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  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

En este estudio, se empleó una cámara de flujo nano-microfluidos de visualizar y caracterizar funcionalmente la motilidad espasmos de Xylella fastidiosa, una bacteria que causa la enfermedad de Pierce en la vid.

Resumen

Xylella fastidiosa es una bacteria no flagelado Gram-negativa que provoca una serie de enfermedades económicamente importantes de plantas. La motilidad espasmos ofrece X. fastidiosa un medio para el movimiento de larga distancia dentro de la planta y la colonización, que contribuye a la patogenicidad en X. fastidiosa. La motilidad espasmos de X. fastidiosa es operado por pili de tipo IV. Pili de tipo IV de Xylella fastidiosa están regulados por Pilg, un regulador de la quimiotaxis de Pil-CHP proteínas operón codificación que están involucrados con las vías de transducción de señales. Para dilucidar el papel de los Pilg en la motilidad espasmos de X. fastidiosa, una Pere-deficiente mutante Xf ΔpilG y su cepa complementaria XfΔpilG- C que contiene nativa Pilg se desarrollaron. A las cámaras de microfluidos integrados con un sistema de grabación de la imagen de lapso de tiempo fue utilizado para observar la motilidad espasmos en XfΔpIlg, XfΔpilG- C y su cepa de tipo salvaje. El uso de este sistema de grabación, que permite observaciones espaciales y temporales a largo plazo de la agregación, la migración de las células y las poblaciones de bacterias a través de la motilidad espasmos individuales. X. de tipo salvaje y fastidiosa cepa complementaria XfΔpilG- C mostraron características típicas contracciones de la motilidad observados directamente en las cámaras de flujo de microfluidos, mientras que el mutante XfΔpliG exhibe el fenotipo deficiente espasmos. Este estudio demuestra que Pilg contribuye a la motilidad espasmos de X. fastidiosa. La cámara de flujo de microfluidos se utiliza como un medio para la observación de la motilidad espasmos.

Introducción

Xylella fastidiosa es una bacteria Gram-negativa no flagelado, patógeno que causa una serie de enfermedades de los cultivos económicamente importantes, incluyendo la enfermedad de Pierce en la vid (Vitis vinifera L.) 1,2, 3. Esta bacteria se limita a la xilema conductor de agua vasos. La infección de la vid provoca la obstrucción de los vasos del xilema y resulta en estrés hídrico y las deficiencias nutricionales 3. La colonización exitosa depende de la capacidad de la bacteria para moverse desde el sitio inicial de la infección con el resto de la planta 3. Contracciones la motilidad es un medio de movimiento flagelar bacteriano-independiente a través de la extensión, el apego y la retracción de la IV pili de tipo polar 4 que se ha caracterizado en X. 5,6,7 fastidiosa.

La motilidad espasmos ha sido observado por pinzas láser y microscopía de fuerza atómica (AFM) 8,9,10. Utilizando estas técnicas, tmotilidades witching generado por tipo IV pilus de N. gonorrhoeae y P. aeruginosa se ​​caracteriza por fl pili etiquetado uorescently y la captura de sus movimientos al microscopio. Aunque ambos métodos han detallado la fuerza de adhesión de las bacterias individuales, los procedimientos son complicados y consume mucho tiempo 9,10. Las cámaras uidic fl micro se utilizaron para observar la migración de larga distancia de las células individuales, así como pequeños agregados de células bacterianas 5,6. Estas cámaras se han diseñado como un nano-canal microfabricado en una placa integrada con un lapso de tiempo 11,12,13,14 sistema de grabación de imágenes. Micro fl dispositivos de cámara uidic ofrecen varias ventajas para el estudio de la conducta y el movimiento de célula a célula interacciones de las bacterias: (i) Proporciona una plataforma integrada que tiene múltiples capacidades de canal; (Ii) le corresponde examinar las mociones y agregaciones de células individuales en las características de escala nanométrica de las bacterias; (Iii) que permite m directaicroscopic grabación de imágenes de las células bacterianas y realizar un análisis cronológico, (iv) que proporciona observaciones espaciales y temporales a largo plazo de las poblaciones individuales y / o de bacterias en un micro-ambiente; (V) la velocidad de flujo de medio de cultivo en un canal puede ser controlada con precisión y es necesario (vi) solamente un volumen muy pequeño (1 ml) de medio de cultivo para cada experimento.

Recientemente, la micro fl uidic flujo sistema se ha empleado para investigar el comportamiento de las células bacterianas bajo diversos microambientes 14,15,16. La adhesividad y el accesorio de superficie de E. coli 15, X. fastidiosa 16, y Acidovorax citrulli 14 a las superficies de vidrio se evaluaron utilizando cámaras uidic micro fl. La formación de agregación y bio fi lm mediada por pili de tipo IV de Acidovorax citrulli se analizaron 14. Además, el movimiento de A. citrulli observó bajo flujo condiciones demostraron que los pili de tipo IV puede desempeñar un papel importante en la colonización y la propagación de A. citrulli en los vasos del xilema savia bajo condiciones de flujo. Las contracciones motilidades de Pseudomonas aeruginosa y X. fastidiosa células se observaron con éxito contra una corriente de fluido en una cámara de flujo microfabricado 5,6,17. Tipo IV pilus deficiente PilB y pilQ mutantes de X. fastidiosa se ​​encontraron a alterar profundamente la velocidad de la motilidad espasmos en las condiciones de fluencia en dispositivos micro fl uidic 5,6,18. Los estudios realizados sobre la adhesión bacteriana y la motilidad en dispositivos uidic fl micro indicaron que las cámaras uidic micro fl son particularmente adecuados para el análisis de la motilidad espasmos y la migración de bacterias mediada por pili in vitro. Estos resultados explican el mecanismo de la migración mediada por contracciones que facilita la fijación célula-célula, la agregación y la colonización dentro deel anfitrión, eventualmente conducir a la infección sistémica.

Pil-CHP operón de X. fastidiosa contiene Pilg, Pili, pilJ, píldora, chpB y CHPC el que la transducción de señales codifican las vías 20. Los quimiorreceptores transmembrana se unen estímulos químicos en el dominio periplásmico y activan una cascada de señalización en su porción citoplasmática de controlar en última instancia, la motilidad bacteriana espasmos. En el operón pil-CHP de X. fastidiosa, una proteína Pilg fosfo-lanzadera es un homólogo de CheY. En E. coli y P. aeruginosa, CheY es el regulador de la respuesta de quimiotaxis en los sistemas que interactúan con las proteínas motoras flagelos 19, 21. A pesar de las contribuciones del operón pil-CHP hacia la virulencia en X. fastidiosa se ​​examinaron recientemente 20, el papel de Pilg en operón quimiotaxis en respuesta a las señales del medio ambiente y para regulada / motor de tipo IV pili de X. fastidiosa es uncLear. Para dilucidar la visión del regulador de la quimiotaxis Pilg en la actividad de la motilidad espasmos de X. fastidiosa, una cámara de uidic fl micro se utiliza para evaluar la motilidad espasmos de X. fastidiosa. El Pilg de X. fastidiosa se ​​caracteriza mediante la comparación de los fenotipos de un mutante de deleción Xf ΔpliG, cepa complementaria XfΔpliG -C y su tipo salvaje in vitro. Los resultados ponen de manifiesto el papel de Pilg en la motilidad espasmos de X. fastidiosa.

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Protocolo

1. El periférico de la franja de la colonia bacteriana

  1. Crecer X. fastidiosa (XF) Temecula tipo salvaje 22, Pilg supresión mutante Xf ΔpliG (usando la estrategia descrita previamente deleción 23), y su complementario XfΔpliG -C (utilizando anteriormente descrito estrategia de complementación genética basada en el cromosoma 24) en placas de agar medio PD2 25 a los 28 ° C durante 5-7 días.
  2. Celofán Autoclave (1 x 1 cm 2) en agua a 121 ° C (249 ° F) durante 15 min. Recoger una pieza de celofán, drenar el agua tocando una esquina de celofán en un plato de Petri vacía, coloque cuidadosamente el celofán más del 15% de la superficie del agar y secar al aire.
  3. Recoge individuo X. colonias fastidiosa con palillos de dientes redondeados y células contado estéril asépticamente en una hoja de papel de celofán esterilizada superpuesto al 15% de la superficie de agar en las placas de agar. Se incuba la placas a 28 ° C durante 2-3 días.
  4. Examinar la morfología borde de las colonias utilizando un microscopio de disección con una lente de objetivo 2X y una lente ocular 10X. Fotografiar la franja periférica alrededor de las colonias.

2. Microscopía y cámaras de flujo de microfluidos

  1. Fabricar dispositivos microfluídicos utilizando procedimientos fotolitográficas similares a los descritos previamente 5,18. Diseñar cuatro canales paralelos con el software de diseño asistido por ordenador sobre la oblea de silicio maestro con las técnicas litográficas estándar 26.
  2. Crear las cámaras de microfluidos de maestro oblea de silicio con polidimetilsiloxano (PDMS). Verter PDMS no polimerizados sobre el master oblea de silicio y curarlo a 60 ° C durante 1 hr. Despegar la réplica de PDMS del maestro oblea y recortar la réplica de PDMS con una cuchilla en un 22 mm x 40 mm como el mismo tamaño de un cubreobjetos de vidrio.
  3. Exponer la réplica de PDMS, un cubreobjetos de vidrio (22 x 40 mm 2), y un Microscdiapositiva OPE (51 x 76 mm 2) de plasma de aire a 30 W durante 2 min 27. Sandwich del cuerpo PDMS entre el cubreobjetos de vidrio y el vidrio para microscopio para construir la cámara de uidic fl micro.
  4. Perforar un agujero (5,5 mm de diámetro) a través de los PDMS en cada extremo de la canal con patrón. Cortar el tubo de goma de silicona en 12-20 cm de largo. Inserte un extremo del tubo de goma de silicona (5,1 mm de diámetro exterior, 2,1 mm de diámetro interior, pared de 0,8 mm) en cada extremo de la apertura de los canales de la réplica de PDMS, y sellarlo con PDMS no polimerizadas a 60 ° C durante 1 hora.
  5. Conectar otro extremo de la tubería en el extremo de púas de conectores luer de plástico. Envolver las cámaras de microfluidos ensamblados con la hoja de aluminio y esterilizar en autoclave durante 20 min.
  6. Recoger las bacterias células de X. fastidiosa tipo salvaje, mutante Xf ΔpliG, y complementaria XfΔpliG -C mediante raspado, mediante inoculación desechable bucles de PD2 placas de medio. Ajuste densidad celulara una densidad óptica de 0,05 a 600 nm en caldo PD2 como se describió anteriormente 23. Recoger la solución de células bacterianas en una jeringa de 1 ml Gastight.
  7. Montar el dispositivo de microfluidos en una platina del microscopio invertido. Conectar un tubo de entrada a la jeringa Gastight 5 ml que contenía caldo PD2. Montar el 5 ml Gastight jeringa con las bombas de jeringa.
  8. Conectar el tubo de salida a un depósito de residuos. Mantener un caudal medio de 0,2 min -1 l durante 30 min para estabilizar el sistema.
  9. Conectar los tubos del lado de entrada a un 1 ml de la jeringa que contiene la solución Gastight célula bacteriana. Lavar la solución de células de bacterias a través del tubo de goma hasta que se alcanza el canal. Mantener un caudal medio de 0,2 l min -1 durante otros 30 minutos con el fin de eliminar las células no unidas de la cámara antes de la captura de imágenes.
  10. Montar el obturador microscopio bajo la parte ajustada campo del microscopio para controlar la luz. Conectar el obturador a la co obturadorntrol sistema y conectar el sistema de control del obturador a la computadora.
  11. Montar una cámara digital al puerto de vídeo del microscopio y conectarlo a la computadora. Ejecutar el software de grabación de lapso de tiempo, seleccione la función "disparador" del menú, y reconocer automáticamente el obturador instalado por defecto en el software para establecer conexiones con el obturador con el software.
  12. Seleccione la función "cámara digital" en el menú del software de grabación de lapso de tiempo para reconocer automáticamente la cámara digital como dispositivo de captura por defecto en el software y establecer comunicación con la cámara digital con el software.
  13. Localizar las células bacterianas en uno de los canales usando 20X óptica de contraste de fase, luego cambiar a la lente objetivo de 40X antes de la captura de imágenes.
  14. Ejecutar el software de grabación de lapso de tiempo, seleccione la función "adquisición de imágenes" usando los parámetros por defecto en el menú para adquirir las imágenes del microscopio.A continuación, abra la función "Adquirir lapso de tiempo" y establecer el intervalo de tiempo de 30 seg 5,18,28 por la duración de 6-24 h según el experimento necesario para observar espasmos motilidad de X. fastidiosa 5,18,28. Haga clic en "OK" para iniciar la grabación de lapso de tiempo. Haga clic en "Función de pila" del menú, seleccione "Guardar como" para apilar las imágenes de la carpeta de destino en el equipo después de finalizar la grabación.
  15. Para múltiples canales, la captura de imágenes con lapso de tiempo desde el primer canal cada 30 segundos durante 6 horas. Mover la lente del objetivo del microscopio para el siguiente canal para localizar las células diana. Repita la función de lapso de tiempo como se describió anteriormente para capturar imágenes en cada uno de cuatro canales secuencialmente si experimento está configurado para utilizar cuatro canales. Continuar la captura de la imagen de lapso de tiempo de hasta tres días consecutivos. Todos los experimentos se realizaron a temperatura ambiente (23 ± 2 ° C).
  16. Compilar las imágenes con lapso de tiempo en unaarchivo de vídeo utilizando el software de imágenes de la grabación de lapso de tiempo. ejecutar el software de grabación de lapso de tiempo, haga clic en "Función de pila" en el menú, y seleccione "función de pila abierta" para abrir los archivos apilados desde el ordenador.
  17. Iniciar la función "Crear película" desde el módulo de pila, la selección de todas las imágenes y elegir el formato de salida "AVI". Haga clic en "Guardar como" para guardar el archivo de vídeo en la carpeta de destino en el equipo.
  18. Seleccione las películas elaboradas a partir de la carpeta de destino en el ordenador y reproducirlos. A continuación, observar la motilidad de las células individuales a través de la visualización resultante de la actividad espasmos motilidad de las células de bacterias en los archivos de vídeo generados.

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Resultados

La presencia de una franja periférica colonia indicativo de tipo IV pilus mediada motilidad espasmos, se observó en las colonias de X. de tipo salvaje y fastidiosa cepa Xf ΔpliG -C complementaria (Figura 1). Mutant XfΔpliG, sin embargo, no presentó una franja alrededor de la periferia de las colonias (Figura 1). Time-lapse de las células bacterianas en cámaras de flujo nano-microfluidos reveló que cris...

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Discusión

En este estudio, hemos caracterizado el comportamiento de movimiento de X. fastidiosa Pilg mutante Xf ΔpilG y sus complementarias cepas XfΔpilG- C de nuevo diseño en-nano-canales paralelos múltiples cámaras micro fl uidic. Las cámaras uidic de nuevo diseño micro FL puede tener hasta cuatro cámaras paralelas con 100 micras nano-canal de ancho en comparación con diseños anteriores con solo un 50 micras de ancho del canal 18. Cuanto más amplia sea la nano-c...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

Este estudio fue apoyado por el Departamento de Agricultura de Estados Unidos, Servicio de Investigación Agrícola. nombres comerciales o productos comerciales en esta publicación se mencionan únicamente con el propósito de proporcionar información específica y no implica ninguna recomendación o aprobación por el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos. USDA es un proveedor y empleador que ofrece igualdad de oportunidades.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Biology materials
X. fastidiosa (Xf) Temecula wild typeCosta, H. S., et al., 2004 22
pilG deletion mutant XfΔpliGShi, X. Y., et al., 2007 26
pilG complementary strain XfΔpliG-C Davis, M. J., et al. 1998 23
Physical materials and equipment
Disposable inoculating loopsVWR international, Radnor, PA#22-363-607quantitative procedures such as bacterial collection
Polydimethylsiloxane (PDMS)Dow Corning Corporation#0002709226Sylgard 184 silicone Elastomeric Kits
AmScope MD2000 digital cameraAmScope, Irvine, CASE305R-AZ-EImage, video recording and measurement 
Tubes lineEdgewood, NY#T4300Connected to the syringe and microfluidic chamber
Plastic luer connectorsEdgewood, NYConnected to the syringe and microfluidic chamber
Syringe pumpsPico Plus, Harvard Apparatus, MA#702209The flow rate can be adjusted while the pump is running.
SyringesGastight, Hemilton Company, Reno, NV#1005Provide the flowing broth
Inverted Olympus IMT-2 microscopeOlympusIMT-2 FLuoro PHaseImage observation and recording
SPOT-RT digital cameraDiagnostic Instruments, Inc., MIRT230Image, video recording and measurement
Microscope ShutterThe UNIBLITZ, US#LS2T2Control camera’s exposure time
Microscope Shutter Control systemThe UNIBLITZ, USVCM-D1VCM-D1 Single Channel CE/UL/CSA Approved Shutter Driver
MetaMorph Image softwareUniversal Imaging Corp., PAReal-time super-resolution image processing 

Referencias

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