Tubo de Ensayo de la célula endotelial Formación estratégica: Comparación de la matriz extracelular y el factor de crecimiento reducido de la matriz extracelular

Resumen

This manuscript describes a tube formation assay to quantify the effects of a given compound or condition on angiogenesis by using endothelial cell tube formation in a controlled environment.

Resumen

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by hijacking the process of angiogenesis, in which new blood vessels are formed from existing blood vessels. The CXCR2 (chemokine (C-X-C motif) receptor 2) receptor is a transmembrane G-protein-linked molecule found in many cells that is closely associated with angiogenesis¹. Specific blockade of the CXCR2 receptor inhibits angiogenesis, as measured by several assays such as the endothelial tube formation assay. The tube formation assay is useful for studying angiogenesis because it is an excellent method of studying the effects that any given compound or environmental condition may have on angiogenesis. It is a simple and quick in vitro assay that generates quantifiable data and requires relatively few components. Unlike in vivo assays, it does not require animals and can be carried out in less than two days. This protocol describes a variation of the extracellular matrix supporting endothelial tube formation assay, which tests the CXCR2 receptor.

Introducción

Con el fin de obtener los nutrientes necesarios para la supervivencia, los tumores malignos requieren acceso a la corriente sanguínea del paciente. Para conseguir que el acceso, las células tumorales liberan señales químicas que estimulan el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos en el tumor, secuestrando así el proceso fisiológico normal conocido como angiogénesis ^2. Es también a través de los vasos sanguíneos creados a través de la angiogénesis que la metástasis (es decir, la propagación del cáncer a otros órganos) puede ocurrir. Debido a que el proceso de angiogénesis es tan vital para la progresión de una amplia variedad de cánceres, es un objetivo atractivo en la investigación de la terapia anticáncer ^3.

Un método usado para cuantificar la angiogénesis es medir la capacidad de la célula progenitora endotelial para formar tubos cuando se colocan en una matriz extracelular. Debido a que la formación de estos tubos es un paso temprano crítico en la angiogénesis, las pruebas de las condiciones ambientales (por ejemplo, la presencia o ausencia de un co dadoformación mpound) que puede estimular o inhibir tubo da una idea de los pasos específicos que pueden ser objetivo de inhibir la angiogénesis. El ensayo de formación de tubo celular endotelial es uno de los ⁴ métodos más utilizados in vitro que mide la capacidad de las células para formar tubos. Es un ensayo simple, que requiere relativamente pocos componentes y un periodo de cultivo corto ^5. Tal vez lo más importante, sin embargo, es que los datos obtenidos de este tipo de ensayo es cuantificable.

Un ejemplo para el uso del ensayo de formación de tubos consiste en comparar el desarrollo de tubos de células endoteliales vasculares cultivadas en matriz extracelular vs. factor de crecimiento reducido (FG) de la matriz extracelular. La matriz extracelular es un material de tipo membrana basal aislado a partir de células de sarcoma y sus principales componentes son laminina, colágeno de tipo IV, factores de crecimiento y los proteoglicanos. Algunos compuestos tienen diferentes efectos sobre la capacidad de la célula para formar tubos cuando enun entorno con una reducción de los factores de crecimiento y la reducción de proteoglicanos de sulfato de heparán (HSPGs). HSPGs son un componente de la matriz extracelular que se reduce de manera significativa en la TFG matriz extracelular. Como un ejemplo, si la hipótesis es que los inhibidores de la angiogénesis, tales como SB225002, que bloquea el receptor de CXCR2, tiene capacidad considerablemente más débil para interrumpir la formación del tubo cuando HSPGs son abundantes, a continuación, una comparación entre la actividad de la formación del tubo en la matriz extracelular y la matriz extracelular de GFR es importante en la exploración de la posibilidad de inhibición de la angiogénesis a través del control de los HSPG.

Otros ensayos que se utilizan comúnmente para determinar los efectos de los compuestos sobre la angiogénesis están en métodos in vivo. Ejemplos notables de esto son la membrana corioalantoidea de pollo (CAM) de ensayo ⁶ usando huevos de gallina, y el enchufe in vivo Matrigel ensayo de angiogénesis ⁷ usando ratones. Mientras que los métodos in vivo miden la angiogénesis en tres y las dimensiones son más representativos del cuerpo humano en comparación con el ensayo de formación in vitro del tubo, sufren el defecto de requerir mucho más tiempo y son mucho más difíciles de realizar. Tanto el ensayo de CAM y el ensayo enchufe extracelular toman al menos una semana ⁸ que hacer, mientras que en comparación, el ensayo de formación de tubos se puede realizar en un solo día y que no requiere el uso de animales.

Es importante tener en cuenta que las células endoteliales se utilizan en este informe son células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC). Estas células juegan un papel clave en brote vascular y el crecimiento de los vasos sanguíneos, y son suficientemente análoga a las células endoteliales en los cánceres que se utilizará para evaluar la actividad anti-angiogénesis tanto in vitro e in vivo ^9. Otras células, tales como células endoteliales microvasculares primarias también se pueden usar.

También es importante tener en cuenta que además de tener menorniveles de HSPG, la matriz extracelular de GFR también ha reducido los niveles de muchos de los componentes cuando se compara con la matriz extracelular normal. Esto incluye, pero no se limita a: EGF, IGF-1, PDGF, y TGF-beta. Aquellos que realizan experimentos que estudian el significado de estos compuestos en relación con la angiogénesis pueden estar interesados ​​en el uso de la TFG matriz extracelular.

Protocolo

1. Cultura de la célula

1. 3x10 Seed ⁵ células HUVEC en 10 ml de medio de crecimiento completo ¹⁰ en un matraz de 75 cm.
2. Se incuban las células a 37 ° C en 5% de CO ₂ al 70 a 80% de confluencia.

2. Ensayo de Formación túbulo

1. Descongelar ya sea la matriz extracelular del factor de reducción (TFG) el crecimiento o la matriz extracelular normal, durante la noche en hielo a 4 ° C.
   Nota: En aras de la brevedad "matriz extracelular" de ahora en adelante se utilizará para hacer referencia tanto TFG y la matriz extracelular normal. El proceso para prepararlos es idéntico.
2. Mantenga placas de cultivo de 96 pocillos en el hielo, y añadir 50 l de matriz extracelular refrigerado por pocillo utilizando puntas de pre-enfriado. Preparar triplicado de 5 pocillos que contienen solamente la matriz extracelular normal. Se prepara otro triplicado de 5 pozos que contienen sólo TFG matriz extracelular.
3. Incubar la placa de 96 pocillos a 37 ° C durante 30 min.
4. Lavar el HUVECsuna vez con solución tamponada con fosfato sin calcio y magnesio (PBS), y añadir 1 ml 0,05% de tripsina-EDTA. Incubar la placa a 37 ° C durante 1-5 minutos, comprobando las células cada minuto hasta que la mayoría de las células completan. Desprender las células punteando en el matraz de una vez.
   1. Añadir 5 ml de medio basal (es decir, medio de crecimiento de células endoteliales sin nada (por ejemplo, suplementos añadidos)) con 1% de suero bovino fetal (FBS). Recoger las células en el matraz mediante pipeteo y transferir a un tubo de 15 ml. Centrifugar las células a 200 xg durante 5 min y descartar el sobrenadante.
   2. Vuelva a suspender con 2 ml de medio basal, contar las células usando un hemocitómetro, y ajustar la concentración celular a 2-3 x 10 ⁵ células / ml.
5. Preparar 100 l de 10x las concentraciones siguientes de inhibidor de CXCR2 SB225002 en medio basal: 11 M, 5,6 M, 1,1 M, 0,56 M y 0 M (control).
6. Pipetear 300 l de la suspensión de HUVEC en cada 5 microcentrifuge tubos. Añadir 33 l de las concentraciones de inhibidor (11 M, 5,6 M, 1,1 M, 0,56 M y 0 M) en un tubo conteniendo cada uno la HUVECs, y vórtice.
7. Pipetear 50 l de cada una de las suspensiones de células (1-1,5 x 10 ⁴ células) a pocillos individuales de la matriz extracelular. Placa de cada suspensión por triplicado y se incuba durante 4-16 horas a 37 ° C, 5% de CO _2.
8. Después de 4-16 horas, tomar 4 fotos de los tubos formados por pocillo usando una cámara microscopio invertido ¹¹ (aumento original x 100).

Ensayo 3. La interrupción túbulo

1. Preparar la matriz extracelular y las placas de acuerdo con las mismas especificaciones que la formación de tubos de ensayo (pasos 2.1 a 2.3).
2. Preparar suspensión HUVEC como se describe en los pasos 2.4- 2.4.2 de la formación de tubos de ensayo y alícuota en una placa de 96 pocillos que contiene la matriz extracelular en 50 l por pocillo.
   NOTA: La placa suficientes pozos so que hay 3 pozos por tratamiento de drogas.
3. Se cultivan las células en la matriz extracelular durante 4 horas a 37 ° C, 5% de CO _2. Tomar imágenes antes de la iniciación del tratamiento con fármacos.
4. Preparar las concentraciones de 2x de la SB225002 inhibidor de CXCR2 como se describe en el paso 2.5 del tubo de ensayo de formación, y añadir 50 l de cada concentración por pocillo de la placa de 96 pocillos que contiene la HUVECs. Placa de cada concentración por triplicado.
5. Incubar la placa para otro 2-12 horas a 37 ° C, 5% de CO _2. Tomar 4 imágenes de los tubos formados en cada pocillo usando una cámara microscopio invertido (aumento original × 100) ^11.

4. Cuantificación de datos

1. Evaluar la formación del tubo capturado en las imágenes mediante la medición de la longitud del tubo total de tubos en cuatro campos microscópicos al azar utilizando el software de la cámara microscopio.
2. Abre la imagen en el software de la cámara microscopio, y haga clic en 'Anotaciones y Medidas9 ;. En la sección "longitud", seleccione la herramienta "simple línea '. Haga clic en la imagen, a continuación, dibuje una línea a lo largo de la longitud del tubo, a continuación, haga clic derecho.
   Nota: El software calcula automáticamente la longitud de la línea en píxeles y poner los datos en un archivo.
3. Repetir el procedimiento para todas las líneas de metro en la imagen seleccionando la herramienta "simple línea '. Haga clic en la imagen, a continuación, dibuje una línea a lo largo de la longitud del tubo, a continuación, haga clic derecho.
   Nota: El software registrará la longitud de cada línea y mostrar los datos en la pantalla.
4. Después de medir cada tubo en la imagen, haga clic en "Exportar", después eligió 'Longitud de la hoja de cálculo'.
   Nota: Los datos de longitud se pueden exportar a una hoja de cálculo.
5. Añadir todas las longitudes de los tubos de la hoja de cálculo para obtener la longitud total del tubo. Calcular y registrar la duración media de los tubos.
   Nota: Se recomiendan cuatro réplicas con media y desviación estándar determinada.

5. Recuperación de células de la matriz extracelular Cultura

1. Cultura y llevar a cabo un ensayo de formación de tubo (véase la sección 2) en una escala más grande como una placa de 96 pocillos no dará suficiente número de células. Para placas de 12 pocillos, utilice 500 l de matriz extracelular y 500 l de la suspensión de células HUVEC (1.5x10 ⁵ células).
2. Se incuban las células durante 4-16 hr para formar tubos. A continuación, aspirar el medio de cultivo celular. Enjuagar las células con 1 ml de PBS frío 1x sin calcio y magnesio.
3. Añadir 1 ml de hielo frío tampón PBS-EDTA mM 2.5 en la cultura y mantener en hielo durante 10 minutos.
4. Desprender las células y mezcla de la matriz extracelular de la cápsula, utilizando una punta de pipeta de 1.000 l con la punta cortada, y luego transferir a un tubo ml frío 15, lavar el pozo con 4 ml de hielo frío EDTA PBS-2,5 mM y poner en el tubo .
5. Poner los tubos en hielo durante 1-4 horas y se invierta el tubo un par de veces hasta que todo el extracelularmatriz se disuelve.
6. Se centrifuga durante 10 minutos a 1.620 xg a 0 ° C
7. Vuelva a suspender los sedimentos celulares con PBS frío 1 ml a un tubo de 1.ml en hielo.
8. Volver a centrifugar durante 5 minutos a 3.000 xg a 0 ° C, y luego desechar el sobrenadante.
9. Almacenar las células en -80 ° C.

Resultados

formación considerable, sano endotelial tubo puede ser fácilmente contraste con la formación del tubo inhibido en las imágenes de microscopía. La formación de tubos sana aparece como una banda organizada de las estructuras similares a capilares (Figura 1). En comparación, la formación del tubo inhibido se manifiesta como células dispersas (Figura 2). Tubo de ensayo de formación de datos se cuantifica mediante la medición de la longitud del tubo total de tubos capilares (Tabla 1). Además longitud total del tubo, la longitud media del tubo, el número total de tubos, o el número total de puntos de ramificación se pueden medir. la formación del tubo estructurada produce una mayor longitud de tubo de red que inhibe el crecimiento del tubo dispersa. En la Figura 3, una curva de respuesta a la dosis permite el cálculo de IC ₅₀ en las condiciones experimentales de HUVECs en TFG matriz extracelular y un inhibidor de CXCR2 SB225002.

Figura 1. endotelial formación t Ube en la matriz extracelular y el crecimiento (FG) de la matriz extracelular reducido factor. Dos imágenes muestran la formación de tubos de éxito en la matriz extracelular (A) y la matriz extracelular de GFR (B). La red interconectada de tubos de muestra claramente que el crecimiento de los tubos es saludable en estas HUVECs. Barra de escala = 10 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Inhibición de la formación de tubos en extracelular y el factor de crecimiento reducido (FG) de la matriz extracelular por un SB225002 inhibidor de CXCR2 (5,6 M). Dos imágenes muestran tuboformación que ha sido inhibida por un inhibidor SB225002 CXCR2 (5,6 M) en la matriz extracelular (A) y la matriz extracelular de GFR (B). Los grupos aislados de células HUVEC se ven en esta imagen Demostración de que las células no fueron capaces de formar los tubos necesarios para conectar el uno al otro. Barra de escala = 10 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Dosis curva de respuesta en el crecimiento (FG) de la matriz extracelular reducido factor. El eje X muestra la longitud del tubo y el eje Y muestra la concentración de un inhibidor de CXCR2. La curva de respuesta a la dosis muestra que la respuesta HUVEC al inhibidor de CXCR2 en TFG matriz extracelular es dependiente de la dosis. El IC ₅₀ (inhibidor de media máximay concentración) se calculó mediante el uso de software ¹³ y puede ser comparado con una curva de respuesta a la dosis para la matriz extracelular, por ejemplo. IC ₅₀ es la concentración del inhibidor que disminuye la respuesta a 50%. Las barras de error representan la desviación estándar.

Factor de Crecimiento reducido (TFG) y el inhibidor de la matriz extracelular (4 repeticiones cada una)	Longitud total del tubo Promedio (píxeles) (1 píxel = 0,34 micras)	Desviación estándar	P Valor
control de la matriz extracelular TFG	2447	168.174
TFG extracelular SB225002 matriz + 0,56 M	1422.5	185.4218	0.000395
TFG extracelular SB225002 matriz + 1,1 M	1004	126.1784	2,14 x 10 -5
TFG extracelular SB225002 matriz + 5,6 M	519,25	129.6368	4.19 x 10 -6
TFG extracelular SB225002 matriz M + 11	393.75	212.6857	1,21 x 10 -5

Tabla 1. Cuantificación de longitudes de tubo totales en crecimiento (FG) de la matriz extracelular reducido factor bajo condiciones variables. Una parte de una tabla utilizando longitudes de tubo totales registrados en las muestras cultivadas en TFG matriz extracelular con concentraciones variables de inhibidor de CXCR2. Los datos indican que el inhibidor de CXCR2 no inhibe la formación de tubos. Se incluyen los valores asociados como el promedio de cuatro réplicas, desviación estándar y el valor de p. Se mide en píxeles para mostrarlos datos que se exportan. IC ₅₀ se puede calcular mediante el uso de software estadístico ^13. (1 pixel = 0,34 micras)

Discusión

Al llevar a cabo este ensayo, es esencial para mantener la matriz extracelular en hielo oa 4 ° C en todo momento a menos que se especifique lo contrario. Si se permite que la matriz extracelular para calentar por encima de 4 ° C, se polimerizará, y el ensayo se arruinado. También es importante asegurarse de que cualquier cosa que entra en contacto (por ejemplo, puntas de pipeta, la placa) con la matriz extracelular es pre-enfriado por la razón antes mencionada. El número de células sembradas en cada pocillo es crítica, muy pocas células no dan la web esperada en la muestra de control, demasiadas células se forman grandes grupos de células o una monocapa y el ensayo no serán válidos. Otro factor importante en el éxito de este ensayo es el número de pases de células de la HUVECs. El número de paso siempre debe ser inferior a diez, de otro modo la formación del tubo robusto no puede producirse. Además, uno debe asegurarse de que el medio de cultivo celular que se utiliza no ha expirado, o las células no será viable. Alternativavamente, uno puede alícuota del medio y sus componentes y almacenar a -20 ° C para conservar por un período de tiempo después de la fecha de caducidad. Por supuesto, aún es preferible utilizar el medio antes de la fecha de caducidad

Como todos los procedimientos, existen algunas desventajas a realizar el ensayo de formación de tubos de células endoteliales. Un problema importante es que, debido a que hay diferentes tipos de células endoteliales y las matrices de apoyo, los resultados del ensayo pueden variar considerablemente en función de que se utiliza el tipo de célula y la matriz. Las células endoteliales (HUVEC utilizados, HAECs o HMVECs) son células primarias, que son costosos de obtener y tienen variabilidad en comparación con las células inmortalizadas. Las células primarias tienen pasajes limitados para el uso, y por lo tanto no son adecuados para los experimentos a largo plazo de la angiogénesis ^14. Para los datos fiables, siempre se debe usar el mismo tipo para el ensayo. Como con otros ensayos in vitro, los resultados de un ensayo de formación de tubo deben ser conconfirmado in vivo, ya que los resultados de las condiciones controladas y artificiales de cultivo de tejidos de dos dimensiones no siempre se reflejan en el complejo sistema biológico de un organismo vivo. También es importante tener en cuenta que este tipo de ensayo sólo se puede utilizar para demostrar la formación de tubos de células endoteliales, y no debe ser utilizado para probar otro, no endotelial, células formadoras de tubo.

Este ensayo es un método bastante sencillo y rápido para cuantificar el potencial angiogénico de un compuesto. También forma una plataforma para experimentos adicionales, como solo, no da información sobre el mecanismo específico por el que el compuesto realmente afecta al proceso de formación de vasos. Sin embargo, el uso de matrices extracelulares variadas es un ejemplo de cómo crear, además, un marco para preguntas de investigación que no se utiliza comúnmente. Hay métodos para estudiar los mecanismos bioquímicos específicos del compuesto, incluyendo inhibidores específicos que se dirigen a componentes dela vía de la angiogénesis. Otro enfoque puede ser para extraer el ARN de las células endoteliales y el uso de RT-PCR (PCR en tiempo real) ¹² para analizar las alteraciones de la expresión de genes que pueden causar el comportamiento del crecimiento observado en el ensayo. Las futuras aplicaciones de este método incluyen HUVEC transfectadas para crear ensayos de knock-down para los pasos específicos de la ruta de la angiogénesis. Existe la posibilidad de aplicar este enfoque para estudiar la vía de la LI. Mediante la alteración de los componentes de la matriz extracelular, la interacción de la matriz y el proceso celular de apoyo angiogénesis en el cáncer se puede explicará adicionalmente. La extracción de ARN y proteínas a partir de células endoteliales bajo estas condiciones específicas proporcionan datos cuantificables adicional correspondiente a la formación de imágenes de datos.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
EGM-2 complete growth medium (EGM-2 bullet kit CC-3162 )	Fisher	NC9525043	HUVEC complete growth medium: EGM-2 base medium mixed with BBE (Bovine Brain Extract), hEGF (Human Epidermal Growth Factor), Hydrocortisone, GA-1000 (Gentamicin, Amphotericin-B), 2% FBS (Fetal Bovine Serum), VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), hFGF-β (Human Fibroblast Growth Factor Beta), R3-IGF-1 (Long R Insulin-like Growth Factor One), Ascorbic Acid, and Heparin. Aliquot the medium and its components and store them at -20 °C, warm in 37 °C before use.
MATRIGEL MATRIX 10ML Growth Factor Reduced (GFR); 10 ml; LDEV-Free	Fisher	CB-40230	Growth Factor Reduced (GFR) extracellular matrix, keep in -20 °C, warm in 4 °C before use.
MATRIGEL MATRIX 10ML; 10 ml; LDEV-Free	Fisher	CB-40234	extracellular matrix, keep in -20 °C, warm in 4 °C before use.
SB225002	Fisher	559405	CXCR2 inhibitor, keep in -20 °C, warm in room temperature before use.
Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)	ScienCell Research Laboratories	8000	culture it according reference  10.
Trypsin 0.05%-EDTA phenol red	Invitrogen	25300-054	keep in 4 °C, warm in 37 °C before use.
Nikon ECLIPSE Ti	Nikon		Inverted Research Microscope.
NIS-Elements AR 4.20.02 64 bit	Nikon		Inverted Research Microscope software
Graph-pad Prism 5	GraphPad Software, Inc.		scientific 2D graphing and statistics software, to calculate IC50.