V.	M1503.0100
sucrose	VWR, Internation LLC	27483.294	D(+)-Sucrose Ph. Eur.
KOH	Merck KGaA	1050211000	pellets for analysis (max. 0.002% Na) EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur
Plant Tissue Culture Agar	LabM Limited	MC029
Lateral root induction chemicals
N-1-naphthylphthalamic acid (NPA)	DUCHEFA Biochemie B.V.	No. N0926.0250	10 µM (Arabidopsis)
1-naphthalene acetic acid (NAA)	DUCHEFA Biochemie B.V.	No. N0903.0050	10 µM (Arabidopsis)
dimethylsulfoxide (DMSO)	SIGMA-ALDRICH	494429-1L
Making a mesh for transfer
nylon mesh	Prosep byba		Synthetic nylon mesh 20 µm
Sowing and seedling handling
square petri dish plates	GOSSELIN	BP124-05	12 x 12 cm
50 ml DURAN tubes	SIGMA-ALDRICH	CLS430304	Corning 50 ml centrifuge tubes
drigalski	Carl Roth	K732.1
pipette
cut pipette tips	Daslab	162001X	Universal 200, cut off 5 mm of tip before autoclaving
breathable tape	3M Deutschland GmbH	cat. no. 1530-1
tweezers	Fiers nv/sa	K342.1; K344.1	Dumont tweezers type a nr 5; Dumont tweezers type e nr 7
Growth conditions
growth room			21 °C, continuous light
Materials	Company	Catalog	Comments
MAIZE LRIS
Seeds
Maize kernels			B-73
Bleach sterilization of kernels
glass beaker
magnetic stirrer	Fiers nv/sa	C267.1
sodium hypochlorite (NaOCl)	Carl Roth	9062.3	12%
sterile water
Lateral root induction chemicals
N-1-naphthylphthalamic acid (NPA)	DUCHEFA Biochemie B.V.	No. N0926.0250	50 µM (maize primary root), 25 µM (maize adventitious root)
1-naphthalene acetic acid (NAA)	DUCHEFA Biochemie B.V.	No. N0903.0050	50 µM (maize)
dimethylsulfoxide (DMSO)	SIGMA-ALDRICH	494429-1L
Sowing and seedling handling
paper hand towels	Kimberly-Clark Professional*	6681	SCOTT Hand Towels - Roll / White; sheet size (24 x 46 cm)
seed germination paper	Anchor Paper Company		10 X 15 38# seed germination paper
tweezers	Fiers nv/sa	K342.1; K344.1	Dumont tweezers type a nr 5; Dumont tweezers type e nr 7
250 ml (centrifuge) tubes	SCHOTT DURAN	2160136	approx. 5.6 cm diameter and 14.7 cm height
700 ml tubes	DURAN GROUP	213994609	cylinders, round foot tube, D 60  x 250
rack			for maize tubes, home made
sterile water
Growth conditions
growth cabinet			27 °C, continuous light, 70% relative humidity