Tek adımlı olumsuz Kromatografik arıtma<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Nötrofil-aktive protein aşın<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Toplu Modunda

Özet

Rekombinant Helicobacter tek-aşamalı negatif saflaştırılması için yüksek verimli bir yöntem tarif edilmektedir küme modunda dietilaminoetil reçineleri kullanılarak Escherichia coli içinde aşırı eksprese nötrofil aktive edici protein (HP-NAP) pylori. Bu yöntem ile arıtılmış, HP-NAP H. aşı, ilaç veya teşhis maddelerinin geliştirilmesi için faydalıdır pylori hastalıkları -associated.

Özet

Helikobakter pilori nötrofil aktive edici protein (HP-NAP) Helicobacter pylori (H. pylori) önemli bir virülans faktörü olduğu. Bu H. kritik bir rol oynar pylori nötrofiller, monositler ve mast hücreleri dahil olmak üzere birçok doğuştan lökositlerin aktive ederek mide iltihabı indüklenen. HP-NAP bağışıklık ve bağışıklık düzenleyici özellikleri onu H. için potansiyel bir tanı ve aşı adayı yapmak pylori ve kanser tedavisi için yeni bir ilaç adayı. klinik uygulamalarda kullanılan arıtılmış, HP-NAP önemli miktarlarda elde etmek için, etkili bir yöntem, yüksek verim ve saflıkta bu proteinin oluşturulmasına ihtiyaç saflaştırmak için.

Bu protokol, dietilaminoetil (DEAE), iyon değiştirme reçineleri kullanılarak, Escherichia coli (E. Coli) 'de rekombinant aşırı eksprese HP UEP tek adımlı negatif kromatografik arıtma için bir yöntem tanımlanmıştır (örn., Sephadex i)n toplu modunda. Rekombinant HP-NAP E. toplam proteinin yaklaşık% 70 oluşturmaktadır E. coli ve hemen hemen tam olarak pH 9.0 hücre lizizi sonrasında çözünebilir fraksiyondan elde edilir. PH 8.0'da iyi şartlar altında, HP-NAP çoğunluğu bağlanmamış fraksiyon geri kazanılır ise E. endojen proteinler E. coli etkin reçinesi ile giderilirler.

DEAE iyon değişim reçineleri ile negatif mod toplu kromatografisi kullanılarak bu saflaştırma yöntemi E fonksiyonel HP NAP verir yüksek verim ve saflıkta doğal biçiminde coli. Saflaştınldı HP NAP daha önleme, tedavi için kullanılan ve H. prognozu edilebilir pylori hastalıkları yanı sıra kanser tedavisi -associated.

Giriş

Helikobakter pilori (H. pilori) gastrit ve peptik ülser bir ana sebebidir. Bu bakteri, aynı zamanda Kanser, Dünya Sağlık Örgütü adına Araştırmaları Uluslararası Ajansı tarafından insanlarda karsinojen olarak sınıflandırılmıştır, 1994 yılında tahmin edildiğini H. prevalansı pylori enfeksiyonu gelişmekte olan ülkelerde% 70 ve sanayileşmiş ülkelerde ¹ 30-40% 'dir. Olsa H. enfeksiyon oranı pylori, sanayileşmiş ülkelerde H. enfeksiyon oranını azaltmak olduğunu Gelişmekte olan ülkelerde pylori halen ² yüksektir. Standart tedavi H. ortadan kaldırmak için pylori enfeksiyonu, bir proton pompası inhibitörü, PPI ve iki antibiyotik, klaritromisin artı amoksisilin veya metronidazol ³ uygulanmasından oluşur. H. antibiyotik direnci Ancak, yükselişi pylori ülser tedavisi o önlemek için yeni stratejilerin geliştirilmesini çağrısı lır enfeksiyonu tedavi. H. karşı önleyici ve / veya terapötik bir aşı geliştirilmesi H. pylori kontrol etmek için alternatif bir yaklaşım sağlayabilir pylori enfeksiyonunun.

Helikobakter pilori nötrofil aktive edici protein (HP-NAP), H. pylori önemli bir virülans faktörü, birinci bir H. su ekstreleri tespit edilmiştir endotel hücrelerine ve reaktif oksijen türlerini (ROS) ⁴ üretmek için uygun nötrofillerin aktive etme kabiliyetine sahip pylori. H. bulunan mide mukozasının nötrofil infiltrasyonu pylori- aktif gastrit ile enfekte olan hastalarda mide enflamasyon ve doku hasarına yol açabilir. Bu nedenle, HP-NAP fazla ülser veya H. neden gastrik enflamasyon, indükleme nötrofillerin aktive ederek patolojik bir rol oynayabilir pylori mide hastalıkları -associated. Bununla birlikte, HP-NAP klinik uygulamalara ^5,6 için potansiyel bir adaydır. Nedeniyle bağışıklık ve bağışıklık düzenleyici proHP UEP perties, bu proteinin aşılar, terapötik ajanlar ve diyagnostik araçlar geliştirmek için kullanılabilir. Bir klinik çalışma H. karşı bir protein aşı bileşenleri olarak yeniden birleştirici HP NAP kullanılarak gerçekleştirilmiştir pylori. Bu aşının, alüminyum hidroksit ile birlikte formüle rekombinant HP NAP, sitotoksin ilişkili gen A (CagA) ve vakuolasyon sitotoksin A (VacA) proteinlerden oluşur ve daha fazla güvenli ve insanlarda ⁷ imünojenik olduğu gösterilmiştir. Ayrıca HP NAP-kanser terapisi ⁸ immün yanıtları -polarized aşağı alerjik reaksiyonlar ve parazit enfeksiyonları ^9,10 ile ortaya çıkarılan Th2 immün yanıtları düzenleyen (Th1) T yardımcı tip 1 tetiklemek için güçlü bir bağışıklık düzenleyici olarak işlev görür. Diagnostik olarak, yeniden birleştirici HP NAP-tabanlı ELISA H. HP-NAP karşı serum antikorları tespit etmek için uygulanmıştır pylori hasta ¹¹ ile enfekte. Bir çalışma göstermiştir ki H. serumunda HP NAP-özgü antikorların seviyesi pylori mide kanserli hastaların kronik gastrit ¹² olan hastalardan alınan göre anlamlı derecede yüksek olduğu ile enfekte. Bir başka çalışma, HP-NAP karşı serum antikorları olmayan kardiya gastrik adenokarsinoma ¹³ varlığı ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, yeniden birleştirici HP NAP-tabanlı ELISA H. mide kanseri prognoz için HP-NAP karşı serum antikorları tespit etmek için tatbik edilebilir pylori hastaları ile enfekte. Birlikte ele alındığında, arıtılmış, HP-NAP daha önleme, tedavi için kullanılan ve H. prognozu edilebilir pylori hastalıkları yanı sıra kanser tedavisi -associated.

Rekombinant HP NAP saflaştırılması için kullanılan çeşitli yöntemler arasında doğal biçiminde Escherichia coli (E. Coli) 'de ifade edilen ikinci bir saflaştırma aşaması ile ilgili jel filtrasyon kromatografisi yüksek ölçüde saf, HP-NAP ^14-16 elde etmek için gerekli olan şu ana kadar rapor . Burada, negatif mod toplu kromatografisi kullanılarak bir yöntemdietilaminoetil (DEAE) iyon-değiştirme reçineleri E. aşırı eksprese HP NAP saflaştırılması için açıklanan yüksek verim ve yüksek saflıkta coli. Bu saflaştırma tekniği konakçı hücre proteinleri ve / veya reçine HP-NAP dışındaki yabancı maddeler bağlanmasının dayanıyordu. pH 8.0, HP-NAP dışında neredeyse başka hiçbir proteinler bağlanmamış fraksiyonu geri kazanılır. negatif modda DEAE iyon değişimi kromatografisi kullanılarak bu saflaştırma yaklaşımı basit ve zaman bağlı olmayan fraksiyon toplama yoluyla tek adımlı kromatografisi ile yeniden birleştirici HP NAP saflaştırılmasını sağlayarak kazandıran. ^17, immünoglobülin G (IgG) ¹⁸ hemoglobin ^19, protein fosfataz ²⁰ ve hastalık oluşturma faktörü flagellin ²¹ virüsleri gibi, aynı zamanda negatif iyon değişim kromatografisi ile saflaştırılabilir bildirilmiştir HP-NAP, birçok biyomoleküllerin ek olarak, modu. yabancı maddeler küçük ise negatif mod iyon değişimli kromatografi için tercih edilirtabi numunede mevcut olan bileşenlerin ²² arıtılacak. Doğal ya da yeniden birleştirici biyomoleküllerin saflaştırma negatif kromatografi uygulanması en son ²³ gözden geçirilmiştir.

Bu rapor E. rekombinant HP NAP ifadesi için adım protokolü tarafından bir adım sağlar E. coli, DEAE iyon değişim reçineleri ile negatif mod toplu kromatografisi kullanılarak HP-UEP hücrelerin parçalanması ve saflaştırılması. arıtma için arzu edilen bir protein negatif modda iyon değiştirme kromatografisi için uygun ise, açıklanan protokol, aynı zamanda bir saflaştırma işleminin geliştirilmesi için bir başlangıç ​​noktası olarak adapte edilebilir.

Protokol

İnsan kanı Ulusal Tsing Hua Üniversitesi Kurumsal Değerlendirme Kurulu, Hsinchu, Tayvan önceden yazılı aydınlatılmış onam ve onayı ile sağlıklı gönüllülerden alındı.

E. Rekombinant HP NAP 1. İfade E. coli

1. H. HP NAP-DNA dizisini içeren plazmid pET42a NAP-hazırlama pylori 26695 suşu olarak daha önce ¹⁶ nitelendirdi. tarif edildiği gibi arzu edilen nokta mutasyonu olan HP NAP DNA dizisini ihtiva eden plasmidler hazırlama (Protokolü, adım 8).
2. E. yukarıdaki DNA plazmid, 10 ng Dönüşümü E. coli BL21 (DE3) 42 ° C'de 45 saniye için ısı şok kompetan hücreler, çizgi 50 ug / ml kanamisin ve 16 saat 37 ° C'de plakalar inkübe ihtiva eden agar plakaları lizojeni bulamacında hücreleri (LB).
3. 50 ug / ml kanamisin ile LB suyu 5 ml ihtiva eden tek tek tüpler içinde tek koloniler inoküle ve 3 ön kültür olarak büyür170 rpm'de çalkalanarak 16 saat, 7 ° C.
4. 1 L'lik bir şişede 50 ug / ml kanamisin içeren LB suyu 200 ml, yukarıda ön-kültür hücreleri 2 ml ile inoküle. Yaklaşık bir UV / VIS spektrofotometre ile tespit 0.4-0.5 ulaşır 600 nm'de absorbans ve 170 rpm'de çalkalanarak, 2 saat boyunca 37 ° C'de aşılandı kültür şişesi inkübe edin.
5. HP NAP ekspresyonunu indüklemek için 0.4 mM nihai bir konsantrasyona kadar yukarıdaki kültüre 1 M izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) 80 ul ekle. Yaklaşık 1.6-1.7 ulaştığı 600 nm'de absorbans kadar 3 saat boyunca kültür inkübe.
6. Santrifüj 15 dakika boyunca 4 ° C'de 6,000 x g'de hücre süpernatan. saflaştırılmadan kadar -70 ° C 'de hücre pelletini saklayın.

HP NAP içeren çözünür protein fraksiyonu 2. Hazırlık

Not: Aşağıdaki adımların hepsi 4 ° C sıcaklıkta gerçekleştirilmektedir.

1. Hücre p yeniden süspanse 50 miProtokol adım 1.6 hazırlanan ellet 20 20 mM Tris-HCl, pH 9.0, 50 mM NaCI ihtiva eden 0.13 mM fenilmetilsülfonil florid (PMSF), 0.03 mM N-alfa-tosil-L-lizinil-klorometilketon (TLCK) ve 0.03 mi 4 ° C'de mM N-tosil-L-fenilalanin-klorometilketon (TPCK) daha önce olduğu gibi ¹⁶ tarif.
2. 4 ° C 'de 7 kez 15,000 psi ile 20,000 arasında bir dizi çalışan yüksek basınçlı homojenleştirici ile bakteriyel bir süspansiyon geçirilmesiyle bakteri hücreleri bozabilir.
3. Santrifüj 1 saat boyunca 4 ° C'de 30.000 x g'da hücre lisatı, bir ultra santrifüj ile çözünen ve çözünmeyen protein fraksiyonları ayırmak için. Bir behere çözünür protein fraksiyonu olarak supernatant aktarın.
4. üreticinin talimatlarına göre standart olarak sığır serum albümini (BSA) ile ticari bir kit kullanılarak Bradford metodu ile çözünür protein fraksiyonu Protein konsantrasyonu ölçümü.
5. th 20 ml 1 N HCI 177.6 ul eklepH 8.0, pH 9.0 olan pH değerini ayarlamak için Protokol adım 2.3 elde edilen E çözünür protein fraksiyonu.
6. Nihai protein konsantrasyonu 0.5 mg / ml olması için yukarıda protein çözeltisine, 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM NaCI ekleyin.

E. itibaren Rekombinant HP NAP 3. saflaştırılması DEAE iyon-değişim reçineleri ile Negatif Mod Toplu Kromatografisi coli

1. DEAE reçine 15 ml hazırlayın.
   1. DEAE reçine üzerinden 0,6 gr kuru toz tartılır ve en az 1 gün süre ile oda sıcaklığında, 20 mM Tris-HCI, pH 8.0, 50 mM NaCI, 30 ml içinde askıya.
   2. 10.000 x reçine santrifüj 1 dakika boyunca 4 ° C 'de örn.
   3. Süpernatantı çıkarın ve atın.
   4. 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM NaCI, 15 mL ekleyin.
   5. Protokol 3.1.2 dört 3.1.4 kez daha adımları tekrarlayın.
   6. 15 mi daha sonraki kullanım için 4 ° C'de reçinesi (30 ml Tris tamponu içinde% 50 bulamaç) yerleşmiş saklayın.
      Not: Bir sonraki adımda tüms, 4 ° C'de gerçekleştirilmektedir.
2. reçine 15 ml protokolün adım 2.6 hazırlanan çözünür proteinlerin 45 ml ilave edilir ve 1 saat boyunca 4 ° C 'de manyetik bir karıştırıcı ile, protein / reçine cıvık çamuru ilave edin.
3. Bir durdurma musluğu takılmış plastik ya da cam sütuna protein / reçine cıvık çamuru dökün. Reçine yerçekimi altında yerleşmek için izin verin.
4. sütununda sıvı seviyesi sadece reçine üzerine kadar protein çözeltisi yerçekimi akışı ile sütun aracılığıyla çalışmasına izin vermek için musluğunu açın. akış yoluyla saflaştırılmış HP NAP içeren ilişkisiz fraksiyon olarak toplayın.
5. sütuna buz soğukluğunda 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM NaCI, 15 mL ekleyin.
6. sütununda sıvı seviyesi sadece reçine üzerine kadar yıkama tamponu yerçekimi akışı ile sütun aracılığıyla çalışmasına izin vermek için musluğunu açın. akış yoluyla yıkama fraksiyonu olarak toplayın.
7. Protokol ek yıkama kesirler toplamak için 3,5 dört 3,6 kez daha adımları tekrarlayın.
8. bir kolona buzla soğutulmuş 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 M NaCI, 15 mL ekleyin.
9. sütununda sıvı seviyesi sadece reçine üzerine kadar elüsyon tamponu yerçekimi akışı ile sütun aracılığıyla çalışmasına izin vermek için musluğunu açın. akış yoluyla elüsyon fraksiyonu olarak toplayın.
10. Protokol ek elüsyon kesirler toplamak için 3,8 dört 3,9 kez daha adımları tekrarlayın.

4. Tampon Değişim ve DEAE Reçinelerle Negatif Mod Toplu Kromatografi ile saflaştırılmaktadır HP-NAP Endotoksin Kaldırma

Not: Saflaştırılmış HP NAP-E'de ifade E. coli değişimi ve nötrofilleri stimüle önce endotoksin kaldırma tampon maruz bırakılması gerekmektedir.

1. Daha önce tarif edildiği gibi ²⁴ 14 kDa molekül ağırlığı kesme diyaliz tüpleri kullanılarak, 4 ° C de, Dulbecco fosfat tamponlu tuz (D-PBS), pB 7.2, saflaştırılmış HP UEP tampon değiştirme diyaliz gerçekleştirin.
2. Bir Syring yoluyla diyaliz HP-NAP Filtreendotoksini çıkarmak için 4 ° C sıcaklıkta 2.5 ila 4 ml / dakika arasında değişen akış hızında, 20 ml'lik atılabilir bir şırınga bağlı pozitif yüklü, hidrofilik membrandan e filtresi.

Sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE), Western blotting, yerel-PAGE, jel filtrasyon kromatografisi ve Dairesel Dikroizm Spektroskopisi ile arıtılmış rekombinan HP UEP moleküler özellikler 5. karakterizasyonu

1. Fare monoklonal antikoru Mab 16F4 ²⁵ ihtiva eden hibridom kültür süpernatanları ile SDS-PAGE ve Western blotting ile saflaştırılmış rekombinant HP NAP analiz, daha önce ²⁴ tarif.
2. Daha önce ²⁶ tarif edildiği gibi oligomerik durumunu incelemek için ana-PAGE ve jel filtrasyon kromatografisi ile arıtılmış, HP-NAP analiz edin.
3. Daha önce ²⁶ açıklandığı gibi ikincil yapısını incelemek için dairesel dikroizm spektroskopi ile saflaştırılmış rekombinant HP-NAP analiz edin.

Bir SDS-PAGE jeli gümüş rengine boyanması HP-UEP Saflık 6. Değerlendirme

1. Bir gümüş boyama kiti üreticinin talimatlarına göre çözüm, gümüş çözüm, çözüm geliştirme hassaslaştırıcı, sabitleme çözeltisi hazırlayın çözüm durdurmak ve yıkama solüsyonu.
2. Bir gümüş boyama kiti üreticinin talimatlarına göre bir SDS-PAGE jel gümüş lekeleme gerçekleştirin.
3. Bir görüntüleme sistemiyle jel görüntü elde.

HP-NAP Bağlı Nötrofiller itibaren ROS üretimi 7. ölçümü

1. Daha önce tarif edildiği gibi ²⁴ yoğunluk gradyan santrifüjü takiben dekstran çökeltmesi ile insan heparinize kandan İnsan nötrofilleri izole edin.
2. nötrofillerden ROS üretiminin ölçümü luminol bağımlı kemikuminensans kullanarak HP-NAP ile uyarılır.
   1. Bir plaka okuyucusu üzerinde açma ve 37 ° C'de sıcaklık ayarlanır. bir yerleştirinBu, 37 ° C ye ısınmasına izin plaka okuyucu bölmesi içi boş, düz tabanlı 96 oyuklu beyaz levha,.
   2. Varlığında veya yokluğunda 0,9 mM _CaCl2, 0.5 mM _MgCl2, ve 13.3 uM 5-amino-2,3-dihidro-1,4-phthalazinedione (luminol) ihtiva eden, D-PBS, pH 7.2 içinde teşvik karışımlarını hazırlamak Protokol adım 4.2 hazırlanan 0.67 uM endotoksin kaldırıldı HP-NAP.
   3. 5 mM glukoz ihtiva eden D-PBS, pH 7.2 içinde 7.1 ⁶ 10 ila 2 x hücre / mi, Protokol aşamasından hazırlanan insan nötrofil konsantrasyonu ayarlayın.
   4. 96 oyuklu ise plakanın her oyuğuna nötrofil süspansiyon 50 ul ekle.
   5. oyuk başına 5 saniyelik bir zaman aralığı de ihtiva eden nötrofiller Protokol aşama 7.2.2 hazırlanabilir teşvik karışımlarından 150 ul ekle.
   6. Bir plaka okuyucusu kullanılarak, üç saatlik bir süre boyunca göz başına 5 saniye için kemilüminesans emisyonunu ölçün.

8.Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) ile DNA Plazmidler Barınma HP-NAP Mutantlarının Şantiye doğrudan Mutagenezler tabanlı

Not: "sessiz" restriksiyon bölgeleri bölge-yönlendirmeli mütajenez (SDM) -assist yazılımı ²⁸ ile bir mutagenez primeri tanıtıldı hariç, daha önce tarif edildiği gibi ^27, PCR tabanlı bir site doğrudan mutajenez temel oluşturulmuştur.

1. PCR reaksiyonu gerçekleştirmek.
   1. Nihai verir plazmid pET42a NAP-10 ng, Tablo 1 'de listelenen mutagenez primer çiftleri 1 uM, deoksinükleosid trifosfat (dNTP) ve iyonu giderilmiş su ihtiva eden bir PCR tüpüne yüksek güvenilirlikli PCR enzim karışımı 3 adet 200 uM ekleme 25 ul hacmi.
   2. 95 PCR döngüleri başlatın 10 dakika boyunca ° C şablon DNA'yı denatüre ve 1 dakika süre ile 95 ° C de 12 amplifikasyon döngüsü ile takip etmek, T 1 dakika süre ile -5 ° C _{Resim m,} 6 dakika boyunca 72 ^o C.
   3. PCR döngüleri bitirmek1 dakika için _{Tm s} -5 ^O ° C'de bir tavlama aşaması, ve 30 dakika süreyle 72 ° C'de bir uzatma aşamasından oluşuyordu.
2. 2 saat boyunca 37 ° C'de Dpn I sınırlama enzimi 0.4 ul PCR ürünü 15 ul tedavi ve daha sonra agaroz jel elektroforezi ile Dpn I ile tedavi edilen PCR ürünü 2 ul analiz eder.
3. Ekran mutantları.
   1. E. içine PCR ürünü 2 ul Transform 42 ° C'de 45 saniye boyunca ısı şoku ile coli DH5α kompetan hücreler.
   2. 50 ug / ml kanamisin içeren bir LB plakası üzerinde dönüştürülmüş hücrelerinin yayılmasını ve 16 saat boyunca 37 ° C'de inkübe plakası.
   3. imalatçının protokolüne göre, ticari bir alkalin liziz kiti kullanılarak bakteriyel kolonilerden plazmid DNA izole edin.
   4. üreticinin protokolüne göre istenen sessiz mutasyonların varlığını doğrulamak için XhoI kısıtlama enzimi ile protokolün adım 8.3.3 izole plazmid DNA tedavi edin.
   5. diziPlazmid DNA, üretici protokolüne göre HP NAP-mutantlarının kodlama dizilerinin düzeltme teyit etmek için T7 promoter primeri ile protokolün adım 8.3.4 tarafından doğrulanan.

Sonuçlar

Rekombinant HP-NAP negatif arınma deneysel işlemin şematik E. ifade Toplu modunda DEAE iyon değişim reçineleri kullanılarak E. coli, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Bu saflaştırma tekniği konakçı hücre proteinleri ve / veya reçine HP-NAP dışındaki yabancı maddeler bağlanmasının dayanmaktadır. PH 8.0 'de, kendi doğal formunda HP NAP dışında hemen hemen hiçbir proteinler, bağlanmamış fraksiyon (Şekil ...

Tartışmalar

Burada sunulan DEAE anyon-değişim reçineleri ile negatif mod toplu kromatografisi E coli içinde aşırı eksprese rekombinant HP NAP saflaştırılması için uygundur. Hücre lizizi ve saflaştırma aşamasında kullanılan tamponların pH değerleri E. HP-NAP çözünürlüğünü sağlamak için çok önemlidir E. coli lizatları ve sırasıyla konak hücre yabancı maddelerden rekombinant HP NAP verimli ayrılması. Bakteri hücreleri, pH 9.0 lize olmalıdır ve negatif saflaştırma y...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
pET42a-NAP	N/A	N/A	prepared as described in Supplementary data of Refernce 15  http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X08018317
E. coli BL21 (DE3)	Thermo Fisher Scientific Inc	C6000-03	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C600003
Kanamycin	Amresco	25389-94-0	http://www.amresco-inc.com/KANAMYCIN-SULFATE-0408.cmsx
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	MD Biomedical Inc	101-367-93-1	http://www.antibody-antibodies.com/product_det.php?id=238064&supplier=search&name =IPTG%20
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma-Aldrich	10837091001	protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/PMSFRO?lang=en&region=TW
N-alpha-tosyl-L-lysinyl-chloromethylketone (TLCK)	Sigma-Aldrich	T7254	protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7254?lang=en&region=TW
N-tosyl-L-phenylalaninyl-chloromethylketone (TPCK)	Sigma-Aldrich	T4376	protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4376?lang=en&region=TW
Protein standard (bovine serum albumin)	Sigma-Aldrich	P5619	a standard protein for Bio-Rad Protein Assay http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/p5619?lang=en&region=TW
DEAE–Sephadex  A-25 chloride form	Sigma-Aldrich	A25120	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a25120?lang=en&region=TW
Spectrum/Por dialysis tubing	Spectrum Laboratories	132720	with molecular weight cutoff of 14 kDa http://www.spectrumlabs.com/dialysis/RCtubing.html?Pn=132720;
Acrodisc® units with Mustang® E membrane	Pall	MSTG25E3	for endotoxin removal; operated at flow rates ranging from 1 to 4 ml/min http://www.pall.com/main/laboratory/product.page?id=19992
mouse monoclonal antibody MAb 16F4	N/A	N/A	raised against the purified HP-NAP of H. pylori strain NCTC 11637 as described in Refernce 23;  A gift from Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0264410X10017585
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg	GE Healthcare Life Sciences	28989335	for gel filtration chromatography http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28989335
PlusOne silver staining kit, protein	GE Healthcare Life Sciences	17-1150-01	http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/17115001
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare Life Sciences	17-1440-02	for density gradient centrifugation to purify human neutrophils http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-tw/products/AlternativeProductStructure _16963/17144002
Flat bottom 96-well white plate	Thermo Fisher Scientific Inc	236108	http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-f96-microwell-black-white-polystyrene-plate.html
Luminol	Sigma-Aldrich	A8511	protected from light http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8511?lang=en&region=TW
Expand  long template PCR system	Sigma-Aldrich	11681834001	source of High Fidelity PCR enzyme mix http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/elongro?lang=en&region=TW
Dpn I	New England Biolabs	R0176S	https://www.neb.com/products/r0176-dpni
Xho I	New England Biolabs	R0146S	https://www.neb.com/products/r0146-xhoi
E. coli DH5α	Thermo Fisher Scientific Inc	18265-017	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017
Name	Company	Product Number	Comments
Equipment
U-2800 double beam UV/VIS spectrophotometer	Hitachi	N/A	out of market and upgraded to a new model http://hitachi-hta.com/products/life-sciences-chemical-analysis/uvvisible-spectrophotometers
EmulsiFlex-C3 high pressure homogenizer	Avestin Inc	C315320	http://www.avestin.com/English/c3page.html
Hitachi Koki himac CP80WX general ultracentrifuge	Hitachi Koki Co	90106401	for separation of the soluble and insoluble protein fractions from E. coli lysates http://centrifuges.hitachi-koki.com/products/ultra/cp_wx/cp_wx.html
ÄKTA FPLC	GE Healthcare Life Sciences	18-1900-26	for gel filtration chromatography http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/18190026
Aviv model 62ADS CD spectrophotometer	Aviv Biomedical	N/A	out of market and upgraded to a new model http://www.avivbiomedical.com/circular.php
LAS-3000 imaging system	Fujifilm	N/A	discontinued and replaced http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28955810
Wallac 1420 (Victor2) multilabel counter	Perkin-Elmer	1420-018	for chemiluminescence detection http://www.perkinelmer.com/catalog/product/id/1420-018