De un solo paso negativo Purificación cromatográfica de<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; La proteína activadora de neutrófilos sobreexpresa en<em&gt; Escherichia coli</em&gt; En modo batch

Resumen

Un método de alto rendimiento para la purificación negativa de un solo paso de Helicobacter pylori recombinante proteína activadora de neutrófilos (HP-PAN) sobreexpresado en Escherichia coli mediante el uso de resinas de dietilaminoetilo en modo batch se describe. HP-PAN purificado por este método es beneficioso para el desarrollo de vacunas, medicamentos o diagnósticos para H. pylori -asociado enfermedades.

Resumen

Helicobacter pylori proteína activadora de neutrófilos (HP-PAN) es un importante factor de virulencia de Helicobacter pylori (H. pylori). Desempeña un papel crítico en H. pylori inducida por inflamación gástrica mediante la activación de varios leucocitos innatos incluyendo neutrófilos, monocitos y mastocitos. Las propiedades inmunogénicas e inmunomoduladoras de HP-NAP lo convierten en un candidato potencial de diagnóstico y de vacuna para H. pylori y un nuevo fármaco candidato para la terapia del cáncer. Con el fin de obtener cantidades sustanciales de purificado HP-NAP utilizado por sus aplicaciones clínicas, un método eficaz para purificar esta proteína con alto rendimiento y pureza necesita ser establecido.

En este protocolo, hemos descrito un método para una sola etapa de purificación cromatográfica negativo de HP-NAP recombinante sobreexpresada en Escherichia coli (E. coli) mediante el uso de dietilaminoetilo resinas de intercambio iónico (DEAE) (por ejemplo., Sephadex) iel modo por lotes n. Recombinante HP-PAN constituye casi el 70% del total de proteínas en E. coli y está casi completamente recuperado en la fracción soluble tras la lisis celular a un pH de 9,0. Bajo la condición óptima a pH 8,0, la mayoría de HP-NAP se recupera en la fracción no unida, mientras que las proteínas endógenas de E. coli se eliminan de manera eficiente por la resina.

Este método de purificación mediante cromatografía de lote modo negativo con resinas de intercambio iónico DEAE produce funcional HP-NAP de E. coli en su forma nativa con alto rendimiento y pureza. El HP-PAN purificada podría ser utilizado más para la prevención, tratamiento y pronóstico de la H. pylori -asociado enfermedades, así como la terapia del cáncer.

Introducción

Helicobacter pylori (H. pylori) es una causa importante de gastritis y úlcera péptica. Esta bacteria también ha sido clasificado como un carcinógeno en humanos por parte de la Agencia Internacional para la Investigación sobre el Cáncer, que forma parte de la Organización Mundial de la Salud, en el año 1994. Se ha estimado que la prevalencia de H. pylori es del 70% en los países en desarrollo y del 30-40% en los países industrializados ^1. A pesar de que la tasa de infección de H. pylori está disminuyendo en los países industrializados, la tasa de infección de H. pylori en los países en desarrollo sigue siendo alta ^2. El tratamiento estándar para erradicar H. pylori consiste en la administración de un inhibidor de la bomba de protones, IBP y dos antibióticos, claritromicina o metronidazol más amoxicilina ^3. Sin embargo, el aumento de la resistencia a los antibióticos en H. pylori relacionados con la PI terapia de úlceras insta al desarrollo de nuevas estrategias para prevenir or curar la infección. Desarrollo de la vacunación preventiva y / o terapéutica contra H. pylori podría proporcionar un enfoque alternativo para el control de H. pylori.

Helicobacter pylori proteína activadora de neutrófilos (NAP-HP), un importante factor de virulencia de H pylori, se identificó por primera vez en extractos de agua de H. pylori con la capacidad de activar los neutrófilos a adherirse a las células endoteliales y producir especies de oxígeno reactivas (ROS) ^4. La infiltración de neutrófilos de la mucosa gástrica se encuentra en H. pylori pacientes infectados con gastritis activa pueden resultar en la inflamación y el daño tisular del estómago. Por lo tanto, HP-NAP puede jugar un papel patológico mediante la activación de los neutrófilos para inducir inflamación gástrica, lo que hace aún más úlcera o H. pylori -asociado enfermedades gástricas. Sin embargo, HP-PAN es un candidato potencial para aplicaciones clínicas ^5,6. Debido a la pro inmunogénica e inmunomoduladorpiedades de HP-NAP, esta proteína se podrían utilizar para desarrollar vacunas, agentes terapéuticos, y herramientas de diagnóstico. Un ensayo clínico se ha realizado para el uso de HP-NAP recombinante como uno de los componentes de una vacuna de proteína contra H. pylori. Esta vacuna consiste en HP-NAP recombinante, asociado a la citotoxina gen A (CagA), y las proteínas vacuolizante citotoxina A (VacA) formulado con hidróxido de aluminio y además se ha demostrado que es segura e inmunogénica en humanos ^7. Además, HP-PAN actúa como un potente inmunomodulador para desencadenar T auxiliares de tipo 1 (Th1) -polarized respuestas inmunes para la terapia del cáncer ⁸ y para regular hacia abajo las respuestas inmunitarias mediadas por Th2 provocadas por reacciones alérgicas e infecciones parasitarias ^9,10. Como para el diagnóstico, recombinante ELISA basado en HP-PAN se ha aplicado a la detección de anticuerpos séricos contra HP-NAP en H. pylori pacientes infectados ^11. Un estudio mostró que el nivel de anticuerpos HP-PAN-específica en sueros de H. pylori pacientes infectados con cáncer gástrico fue significativamente mayor que la de los pacientes con gastritis crónica ^12. Otro estudio también demostró que los anticuerpos séricos contra HP-NAP se asocian con la presencia de no cardia adenocarcinoma gástrico ^13. Por lo tanto, recombinante ELISA basado en HP-NAP se puede aplicar a la detección de anticuerpos séricos contra HP-NAP para el pronóstico del cáncer gástrico en H. pylori pacientes infectados. En su conjunto, el HP-PAN purificada podría ser utilizado más para la prevención, tratamiento y pronóstico de la H. pylori -asociado enfermedades, así como la terapia del cáncer.

Entre los diversos métodos utilizados para la purificación de recombinante HP-NAP expresado en Escherichia coli (E. coli) en su forma nativa informado hasta ahora, se necesita una cromatografía de filtración en gel segunda etapa de purificación que implica obtener alta pureza HP-NAP ^14-16 . Aquí, un método que utiliza cromatografía de modo por lotes negativa condietilaminoetilo (DEAE) resinas de intercambio iónico se describe para la purificación de HP-NAP sobreexpresa en E. coli con alto rendimiento y alta pureza. Esta técnica de purificación se basa en la unión de proteínas y / o impurezas que no sean HP-PAN a la resina de la célula huésped. A pH 8,0, casi no hay otras proteínas, excepto HP-NAP se recuperan de la fracción no unida. Este enfoque purificación utilizando cromatografía de intercambio iónico de DEAE en el modo negativo es simple y ahorrando al permitir la purificación de HP-PAN recombinante mediante cromatografía de un solo paso a través de la recogida de la fracción no unida tiempo. Además de HP-NAP, varias otras biomoléculas, tales como virus ^17, la inmunoglobulina G (IgG) ^18, la hemoglobina ^19, la proteína fosfatasa ^20, y el factor de virulencia flagelina ^21, también se han informado de que se purificó por cromatografía de intercambio de iones en negativo modo. Se prefiere el modo negativo para la cromatografía de intercambio iónico, si las impurezas son el menorcomponentes presentes en la muestra sometida a purificarse ^22. La aplicación de la cromatografía negativo en la purificación de biomoléculas naturales o recombinantes se ha revisado recientemente ^23.

El presente informe ofrece un paso a paso el protocolo para la expresión de HP-PAN recombinante en E. coli, lisis de las células, y la purificación de HP-NAP usando cromatografía por lotes modo negativo con resinas de intercambio iónico de DEAE. Si una proteína deseada para la purificación es adecuado para cromatografía de intercambio iónico en el modo negativo, el protocolo descrito también podría ser adaptado como punto de partida para el desarrollo de un proceso de purificación.

Protocolo

La sangre humana se obtuvo de voluntarios sanos con consentimiento informado por escrito antes y aprobación de la Junta de Revisión Institucional de la Universidad Nacional Tsing Hua, en Hsinchu, Taiwán.

1. La expresión del recombinante HP-PAN en E. coli

1. Preparar el plásmido pET42a-NAP que contiene la secuencia de ADN de HP-NAP de H. pylori cepa 26695 ¹⁶ como se describió previamente. Preparar los plásmidos que contienen la secuencia de ADN de HP-NAP con las mutaciones puntuales deseadas como se describe (véase el Protocolo, paso 8).
2. Transformar 10 ng de los plásmidos de ADN anteriores en E. coli BL21 (DE3) células competentes por choque térmico durante 45 segundos a 42 ° C, las células consecutivas en caldo lysogeny (LB) placas de agar que contenían 50 mg / ml de kanamicina, e incubar las placas a 37 ° C durante 16 horas.
3. Inocular colonias individuales en tubos individuales que contienen 5 ml de caldo LB con 50 mg / ml de kanamicina y crecer como cultivos previos en 37 ° C durante 16 horas con agitación a 170 rpm.
4. Inocular 2 ml de las células pre-cultivo anterior en 200 ml de caldo LB que contenía 50 mg / ml de kanamicina en un matraz de 1 L. Incubar el matraz de cultivo inoculado a 37 ° C durante 2 horas con agitación a 170 rpm hasta que la absorbancia a 600 nm alcanza aproximadamente desde 0,4 hasta 0,5 detectado por un espectrofotómetro UV / VIS.
5. Añadir 80 l de 1 M isopropílico β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) en el cultivo anterior a una concentración final de 0,4 mM para inducir la expresión de HP-NAP. Incubar el cultivo durante 3 horas hasta que la absorbancia a 600 nm alcanza aproximadamente 1/6 a 1/7.
6. Centrifugar las células a 6000 xga 4 ° C durante 15 minutos para eliminar el sobrenadante. Almacenar el sedimento de células a -70 ° C hasta la purificación.

2. Preparación de la fracción de proteína soluble que contiene HP-PAN

Nota: Todas las siguientes etapas se llevan a cabo a 4 ° C.

1. Resuspender 50 ml de la célula pEllet preparado en el Protocolo de paso 1,6 en 20 ml de 20 mM Tris-HCl, pH 9,0, NaCl 50 mM que contiene 0,13 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), 0,03 mM N-alfa-tosil-L-lisinil-clorometilcetona (TLCK), y 0,03 mM N-tosil-L-phenylalaninyl-clorometilcetona (TPCK) a 4 ° C como se ha descrito previamente ^16.
2. Romper las células de bacterias haciendo pasar la suspensión bacteriana a través de un homogeneizador de alta presión que funciona a una gama de 15.000 a 20.000 psi durante 7 veces a 4 ° C.
3. Centrifugar el lisado de células a 30.000 × g a 4 ° C durante 1 hora para separar las fracciones de proteínas solubles e insolubles mediante el uso de una ultracentrífuga. Transferir el sobrenadante como la fracción de proteína soluble a un vaso de precipitados.
4. Medir la concentración de proteína de la fracción de proteína soluble por el método de Bradford utilizando un kit comercial con albúmina de suero bovino (BSA) como el estándar de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
5. Añadir 177,6 l de HCl 1 N en 20 ml de THe fracción de proteína soluble obtenida de Protocolo paso 2.3, para ajustar el valor de pH desde pH 9,0 a pH 8,0.
6. Añadir 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 50 mM a la solución de proteína de arriba para hacer la concentración de proteínas final sea 0,5 mg / ml.

3. Purificación de recombinante HP-NAP de E. coli mediante cromatografía modo por lotes negativo con resinas de intercambio iónico DEAE

1. Preparar 15 ml de resinas DEAE.
   1. Pesar 0,6 g de polvo seco de resinas DEAE y suspenderlo en 30 ml de 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 50 mM a temperatura ambiente durante al menos 1 día.
   2. Se centrifuga la resina a 10.000 x g a 4 ° C durante 1 min.
   3. Retirar y desechar el sobrenadante.
   4. Añadir 15 ml de 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 50 mM.
   5. Repetir los pasos Protocolo 3.1.2 a 3.1.4 de cuatro veces más.
   6. Almacenar los 15 ml se establecieron resina (suspensión al 50% en 30 ml de tampón Tris) a 4 ° C para su uso posterior.
      Nota: Todos los siguientes pasoss se llevan a cabo a 4 ° C.
2. Añadir 45 ml de las proteínas solubles preparadas en el Protocolo paso 2,6-15 ml de la resina y se agita la suspensión de proteína / resina con un agitador magnético a 4 ° C durante 1 hr.
3. Se vierte la suspensión de proteína / resina en una columna de plástico o de vidrio equipado con una llave de paso. Deje que la resina se asiente por gravedad.
4. Abrir la llave de paso para permitir que la solución de proteína a través de la columna por flujo de gravedad hasta que el nivel de líquido en la columna es justo por encima de la resina. Recoger el flujo a través de como la fracción no unida, que contiene el purificada HP-NAP.
5. Añadir 15 ml de helado de 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 50 mM en la columna.
6. Abrir la llave de paso para permitir que el tampón de lavado a través de la columna por flujo de gravedad hasta que el nivel de líquido en la columna es justo por encima de la resina. Recoger el flujo a través de como la fracción de lavado.
7. Repetir los pasos Protocolo de 3.5 a 3.6 cuatro veces más para recoger las fracciones de lavado adicionales.
8. Añadir 15 ml de helado de 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 M NaCl en una columna.
9. Abrir la llave de paso para permitir que el tampón de elución a través de la columna por flujo de gravedad hasta que el nivel de líquido en la columna es justo por encima de la resina. Recoger el flujo a través de como la fracción de elución.
10. Repetir los pasos Protocolo de 3,8 a 3,9 cuatro veces más para recoger las fracciones de elución adicionales.

4. El cambio de tampón y la eliminación de endotoxina de HP-PAN purificó mediante cromatografía en modo batch negativa con DEAE Resinas

Nota: El purificada HP-NAP expresa en E. coli tiene que ser sometido a intercambio de tampón y la eliminación de endotoxina antes de estimular neutrófilos.

1. Realizar la diálisis para cambiar el tampón de la purificado HP-PAN a la solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (D-PBS), pH 7,2, a 4 ° C mediante el uso de un tubo de diálisis con corte de peso molecular de 14 kDa como se ha descrito previamente ^24.
2. Se filtra la HP-PAN se dializa a través de un syringfiltro de correo con una membrana cargada positivamente, hidrófila unida a una jeringa desechable de 20 ml a velocidades de flujo entre 2,5 y 4 ml / minuto a 4 ° C para eliminar la endotoxina.

5. Caracterización de las propiedades moleculares de recombinante purificada HP-PAN por dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida electroforesis en gel (SDS-PAGE), Western Blot, nativo-PAGE, cromatografía de filtración en gel y dicroísmo circular Espectroscopía

1. Analizar el purificada HP-NAP recombinante por SDS-PAGE y transferencia Western con sobrenadantes de cultivo de hibridoma que contiene el anticuerpo monoclonal de ratón MAb 16F4 ²⁵ como se describió anteriormente ^24.
2. Analizar el HP-PAN se purifica mediante nativo-PAGE y cromatografía de filtración en gel para examinar su estado oligomérico como se ha descrito previamente ^26.
3. Analizar el purificada HP-PAN recombinante mediante espectroscopía de dicroísmo circular para examinar su estructura secundaria como se ha descrito previamente ^26.

6. Evaluación de la pureza de HP-PAN por tinción de plata de un gel SDS-PAGE

1. Preparar la solución de fijación, solución, solución de plata, solución de revelado sensibilizante, la solución de parada, y la solución de lavado de acuerdo con las instrucciones del fabricante de un kit de tinción de plata.
2. Realizar tinción de plata de un gel SDS-PAGE de acuerdo con las instrucciones del fabricante de un kit de tinción de plata.
3. Adquirir la imagen del gel con un sistema de imagen.

7. Medición de la Producción de ROS por los neutrófilos inducida por HP-PAN

1. Aislar los neutrófilos humanos a partir de sangre heparinizada humana mediante sedimentación con dextrano seguido de centrifugación en gradiente de densidad como se describió anteriormente ^24.
2. Medición de la producción de ROS por los neutrófilos estimulados con HP-NAP mediante el uso de un ensayo de quimioluminiscencia de luminol-dependiente.
   1. Encienda un lector de placas y ajustar la temperatura a 37 ° C. Coloque unainferior plato vacío plana de 96 pocillos blanca dentro de la cámara de lector de placas, lo que permite que se caliente a 37 ° C.
   2. Preparar las mezclas de estímulo en el D-PBS, pH 7,2, que contiene 0,9 mM CaCl _2, 0,5 mM MgCl _2, y 13,3 M 5-amino-2,3-dihidro-1,4-phthalazinedione (luminol) con la presencia y ausencia de 0,67 M-endotoxina eliminado HP-PAN preparado a partir de Protocolo paso 4.2.
   3. Ajustar la concentración de neutrófilos humanos preparados a partir de Protocolo de paso 7,1 a 2 x 10 ⁶ células / ml en D-PBS, pH 7,2, que contenía glucosa 5 mM.
   4. Añadir 50 l de suspensión de neutrófilos en cada pocillo de la placa de 96 pocillos tiempo.
   5. Añadir 150 l de las mezclas preparadas a partir de estímulo Protocolo paso 7.2.2 en los neutrófilos así que contienen en un intervalo de tiempo de 5 segundos por pocillo.
   6. Medir la emisión de quimioluminiscencia durante 5 segundos por pocillo durante un período de tres horas usando un lector de placas.

8.Construcción de plásmidos de ADN que albergan HP-PAN mutantes por Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR) a base de mutagénesis directa

Nota: mutagénesis directa basada en PCR fue generado básicamente como se ha descrito previamente ^27, excepto que los sitios de restricción "silenciosas" fueron introducidos en los cebadores de mutagénesis por mutagénesis dirigida (SDM) software -Ayudar ^28.

1. Realizar la reacción de PCR.
   1. Añadir 10 ng de plásmido pET42a-NAP, 1 M de pares de cebadores de mutagénesis listados en la Tabla 1, 200 mM de trifosfatos de desoxinucleósidos (dNTP), y 3 unidades de alta fidelidad mezcla de enzimas PCR en un tubo de PCR que contiene agua desionizada, dando una final volumen de 25 l.
   2. Iniciar los ciclos de PCR en 95 ° C durante 10 minutos para desnaturalizar el ADN molde, y sigue con 12 ciclos de amplificación a 95 ° C durante 1 minuto, _{Tm sin} -5 ° C durante 1 minuto y 72 ^° C durante 6 minutos.
   3. Terminar los ciclos de PCR conuna etapa de recocido en T _{m pp} -5 ^° C durante 1 minuto y una etapa de extensión a 72 ° C durante 30 min.
2. Tratar 15 l de producto de PCR con 0,4 l de enzima de restricción Dpn I a 37 ° C durante 2 horas y luego analizar 2 l del producto de PCR tratado con Dpn I mediante electroforesis en gel de agarosa.
3. mutantes de pantalla.
   1. Transformar 2 l de producto de PCR en E. coli DH5a células competentes por choque térmico de 45 segundos a 42 ° C.
   2. Propagar las células transformadas en una placa LB que contiene 50 mg / ml de kanamicina y se incuba la placa a 37 ° C durante 16 horas.
   3. Aislar el ADN plasmídico de las colonias bacterianas utilizando un kit comercial de lisis alcalina de acuerdo con el protocolo del fabricante.
   4. Se trata el ADN de plásmido aislado en el Protocolo paso 8.3.3 con enzima de restricción XhoI para verificar la presencia de las mutaciones silenciosas deseado de acuerdo con el protocolo del fabricante.
   5. secuencia de laplásmido de ADN verificado por paso Protocolo 8.3.4 con el cebador promotor T7 para confirmar la corrección de las secuencias codificantes de mutantes HP-NAP según el protocolo del fabricante.

Resultados

El diagrama esquemático del procedimiento experimental de la purificación negativa de recombinante HP-NAP expresa en E. coli mediante el uso de resinas de intercambio iónico de DEAE en modo por lotes se muestra en la Figura 1. Esta técnica de purificación se basa en la unión de proteínas y / o impurezas que no sean HP-PAN a la resina de la célula huésped. A pH 8,0, casi no hay otras proteínas, excepto HP-NAP en su forma nativa se recuperan de la fracci...

Discusión

La cromatografía por lotes modo negativo con resinas de intercambio aniónico DEAE que aquí se presenta es adecuado para la purificación de HP-NAP recombinante sobreexpresada en E coli. Los valores de pH de los tampones utilizados en las etapas de lisis celular y la purificación son muy críticos para asegurar la solubilidad de HP-NAP en E. Los lisados ​​de E. coli y la separación eficiente de HP-NAP recombinante a partir de las impurezas de la célula huésped, respectivamente. Las c...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
pET42a-NAP	N/A	N/A	prepared as described in Supplementary data of Refernce 15  http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X08018317
E. coli BL21 (DE3)	Thermo Fisher Scientific Inc	C6000-03	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C600003
Kanamycin	Amresco	25389-94-0	http://www.amresco-inc.com/KANAMYCIN-SULFATE-0408.cmsx
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	MD Biomedical Inc	101-367-93-1	http://www.antibody-antibodies.com/product_det.php?id=238064&supplier=search&name =IPTG%20
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma-Aldrich	10837091001	protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/PMSFRO?lang=en&region=TW
N-alpha-tosyl-L-lysinyl-chloromethylketone (TLCK)	Sigma-Aldrich	T7254	protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7254?lang=en&region=TW
N-tosyl-L-phenylalaninyl-chloromethylketone (TPCK)	Sigma-Aldrich	T4376	protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4376?lang=en&region=TW
Protein standard (bovine serum albumin)	Sigma-Aldrich	P5619	a standard protein for Bio-Rad Protein Assay http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/p5619?lang=en&region=TW
DEAE–Sephadex  A-25 chloride form	Sigma-Aldrich	A25120	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a25120?lang=en&region=TW
Spectrum/Por dialysis tubing	Spectrum Laboratories	132720	with molecular weight cutoff of 14 kDa http://www.spectrumlabs.com/dialysis/RCtubing.html?Pn=132720;
Acrodisc® units with Mustang® E membrane	Pall	MSTG25E3	for endotoxin removal; operated at flow rates ranging from 1 to 4 ml/min http://www.pall.com/main/laboratory/product.page?id=19992
mouse monoclonal antibody MAb 16F4	N/A	N/A	raised against the purified HP-NAP of H. pylori strain NCTC 11637 as described in Refernce 23;  A gift from Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0264410X10017585
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg	GE Healthcare Life Sciences	28989335	for gel filtration chromatography http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28989335
PlusOne silver staining kit, protein	GE Healthcare Life Sciences	17-1150-01	http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/17115001
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare Life Sciences	17-1440-02	for density gradient centrifugation to purify human neutrophils http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-tw/products/AlternativeProductStructure _16963/17144002
Flat bottom 96-well white plate	Thermo Fisher Scientific Inc	236108	http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-f96-microwell-black-white-polystyrene-plate.html
Luminol	Sigma-Aldrich	A8511	protected from light http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8511?lang=en&region=TW
Expand  long template PCR system	Sigma-Aldrich	11681834001	source of High Fidelity PCR enzyme mix http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/elongro?lang=en&region=TW
Dpn I	New England Biolabs	R0176S	https://www.neb.com/products/r0176-dpni
Xho I	New England Biolabs	R0146S	https://www.neb.com/products/r0146-xhoi
E. coli DH5α	Thermo Fisher Scientific Inc	18265-017	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017
Name	Company	Product Number	Comments
Equipment
U-2800 double beam UV/VIS spectrophotometer	Hitachi	N/A	out of market and upgraded to a new model http://hitachi-hta.com/products/life-sciences-chemical-analysis/uvvisible-spectrophotometers
EmulsiFlex-C3 high pressure homogenizer	Avestin Inc	C315320	http://www.avestin.com/English/c3page.html
Hitachi Koki himac CP80WX general ultracentrifuge	Hitachi Koki Co	90106401	for separation of the soluble and insoluble protein fractions from E. coli lysates http://centrifuges.hitachi-koki.com/products/ultra/cp_wx/cp_wx.html
ÄKTA FPLC	GE Healthcare Life Sciences	18-1900-26	for gel filtration chromatography http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/18190026
Aviv model 62ADS CD spectrophotometer	Aviv Biomedical	N/A	out of market and upgraded to a new model http://www.avivbiomedical.com/circular.php
LAS-3000 imaging system	Fujifilm	N/A	discontinued and replaced http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28955810
Wallac 1420 (Victor2) multilabel counter	Perkin-Elmer	1420-018	for chemiluminescence detection http://www.perkinelmer.com/catalog/product/id/1420-018