La medición de volumen de bucles de presión en el ratón

Resumen

Este manuscrito describe un protocolo detallado para la recogida de los datos de presión-volumen del ratón.

Resumen

La comprensión de las causas y la progresión de la enfermedad cardíaca presenta un reto importante para la comunidad biomédica. La flexibilidad genética del ratón ofrece un gran potencial para explorar la función cardíaca en el nivel molecular. El pequeño tamaño del ratón presenta algunos desafíos en lo que respecta a la realización de fenotipificación cardiaca detallada. Miniaturización y otros avances en la tecnología han hecho muchos métodos de evaluación cardíaca posible en el ratón. De éstas, la recolección simultánea de los datos de presión y volumen ofrece una visión detallada de la función cardiaca que no está disponible a través de cualquier otra modalidad. Aquí se describe un procedimiento detallado para la recogida de datos de bucle presión-volumen. Se incluye una discusión de los principios subyacentes a las medidas y las posibles fuentes de error. El manejo anestésico y un procedimiento quirúrgico se discuten en gran detalle ya que ambos son fundamentales para la obtención de mediciones hemodinámicas de alta calidads. También se abordan los principios del desarrollo del protocolo hemodinámico y aspectos relevantes de análisis de datos.

Introducción

La enfermedad cardiovascular sigue siendo una causa importante de mortalidad y morbilidad en el mundo entero ^1. Enfermedades del corazón presentan retos particularmente difíciles en el desarrollo de nuevas terapias. Los avances en genética prevén la posibilidad de identificar una multitud de posibles contribuyentes genéticas para el desarrollo de enfermedades del corazón. La naturaleza integradora del sistema cardiovascular requiere que estas dianas genéticas ser validados en modelos animales intactos. La flexibilidad y bajos costos de vivienda genéticos del ratón han traído al primer plano para la evaluación de la función fisiológica de un determinado gen. El pequeño tamaño del ratón presenta algunos desafíos únicos para la evaluación de la función cardíaca. Existen varias modalidades que pueden proporcionar información sobre la función cardíaca, pero sólo la medición simultánea de la presión ventricular y el volumen permite a presión-volumen (PV) análisis de ciclos de la función ventricular. PV todos los loopsla función cardíaca ow a analizar independiente de su conexión a la vasculatura; un factor importante para determinar el papel funcional de un elemento genético particular.

La evaluación de los bucles de presión-volumen se ha utilizado tanto experimental como clínicamente durante muchos años y existe una amplia literatura sobre el análisis de estos conjuntos de datos ^2,3. La adaptación de la tecnología de bucle de PV para el ratón ha sido un avance importante para la comprensión de la fisiología cardiaca murino ^4-6. Catéter tecnologías de bucle PV basado pareja un transductor de presión y el uso de conductancia para estimar el volumen ventricular. El volumen ventricular se determina mediante el examen de los cambios en un campo eléctrico generado por el catéter. Este modelos Método El ventrículo como un cilindro, la altura de los cuales se define por la distancia entre los electrodos en el catéter y el radio se calculan a partir de la conducción de un campo eléctrico a través de la sangre enel ventrículo ^7-9. La señal de la conductancia medida por el catéter tiene dos componentes. La primera es la conducción a través de la sangre; esto varía con el volumen del ventrículo y constituye la señal principal que se utiliza para determinar el volumen ventricular. El segundo componente resulta de la conducción a través ya lo largo de la pared del ventrículo. Esto se conoce como la conductancia en paralelo y se debe quitar con el fin de determinar el volumen ventricular absoluta. Hay dos sistemas disponibles en el mercado para la recogida de los datos de presión-volumen en el laboratorio de investigación y el método utilizado para calcular y eliminar la conductancia en paralelo es la principal diferencia entre ellos ^6,10,11. catéteres conductancia requieren la inyección de la solución salina hipertónica para el cálculo de la conductancia en paralelo. Esta inyección cambia transitoriamente la conductividad de la sangre en el ventrículo, mientras que la conductividad de la pared se mantiene constante. De estos datos es posible determinar lacomponente de la señal de conductancia que se origina a partir de la sangre y lo que viene de la pared ventricular. Este enfoque supone que la conductancia en paralelo no varía durante el ciclo cardíaco. El método de admisión se basa en cambios de fase en el campo eléctrico para evaluar la contribución de la pared ventricular a la señal de volumen general. Este método se basa en una variedad de constantes predeterminados para la conductividad de la sangre y el miocardio para determinar el volumen final, pero hace que las medidas continuas de la conductancia en paralelo durante el ciclo cardíaco. Ambos sistemas proporcionan buenas estimaciones del volumen del ventrículo izquierdo y las diferencias entre ellos no es probable que sean fisiológicamente significativa. El modelo cilíndrico del ventrículo y otros supuestos rinden estos enfoques basados ​​en catéter no es tan exacto como otras modalidades, pero no se proporciona esta información en una base de latido a latido que es esencial para la evaluación de la carga medidas independientes de la función cardíaca.

El procedimiento que se describe aquí se usa en mi laboratorio y ha proporcionado datos para un gran número de estudios que examinan los mecanismos fisiopatológicos básicos de cardiomiopatía distrófica ^12-18. El procedimiento descrito a continuación es uno de los dos que se puede utilizar para obtener datos de bucle PV. Mientras que muchos de los principios son aplicables para uno u otro enfoque, este protocolo se centrará en un enfoque apical abierta de tórax; un protocolo de tórax cerrado se ha detallado en otro lugar ^19,20. Si bien se describirá el procedimiento en detalle, los principios generales son importantes para exponer el corazón con un daño mínimo o bien el corazón o los pulmones. A lo largo del protocolo es importante recordar que se trata de un procedimiento no la supervivencia y que tiene una buena exposición del corazón es de vital importancia para la correcta colocación del catéter.

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Protocolo

Antes de realizar cualquiera de los procedimientos descritos en este protocolo, obtener la aprobación por el comité de cuidado de los animales y el uso institucional local.

1. Instalación de la plataforma experimental

Nota: Este procedimiento se realiza en animales anestesiados y la calidad de los datos es proporcional a la calidad del apoyo anestésico ofrecido al animal. Esta primera sección de detalle voluntad del equipo y los procedimientos necesarios para proporcionar anestesia para el ratón mientras se realiza este protocolo.

1. Seleccione un protocolo de anestesia. anestésicos por inhalación tienen muchas propiedades beneficiosas para la realización de análisis PV-bucle, aunque algunos protocolos inyectables se han utilizado también. Véase la discusión para más información sobre la elección de un régimen anestésico.
2. Asegure tanques de oxígeno comprimido a la mesa de operaciones o en la pared cerca de la zona quirúrgica.
3. Si el uso de anestésicos inhalatorios, utilizar un vaporizador para aseguraruna dosificación adecuada. Calibrar vaporizadores anualmente para garantizar que aportan la dosis apropiada de gas anestésico. Conectar vaporizadores a un medidor de flujo que permite el control de la velocidad a la que entra en el circuito de gas anestésico. Situado en 0,5 a 1,0 L / min.
4. Utilice un colector para permitir el flujo de gas dirigido anestésico a 1) la cámara de inducción, 2) una máscara, y 3) el ventilador. Evacuación de gases anestésicos es muy importante y debe ser realizado por un sistema activo que o entrada de aire en una campana de extracción (o de otras infraestructuras edificio similar) o por medio de un bote diseñado para eliminar los gases anestésicos.
   Nota: Consulte con los funcionarios de salud ocupacional locales para garantizar el cumplimiento de todas las regulaciones locales.
5. Mantener la temperatura corporal mediante el uso de almohadillas de calor y / o lámparas de calentamiento. Un seguimiento continuo de la temperatura corporal con un termómetro rectal. Esto permitirá que los aumentos o disminuciones en proactivas calefacción para garantizar una temperatura corporal fisiológica (ͭ6; 37 ° C) durante la recogida de los datos hemodinámicos.
6. Proporcionar apoyo de fluido para contrarrestar la pérdida de sangre y la pérdida de volumen insensibles.
   1. Preparar una solución de 10% de albúmina en 0,9% NaCl tomando 1 ml de 25% de albúmina y la adición de 1,5 ml de 0,9% de NaCl en una jeringa.
   2. Preparar un catéter intravascular de bajo volumen residual.
      1. Use pinzas para aplastar el cubo de plástico de una aguja de calibre 30 de 0,5 pulgadas. El uso de soportes de aguja, sujete la aguja y retire el cubo. Raspar el adhesivo restante de la aguja utilizando una pinza hemostática. Insertar el extremo romo de la aguja en una longitud de tubo capilar. Use menos de 20 pulgadas de longitud para el tubo.
   3. Utilice una bomba de jeringa para permitir volúmenes precisos para ser entregados.
7. Asegurar una ventilación adecuada para la recogida de datos fotovoltaicos de alta calidad. Hay una variedad de ventiladores de ratón disponibles para la compra. ventiladores de presión controlada proporcionan el ambiente cerrado requerido para un inhalantegases de nesthetic y proporcionan un mejor control de la ventilación durante el procedimiento.
   1. Asegúrese de que la presión inspiratoria se limitan a <15 cm _H2O para prevenir el barotrauma. Ajuste el ventilador para suministrar el pulso de inspiración durante 35% del ciclo respiratorio. El uso de la presión positiva al final de la espiración (PEEP) a un nivel de 4 - 5 cm _H2O mejorará en gran medida la ventilación del ratón, mediante la prevención de la atelectasia del pulmón y apoyar el intercambio de gases.
   2. Limitar el espacio distal muerto para el Y-conjunto en el circuito ventilatorio. Esto es crítico porque el volumen corriente del ratón es muy pequeño y cualquier espacio muerto resta de la entrega de aire inspirado fresco.
   3. Crear un tubo endotraqueal tamaño del ratón (ET) cortando la punta fuera de un catéter intravascular permanente de calibre 20. Esto proporciona una punta cónica para facilitar la inserción. Coloque el extremo del corte en el Y-articulación del circuito anestésico.
   4. Use un tubo flexible en el aparato respiratoriocircuito. Cualquier memoria estructural en el tubo va a crear fuerzas externas que tienen el potencial para tirar del tubo endotraqueal de las vías respiratorias del ratón.
   5. Deje el ratón determinar la frecuencia respiratoria mediante el uso de la tasa más baja que suprime el estímulo respiratorio endógeno. Comience a un ritmo relativamente lento respiratoria de alrededor de 60 respiraciones por minuto.
      Nota: Con una ventilación adecuada del ratón debe hacer muy poco esfuerzo para respirar. Sin embargo, si la ventilación es insuficiente, la acumulación de _CO2 en la sangre iniciará el esfuerzo respiratorio mediante el ratón. Si esto se detecta, el aumento de la frecuencia respiratoria es una forma sencilla de aumentar la ventilación alveolar. A menudo es necesario aumentar la frecuencia respiratoria en respuesta a las elevaciones en la carga de trabajo cardiaco asociado con la estimulación de los receptores beta-adrenérgicos.
   6. Una vez preparado el circuito respiratorio, la presión de prueba del sistema conectando la punta del tubo endotraqueal (ET)con un dedo. Garantizar una presión de la vía aérea de ≈10 cm _H2O Esta prueba debe realizarse antes de cada procedimiento.

2. Técnica quirúrgica

1. Utilice pequeñas pinzas y tijeras y otros equipos de la Tabla 1. Todos los instrumentos son bastante pequeñas para permitir un fácil uso en el campo quirúrgico magnificado. Utilice un estereomicroscopio quirúrgico para proporcionar aumento adecuado para varios aspectos del procedimiento quirúrgico.
2. Use un cauterio para maximizar la hemostasia durante el procedimiento.
   Nota: Hay un par de amplias clases de cauterio. Termocauterio calienta un elemento de metal delgado que corte a través del tejido muscular y detener el sangrado. Estos sistemas son inicialmente relativamente barato; sin embargo, es importante tener en cuenta que las puntas de alambre son tanto frágiles y relativamente costosos. sistemas de electrocauterización son más costosos de adquirir inicialmente, pero los consejos son muy robustos y no tendrán que ser reemplazarre.
3. Inducción y Preparación quirúrgica
   1. Obtener el peso corporal del ratón.
   2. Coloque el ratón en una cámara de inducción que se llena con 5% de isoflurano.
      Nota: El ratón no puede sobrevivir más de unos pocos minutos en este entorno. Se requiere 60 segundos para el ratón a perder sus esfuerzos reflejo de enderezamiento (se volcara cuando se coloca en su parte posterior o lateral) - Sólo el 45.
   3. Una vez que se pierde el reflejo de enderezamiento, reducir la concentración de isoflurano al 2% y abrir el gas anestésico a la máscara.
   4. transferir rápidamente el ratón a la mesa de operaciones y colocarlo en decúbito dorsal con su nariz dentro de la máscara.
   5. Si se utiliza la electrocauterización, utilice una gasa empapada solución salina para acoplar eléctricamente el ratón a la toma de tierra del sistema de electrocauterio.
   6. Asegurar las extremidades con cinta quirúrgica. Esta cinta proporciona propiedades adhesivas incluso cuando está mojado.
   7. Inserte una termosonda rectal para el órgano de control centraltemperatura. Fije con cinta adhesiva.
   8. Aplicar una crema depilatoria para el cuello y el pecho del ratón. Espere de 2 - 3 minutos para el depilatoria para trabajar, y luego retire la de piel de estas zonas utilizando un aplicador con punta de algodón y / o paños de laboratorio.
      Nota: No se requiere Draping del campo quirúrgico, ya que este es un procedimiento no supervivencia, pero puede ser deseable para limitar la exposición del cirujano a la toma de tierra de cauterización, si se utiliza.
   9. Una vez que el ratón está preparado para la cirugía, evaluar el plano quirúrgico del ratón mediante la realización de un dedo del pie-pellizco. Una vez asegurado de una profundidad anestésica adecuada el ratón está listo para la primera incisión.
4. Obtener el control de la vía respiratoria a través de intubación oral o traqueotomía. La traqueotomía es un enfoque conveniente que es relativamente simple de realizar.
   Nota: A lo largo de esta descripción procedimental todas las direcciones y orientaciones estarán en relación con el cirujano.
   1. Hacer una incisión en el Level de la horquilla esternal que se extiende desde ≈ 5 mm derecha de la línea media de ≈ 5 mm a la izquierda de la línea media.
   2. Hacer una segunda incisión extiende a lo largo del borde derecho de la primera incisión, que se extiende rostral a un nivel ≈ 2 mm caudal al extremo de la mandíbula.
   3. Hacer tercera incisión que se extiende desde el extremo rostral de la segunda incisión a ≈ 5 mm a la izquierda de la línea media. Retraer el colgajo de piel resultante a la izquierda para exponer los tejidos subyacentes.
   4. Separar las glándulas salivales parótidas y submandibulares en la línea media mediante disección roma. Esto expondrá los músculos subyacentes que recubren la tráquea.
   5. Sin rodeos separar la derecha y los músculos esternohioideo izquierda para exponer la tráquea.
   6. Pasar una pieza ≈10 cm de sutura de seda 3-0 bajo la tráquea, teniendo cuidado de no incluir el esófago.
   7. Identificar la ubicación de la traqueotomía: inmediatamente caudal a la laringe hay un hueco antes de que el primer anillo traqueal, se trata de una ideal ubicación para realizar la traqueotomía.
   8. Ajustar el colector para proporcionar gas anestésico para el ventilador y encender el ventilador.
   9. Compruebe si hay fugas al conectar la punta del tubo endotraqueal (ET) con un dedo. Garantizar una presión de la vía aérea de ≈10 cm de H2O.
   10. Usando una aguja de calibre 20 como un bisturí, incisión en la tráquea. Hacer la incisión relativamente amplio, ya que el tubo endotraqueal se llenará gran parte de la luz traqueal.
   11. Moviéndose rápidamente, quite la máscara y cuidadosamente insertar el tubo endotraqueal en la tráquea. No lo fuerce ya que los tejidos son muy frágiles y romper a través de la pared de la tráquea puede resultar en un neumotórax.
       Nota: Inmediatamente después de la inserción, excursiones pecho deben ser evidentes.
   12. Asegure el circuito ventilatorio con cinta adhesiva para evitar que el tubo ET se salga.
   13. Ate un solo nudo en la sutura 3-0 para formar un sello alrededor del tubo endotraqueal.
       Nota: En este punto excursi pechoons debe ser claramente evidente. Si no es por lo general el posicionamiento del tubo ET dentro de la tráquea que es el problema. Tirar del tubo ET atrás y tratar de cambiar su posición, se centra en la orientación de la tráquea como guía.
5. Preparación de la vena yugular Sitio
   1. Retraer las glándulas salivales dejan exponer rostral-lateral de la vena yugular externa.
   2. Biseccionar el músculo delgado (sternomastoideus) que cubre la vena con disección roma. Esto expondrá la superficie exterior de la vena yugular.
   3. Con cuidado, borrar todo pedazo de tejido importantes, aunque se debe tener cuidado ya que las paredes de la vena son muy finas. Una vez que esta tarea se ha completado, cubrir la vena yugular con las glándulas salivales para preservarlo para la canalización más tarde.
6. toracotomía; entrar en el espacio pleural sin dañar el corazón o los pulmones
   1. Eliminar gran parte de la piel que cubre el pecho que se extiende el borde derecho de laincisión de la piel original hacia abajo hasta el nivel de la apófisis xifoides, a continuación, a través de la línea media para ≈ 1,5 cm a la izquierda de la línea media.
      Nota: Se debe tener cuidado al cortar a través de los vasos mamarios externos, que pueden ser una fuente importante de sangrado. Cauterización de estos vasos antes de cortar los evitará en gran medida este sangrado.
   2. Utilizando disección roma, retraer el colgajo de piel lateralmente para exponer la musculatura subyacente.
   3. Aislar la inserción del pectoral mayor en el lado derecho cerca de la cara caudal del esternón utilizando el tanque de la dilatación de fórceps. Cauterizar y cortar el músculo.
   4. Cortar a través del pectoral mayor a lo largo de su unión con el esternón. Cauterizar los bordes de corte para asegurar la hemostasia.
   5. Siguiente socavar el dorsal ancho en el mismo lado, que es una hoja grande de músculo que cubre la cara lateral del ratón. Cauterizar y cortar este músculo y luego retraer el extremo cortado en sentido craneal. Esto puede requerir un poco romodisección.
      Nota: Las costillas son ahora claramente evidente y el corazón también pueden ser visibles en algunas cepas de ratón. En la mayoría de los ratones, que entra en el pecho en la mitad caudal de la cuarta espacio intercostal proporcionará un buen acceso al corazón. El cuarto espacio intercostal es el segundo espacio de más caudal.
   6. Para entrar en el pecho, utilice un par de pinzas cortantes para diseccionar cuidadosamente a través de las capas de músculo intercostal.
   7. Una vez que el espacio pleural se ha abierto, inserte con cuidado los dilatadores de los vasos de punta roma. El uso de los dilatadores de los vasos para proporcionar una fuerza suave hacia arriba en la pared torácica, utilizar las tijeras de punta roma resorte terminal para incidir con cuidado el resto de los músculos intercostales.
   8. Primer corte lateralmente, teniendo cuidado de no cortar el lóbulo pulmonar inferior. A continuación extender la incisión medial, pero se quedan 3 - 4 mm lateral de la línea media para evitar la arteria mamaria interna.
      Nota: Los vasos mamarios internos corren paralelas al esternóny puede resultar en la pérdida de sangre significativa si se corta accidentalmente.
   9. cauterizar cuidadosamente el borde del corte de los músculos intercostales, usando un aplicador con punta de algodón pequeño para rodar el tejido hacia arriba para permitir el contacto con el tejido cauterio corte sin entrar en contacto con los pulmones o el corazón.
   10. Poner una solución salina empapado pequeña punta de algodón aplicador través de la incisión que apunta hacia la línea media. Proporcionar una tracción suave hacia arriba para tirar de la pared torácica lejos de las estructuras subyacentes. Comience la cauterización de la pared torácica en el borde medial de la incisión y terminando ≈ 1 cm lateral de la línea media en el lado izquierdo.
   11. Avanzar en el aplicador a la izquierda de modo que es continuamente bajo la punta de cauterización.
   12. Una vez que el tejido se cauteriza fondo, utilice unas tijeras para cortar cuidadosamente a través del esternón. El vértice del corazón debe ser claramente visible en este momento.
   13. Utilizando disección roma, interrumpir el pericardio e identificar la vena cava caudal.
   14. Compruebe si hay evidencia de sangrado y cauterizar ahora. Una vez que todo el sangrado se ha abordado, retire con cuidado cualquier drapeado, la almohadilla de cauterización de puesta a tierra, y la gasa empapada solución salina.
7. Colocación del catéter de la vena yugular
   1. Conectar el catéter hecho en el paso 1.6.2 a la jeringa que contiene 10% de albúmina por el deslizamiento cuidadosamente el tubo a través de una aguja de calibre 30.
   2. Comience la infusión de la albúmina a través del catéter.
   3. Oriente el catéter de manera que la aguja se encuentra en la vena yugular por sí mismo, con la aguja de bisel hacia arriba. Si es necesario, utilizar un soporte de aguja para hacer girar la aguja en el tubo para mover el bisel a la orientación apropiada.
   4. Cuando el catéter está completamente enrojecida detener la infusión.
   5. Sujete la aguja del catéter con una pinza. Con la otra mano, utilice una pinza de tejido para retraer la glándula salival para permitir la visualización de la vena yugular. Aplicar una suave tracción de los tejidos que rodean la yugular distalvena crear tensión en la pared del vaso. El uso de un pequeño ángulo de enfoque, cuidadosamente inserte la aguja en la vena. Avanzar en la punta de la aguja 3 - 4 mm en el recipiente.
   6. Antes de liberar la aguja del catéter a asegurar el tubo del catéter con un trozo de cinta, esto limitará cualquier movimiento de la aguja una vez liberado.
   7. Liberar la aguja y suavemente tire hacia atrás del émbolo de la jeringa para confirmar que el catéter está en la luz del vaso, mediante la visualización de la sangre en la línea.
   8. Una vez colocado asegurar adecuadamente el catéter con pegamento quirúrgico para unir la aguja a las glándulas salivares subyacentes.
   9. Calcular el volumen total a ser infundido. Si no hubo pérdida significativa de sangre de un volumen / g de peso corporal 5 l será suficiente. Si hubo una pérdida importante de sangre infusión de 6 a 6,5 ​​l / g puede ser requerida. Ajuste el caudal de tal manera que toda la infusión será completa en el 10 - 15 min.
8. PV Colocación de catéter en elVentrículo izquierdo
   1. Durante el procedimiento quirúrgico descrito anteriormente, colocar el catéter PV en una jeringa que contiene una solución salina para permitir que se equilibre.
   2. Justo antes de la colocación, mueva la jeringa y el catéter al lado del ratón. Con la punta del catéter aproximadamente a la misma altura que el corazón, cero la lectura de presión.
   3. Usando una solución salina empapado pequeño aplicador con punta de algodón, maniobrar el corazón para permitir la visualización del vértice.
   4. Usando una aguja de calibre 25, hacer una incisión tan cerca del centro del ápice como sea posible.
   5. Después de la retirada de la aguja, insertar rápidamente el catéter a través de la incisión. No se necesita mucha fuerza para insertar el catéter, de modo que actúen con moderación cuando se hace avanzar el catéter en el ventrículo. De vez en cuando es necesario realizar una incisión adicional. Si esto es necesario, tratar de realizar la incisión posterior cerca de la ubicación inicial para minimizar el daño al corazón.
      NoE: Una vez que el catéter se avanza hacia el ventrículo la colocación final es de importancia crítica. El trazado de presión ventricular será evidente por una baja presión diastólica (<10 mmHg) y una presión sistólica alta (> 80 mmHg en este punto). Idealmente, el catéter estará centrado en el ventrículo con los electrodos exteriores sólo dentro del ventrículo. Los ajustes finos en la posición del catéter se puede realizar mediante la observación de los datos PV-loop, en busca de un trazado en forma de caja con ≈ 90 ° ángulos entre los lados.

3. Los detalles de procedimiento

Nota: Una vez que el catéter está en su lugar un breve período de estabilización (10 - 15 min) es necesario para que el animal pueda recuperarse de algo del estrés agudo quirúrgico y para dar tiempo a que la infusión de fluidos. Después de este período de estabilización del protocolo real puede empezar.

1. Una vez que el catéter se coloca PV y manipulación quirúrgica ha cesado,bajar el isoflurano a ≈ 1% como la necesidad de un plano quirúrgico de profundidad de la anestesia se reduce.
   1. Durante este período, vigilar cuidadosamente el ratón para asegurar que un nivel adecuado de anestesia se mantiene. evaluar cuidadosamente cualquier movimiento; movimiento de los músculos respiratorios sugiere un nivel de hipoventilación y se puede tratar mediante el aumento de la frecuencia respiratoria del ventilador. El movimiento de las extremidades o espasmos de los bigotes son signos de que el ratón se está haciendo demasiado ligera y requiere más anestesia.
      Nota: Hay una amplia variedad de permutaciones de los tratamientos que se pueden utilizar en combinación con este protocolo. Muchos de estos tratamientos requerirá infusión de fármacos. Es esencial para gestionar el volumen del espacio muerto con eficacia. interruptores de solución pueden llevarse a cabo deslizando el tubo de catéter de la aguja de una bomba de jeringa a la otra. Al hacer esto, poco antes del final de la infusión anterior permite que el tubo de catéter para ser cargadocon el siguiente de drogas. Es necesario conocer el volumen dentro del tubo de catéter para determinar el tiempo del interruptor de solución. La introducción de una pequeña burbuja de aire en la línea permite la sincronización exacta del interruptor de infusión que se determinarán; esta burbuja infundido en la circulación venosa es bien tolerado.
2. Alterar las condiciones de carga del corazón mediante la reducción de la precarga y la poscarga aumentando.
   1. Reducir precarga bloqueando el retorno venoso al corazón. En esta preparación, visualizar y ocluir la vena cava caudal a medida que pasa desde el diafragma al corazón. Realizar esta oclusión sin problemas y de forma relativamente rápida, que no duró más de 2 - 3 seg. Aumentar la poscarga ventricular izquierda transitoria mediante la realización de una compresión abdominal suave que dura 1 - 2 seg.
   2. Durante estos cambios en la carga del corazón, hacer una pausa en la respiración para eliminar cualquier artefacto introducido por el ventilador.
3. Calibrar la señal de volumen usando THcatéteres de conductancia e. Estos procedimientos no son necesarios con catéteres que utilizan la tecnología de admisión.
   1. Después de que el protocolo experimental inyectar 5 - 10 l de la solución salina hipertónica (20% NaCl) para calcular la conductancia en paralelo.
   2. Recoger la sangre por la retirada del catéter y la extracción de sangre desde el ventrículo izquierdo en una jeringa heparinizada. Coloque esta sangre en cubetas de volumen conocido y utilizar el catéter para medir la conductancia.
   3. Usar las medidas de conductancia cubeta para convertir la señal de conductancia al volumen y la conductancia en paralelo es necesario definir el volumen absoluto medido por el catéter.
4. Una vez que el protocolo se ha completado, la eutanasia el ratón mediante la eliminación del corazón después de la transección de la vena cava y la aorta adjuntos.

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Resultados

Por convención, el volumen se representa en el eje X y la presión en el eje Y como en la figura 1. Los bucles de presión-volumen resultante de una presión trazar contra volumen debe ser similar a un rectángulo, los bordes verticales que representan cambios isovolúmicos en la presión (es decir, cuando ambas válvulas mitral y aórtica están cerrados). La horizontal inferior representa ventricular llenado a través de la válvula mitral y la porción horiz...

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Discusión

Hay tres pasos críticos en este procedimiento: 1) la colocación del tubo endotraqueal y ventilación adecuada, 2) la colocación del catéter IV yugular, y 3) la colocación correcta del catéter PV en el ventrículo izquierdo. La determinación de la tasa respiratoria adecuada es una parte importante de proporcionar soporte ventilatorio. ratones conscientes generalmente mantienen la ventilación alveolar con respiraciones superficiales rápidas. En general, los ratones ventilados tendrán volúmenes corrientes mucho ...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dumont 5/45 (2)	Fine Science Tools	11251-33
Vessel Dilating Forceps	Fine Science Tools	18153-11
Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissor	Roboz Instruments	RS-5668
Octogon Forceps - Serrated/Curved	Fine Science Tools	11041-08
Octogon Forceps - Serrated/Straight	Fine Science Tools	11040-08
Dissector Scissors- Heavy Blade	Fine Science Tools	14082-09
Transpore Surgical Tape	3M	1527-1
3-0 Silk Suture	Fine Science Tools	18020-30
TOPO Ventilator	Kent Scientific	TOPO
Martin ME 102 Electrosurgical Unit	Harvard Apparatus	PY2 72-2484
Syringe Pump	Lucca Technologies	GenieTouch
Stereomicroscope with boom stand	Nikon	SMZ-800N
Thermocouple Thermometer	Cole Parmer	EW-91100-40
T/Pump Warm Water Recirculator	Kent Scientific	TP-700
ADVantage Pressure-Volume System	Transonic	ADV500
Data Acquision and Analysis	DSI	Ponemah ACQ-16