Стратегическая эндотелиальных клеток Tube Формирование анализа: Сравнение внеклеточного матрикса и фактор роста Снижение внеклеточного матрикса

Резюме

This manuscript describes a tube formation assay to quantify the effects of a given compound or condition on angiogenesis by using endothelial cell tube formation in a controlled environment.

Аннотация

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by hijacking the process of angiogenesis, in which new blood vessels are formed from existing blood vessels. The CXCR2 (chemokine (C-X-C motif) receptor 2) receptor is a transmembrane G-protein-linked molecule found in many cells that is closely associated with angiogenesis¹. Specific blockade of the CXCR2 receptor inhibits angiogenesis, as measured by several assays such as the endothelial tube formation assay. The tube formation assay is useful for studying angiogenesis because it is an excellent method of studying the effects that any given compound or environmental condition may have on angiogenesis. It is a simple and quick in vitro assay that generates quantifiable data and requires relatively few components. Unlike in vivo assays, it does not require animals and can be carried out in less than two days. This protocol describes a variation of the extracellular matrix supporting endothelial tube formation assay, which tests the CXCR2 receptor.

Введение

Для того чтобы получить питательные вещества, необходимые для выживания, злокачественные опухоли требуют доступа к потоку крови пациента. Чтобы получить доступ , что опухолевые клетки выделяют химические сигналы , которые стимулируют рост новых кровеносных сосудов в опухоли, таким образом , угон нормальный физиологический процесс , известный как ангиогенез ^2. Кроме того , через кровеносные сосуды , созданных с помощью ангиогенеза , что метастаз (то есть, распространение рака в другие органы) может произойти. Так как процесс ангиогенеза является столь жизненно важной для прогрессированию такого широкого разнообразия видов рака, она является привлекательной мишенью в исследовании противоопухолевой терапии ^3.

Один метод, используемый для количественного определения ангиогенеза является измерение способности клеток-предшественников эндотелиальных, чтобы образуют трубки при размещении на внеклеточного матрикса. Поскольку образование этих труб является критически важным первым шагом в ангиогенеза, тестирование условий окружающей среды (например, наличие или отсутствие данного сотрудничестваформирование mpound), которые могут стимулировать или ингибировать трубка дает представление о конкретных шагах, которые могут быть направлены на ингибировать ангиогенез. Клетка трубка Анализ образования эндотелиальной является одним из наиболее широко используемых методов ⁴ в пробирке , что измеряет способность клеток к образованию трубок. Это простой тест, требующий относительно небольшого числа компонентов и период короткой культуры ^5. Возможно, самое главное, однако, заключается в том, что данные, полученные от этого вида анализа является количественной оценке.

Пример для использования анализа формирования трубки включает в себя сравнение развитие труб из сосудистых эндотелиальных клеток, выращенных на внеклеточный матрикс против фактора роста снижается (СКФ) внеклеточного матрикса. Внеклеточный матрикс представляет собой базальную мембрану, как материал, выделенный из клеток саркомы и его основными компонентами являются ламинин, тип IV коллаген, факторы роста и протеогликаны. Некоторые соединения оказывают различное влияние на способности клеток для формирования трубки, когда всреда с пониженными факторами роста и снижение гепарансульфат протеогликанов (HSPGs). HSPGs являются компонентом внеклеточного матрикса, который значительно снижается в GFR внеклеточного матрикса. В качестве примера, если гипотеза состоит в том, что ингибиторы ангиогенеза, такие как SB225002, который блокирует Рецептор CXCR2, имеют значительно более слабую способность прерывать образование трубки при HSPGs обильны, то сравнение между образованием трубки активности в внеклеточного матрикса и СКФ внеклеточного матрикса важную роль в исследовании возможности ингибирования ангиогенеза с помощью контроля HSPGs.

Другие анализы, которые обычно используются для определения влияния соединений на ангиогенез в естественных условиях методами. Яркими примерами этого являются хорионалантоисной мембраны (САМ) анализ ⁶ с использованием куриных яиц, а также в естественных условиях Матригель плагин ангиогенеза анализа ⁷ с использованием мышей. В то время как методы в естественных условиях измерения ангиогенеза в три размеры и являются более репрезентативными человеческого тела по сравнению с экстракорпорального трубкой анализа образования в России , они страдают изъяном требует значительно больше времени и значительно труднее выполнить. И САМ - анализ и анализ внеклеточной плагин принимать по крайней мере неделю ⁸ делать, в то время как в сравнении, анализ формирования трубки может быть сделано в течение одного дня и не требует использования животных.

Важно отметить, что эндотелиальные клетки, используемые в настоящем докладе, являются Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC). Эти клетки играют ключевую роль в сосудистой прорасти и рост кровеносных сосудов, и в достаточной степени аналогичны эндотелиальными клетками в раковых образований, которые будут использоваться для оценки анти-ангиогенеза активности в в пробирке и в естественных условиях экспериментов ^9. Также могут быть использованы и другие клетки, такие как первичные микрососудистых эндотелиальных клеток.

Важно также отметить, что помимо того, что ниже,уровни HSPGs, СКФ внеклеточный матрикс также пониженные уровни многих компонентов, по сравнению с нормальной внеклеточного матрикса. Это включает в себя, но не ограничиваясь ими: EGF, IGF-1, PDGF и TGF-бета. Те, осуществляющие эксперименты по изучению значимости этих соединений по отношению к ангиогенеза могут быть заинтересованы в использовании СКФ внеклеточный матрикс.

протокол

1. Культура клеток

1. Семенной 3x10 ⁵ клеток HUVEC в 10 мл полной среды для выращивания ¹⁰ в 75 см колбе.
2. Инкубируйте клетки при 37 ° С в 5% СО ₂ до 70-80% слияния.

2. Формирование трубочку Анализ

1. Разморозить либо фактор роста снижается (СКФ) внеклеточного матрикса или нормальной внеклеточного матрикса в течение ночи на льду при температуре 4 ° С.
   Примечание: Для краткости 'внеклеточного матрикса' в дальнейшем будет использоваться для ссылки как СКФ и нормальной внеклеточного матрикса. Процесс подготовки их идентичен.
2. Хранить 96-луночные культуральные планшеты на льду, и добавляют 50 мкл охлажденной внеклеточного матрикса на лунку с использованием предварительно охлажденный советы. Подготовить трех экземплярах 5 лунок, содержащих только нормальные внеклеточный матрикс. Подготовьте другой трех экземплярах 5 лунок, содержащих только СКФ внеклеточный матрикс.
3. Выдержите 96-луночный планшет при 37 ° С в течение 30 мин.
4. Промыть HUVECsодин раз с фосфатным буфером раствором без кальция и магния (PBS) и добавляют 1 мл 0,05% трипсин-ЭДТА. Инкубируйте блюдо при температуре 37 ° С в течение 1-5 мин, проверяя клетки каждую минуту, пока большинство клеток не сгонять. Выбить клетки, нажав колбу один раз.
   1. Добавьте 5 мл базальной среды (то есть эндотелиальную среду для роста клеток без чего - либо (например, добавки) добавлены) с 1% фетальной бычьей сыворотки (FBS). Собирают клетки в колбу пипеткой и переносят в 15 мл пробирку. Центрифуга клетки при 200 мкг в течение 5 мин и отбросить супернатант.
   2. Повторное приостановить с 2 мл базальной среды, подсчет клеток с использованием гемоцитометра и регулировать концентрацию клеток до 2-3 х 10 ⁵ клеток / мл.
5. Подготовьте 100 мкл следующих 10х концентраций ингибитора CXCR2 SB225002 в базальной среде: 11 мкМ, 5,6 мкМ, 1,1 мкМ, 0,56 мкМ и 0 мкМ (контроль).
6. Внесите 300 мкл суспензии HUVEC в каждую 5 MICRocentrifuge трубки. Добавьте 33 мкл концентрации ингибитора (11 мкМ, 5,6 мкМ, 1,1 мкМ, 0,56 мкМ и 0 мкМ) в одну пробирку каждая из которых содержит HUVECs и вихрь.
7. 50 мкл каждого из суспензий клеток (1-1.5 х 10 ⁴ клеток) в отдельные лунки внеклеточного матрикса. Пластинчатый каждой суспензии в трех экземплярах и инкубируют в течение 4-16 ч при температуре 37 ° С, 5% СО _2.
8. После 4-16 ч, взять 4 фотографии из трубок , образованных на лунку с использованием инвертированного микроскопа камеру ¹¹ (исходное увеличение х 100).

3. трубочку Срыв Анализ

1. Подготовьте внеклеточный матрикс и пластин в соответствии с теми же характеристиками, что и Tube Формирование анализа (шаги 2.1 до 2.3).
2. Готовят HUVEC подвески, как описано в шагах 2.4- 2.4.2 трубки формирования пробирного и аликвоты в 96-луночный планшет, содержащий внеклеточный матрикс при 50 мкл на лунку.
   Примечание: плиты достаточно скважин Sо том, что есть 3 скважины на медикаментозное лечение.
3. Рост клеток на внеклеточный матрикс в течение 4 ч при 37 ° С в атмосфере 5% СО _2. Возьмите изображения до начала лечения препаратом.
4. Готовят 2x концентраций ингибитора CXCR2 SB225002, как описано в шаге 2.5 пробирного пробки Formation, и добавляют по 50 мкл каждой концентрации на лунку 96-луночного планшета, содержащего HUVECs. Пластинчатые каждую концентрацию в трех экземплярах.
5. Инкубируйте планшет для другого 2-12 ч при температуре 37 ° С, 5% СО _2. Взять 4 изображения трубок , образованных в каждую лунку с использованием инвертированного микроскопа камеры (исходное увеличение × 100) ^11.

4. Количественная данных

1. Оценка формирования трубки, зафиксированное на изображениях путем измерения общей длины трубы труб в четырех случайных микроскопических полей с помощью программного обеспечения микроскопа камеры.
2. Откройте изображение в программе микроскоп камеры, и нажмите "Аннотации и Измерения9 ;. В разделе "длина", выберите инструмент "простая линия". Нажмите на изображение, а затем проведите линию по всей длине трубки, а затем щелкните правой кнопкой мыши.
   Примечание: Программное обеспечение автоматически рассчитает длину строки в пикселях и поместить данные в файл.
3. Повторите эту процедуру для всех линий труб в изображении, выбрав инструмент "простой линии". Нажмите на изображение, а затем проведите линию по всей длине трубки, а затем щелкните правой кнопкой мыши.
   Примечание: Программное обеспечение будет записывать длину каждой строки и отображать данные на экране.
4. После измерения каждой трубки на картинке, нажмите "Экспорт", затем выбрал 'Length' в формате электронных таблиц.
   Примечание: Данные длины будут экспортировать в электронную таблицу.
5. Добавьте все длины труб из таблицы, чтобы получить общую длину трубки. Вычислить и записать среднюю длину трубок.
   Примечание: Четыре повторности рекомендуется со средним и стандартным отклонением определяется.

5. Восстановление Клетки из внеклеточного матрикса культуры

1. Культура и выполнить Анализ образования трубки (смотри раздел 2) в более крупном масштабе, как 96-луночный планшет не даст достаточного количества клеток. Для 12 - луночные планшеты, используют 500 мкл внеклеточного матрикса и 500 мкл суспензии клеток HUVEC (1.5x10 ⁵ клеток).
2. Инкубируйте клетки в течение 4-16 ч с целью формирования трубки. Затем, аспирата среду для культивирования клеток. Промыть клетки с 1 мл холодного 1x PBS без кальция и магния.
3. Добавляют 1 мл охлажденного льдом PBS, 2,5 мМ ЭДТА буфере, на культуру и держать на льду в течение 10 мин.
4. Выбить клетки и внеклеточного матрикса смесь из чашки с помощью 1000 мкл пипетки с кончик отрезать, а затем передать в холодный 15 мл трубки, промойте хорошо с 4 мл охлажденного льдом PBS-2,5 мМ ЭДТА и помещают в пробирку ,
5. Поместите пробирки на лед в течение 1-4 ч, и не Переверните пробирку несколько раз, пока все внеклеточноематрица растворяется.
6. Центрифуга в течение 10 мин при 1620 мкг при 0 ° C
7. Повторное приостановить гранул клеток с 1 мл холодного PBS до 1.ml трубки на льду.
8. Центрифуга снова в течение 5 мин при 3000 х г при 0 ° С, а затем утилизировать супернатант.
9. Храните ячейки в -80 ° C.

Результаты

, Здоровое формирование эндотелиальной трубки Значительное может быть легко контрастируют с образованием заторможенной трубки в микроскопии изображений. Формирование здорового трубки появляется как организованная сеть капиллярных структур типа (рисунок 1). Для сравнения, образование тормозится трубка проявляется в виде рассеянных клеток (рисунок 2). Труба Анализ образования данных количественно путем измерения общей длины трубки капиллярных трубок (таблица 1). Кроме того, общая длина трубы, средняя длина трубы, общее число трубок, или общее число точек ветвления может быть измерено. образование Структурированная труба дает большую длину, чем чистая труба рассеянного роста заторможенной трубки. На рисунке 3, кривая зависимости реакции от дозы позволяет рассчитать IC ₅₀ в экспериментальных условиях HUVECs на СКФ внеклеточного матрикса и ингибитора CXCR2 SB225002.

Рисунок 1. Эндотелиальная образование т Убе на внеклеточного матрикса и фактором роста снижается (СКФ) внеклеточного матрикса. Два изображения показывают формирование успешной трубки на внеклеточного матрикса (А) и СКФ внеклеточного матрикса (B). Взаимосвязанную сеть трубок ясно показывает, что рост трубок здоров в этих HUVECs. Шкала бар = 10 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2. Ингибирование образования трубки на внеклеточный и фактор роста снижается (СКФ) внеклеточного матрикса с помощью ингибитора CXCR2 SB225002 (5,6 мкМ). Два изображения показывают трубкиобразование, которое было ингибируется ингибитором CXCR2 SB225002 (5,6 мкМ) на внеклеточном матриксе (А) и СКФ внеклеточного матрикса (B). Выделенные комочки клеток HUVEC видно на этом изображении, показывают, что клетки не способны образовывать трубы, необходимые для соединения друг с другом. Шкала бар = 10 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3. Доза кривая отклика на фактор роста со сниженным (СКФ) внеклеточного матрикса. Ось Х показывает длину трубы и Y-ось показывает концентрацию ингибитора CXCR2. Кривая доза-ответ показывает, что ответ на HUVEC ингибитора CXCR2 на СКФ внеклеточного матрикса зависят от дозы. IC ₅₀ (ингибитор полумаксимальнойконцентрация у) была рассчитана с помощью программного обеспечения , ¹³ и их можно сравнить с кривой доза - ответ для внеклеточного матрикса, например. IC ₅₀ представляет собой концентрацию ингибитора , который снижает реакцию на 50%. Столбики ошибок обозначают стандартное отклонение.

Фактор роста Снижение (СКФ) внеклеточный матрикс и ингибитор (4 повторяет каждый)	Общая длина трубы Средние (пикселей) (1 пиксель = 0,34 мкм)	Стандартное отклонение	Значение Р
СКФ внеклеточной матрицы контроля	2447	168,174
СКФ внеклеточный матрикс + 0,56 мкМ SB225002	1422,5	185.4218	0.000395
СКФ внеклеточный матрикс + 1,1 мкМ SB225002	1004	126.1784	2.14 × 10 -5
СКФ внеклеточный матрикс + 5,6 мкМ SB225002	519.25	129.6368	4,19 х 10 -6
СКФ внеклеточный матрикс + 11 мкМ SB225002	393.75	212.6857	1,21 × 10 -5

Таблица 1. Количественное общая длина труб на фактор роста снижается (СКФ) внеклеточного матрикса при различных условиях. Часть таблицы с использованием общая длина труб , записанных в образцах , выращенных на СКФ внеклеточного матрикса с различными концентрациями ингибитора CXCR2. Эти данные указывают на то, что ингибитор CXCR2 делает ингибирует образование трубки. Включены соответствующие значения , такие как среднее из четырех повторах, стандартное отклонение, и значение P. Измеряется в пикселях, чтобы показатьданные, которые экспортируются. IC ₅₀ может быть рассчитана с использованием статистического программного обеспечения ^13. (1 пиксель = 0,34 мкм)

Обсуждение

При проведении этого анализа, важно, чтобы держать внеклеточный матрикс на льду или при 4 ° С в любое время, если не указано иное. Если внеклеточный матрикс дают нагреться выше 4 ° С, она будет полимеризоваться, и анализ будет разрушена. Важно также , чтобы убедиться , что все , что входит в контакт (например, пипетки советы, пластина) с внеклеточным матриксом предварительно охлаждается для вышеупомянутой причине. Число клеток высевали в каждую лунку имеет решающее значение, слишком мало клеток не дает ожидаемого полотна в контрольном образце, слишком много клеток образуют большие кластеры клеток или монослой, и анализ не будет действительным. Еще одним важным фактором успеха этого анализа является клетка проход номер HUVECs. Номер прохода всегда должно быть ниже, чем десять, в противном случае формирование надежной трубка не может произойти. Кроме того, следует убедиться, что среда для культивирования клеток используется не истек, или клетки не будет жизнеспособным. Alternatраторов, можно Аликвотировать среды и ее компонентов, и хранить их при температуре -20 ° С, чтобы сохранить в течение определенного периода времени после истечения срока годности. Конечно, он по-прежнему предпочтительней использовать среду до истечения срока действия

Как и все процедуры, есть некоторые недостатки проведения анализа формирования эндотелиальных клеток трубки. Одной из основных проблем является то, что, так как существуют различные типы эндотелиальных клеток и матриц поддержки, результаты анализа могут значительно варьироваться в зависимости от используемого типа клетки и матрицы. Эндотелиальные клетки, используемые (HUVECs, HAECs или HMVECs) являются первичные клетки, они являются дорогостоящими, чтобы получить и имеют изменчивость по сравнению с иммортализованных клеток. Первичные клетки имеют ограниченные проходы для использования, и поэтому не подходят для долгосрочных экспериментов ангиогенеза ^14. Для получения достоверных данных, всегда следует использовать те же типы для анализа. Как и в других анализах , в лабораторных условиях , результаты анализа на образование трубки должны быть конукрепились в естественных условиях, так как результаты от контролируемых и искусственных условиях двумерной культуре ткани не всегда может быть отражено в комплексном биосистемы живого организма. Важно также иметь в виду, что этот тип анализа может быть использован только для демонстрации образование эндотелиальных клеток трубки, и не должны быть использованы для проверки других, не эндотелиальной трубки, образующей клетки.

Этот анализ является довольно простой и быстрый способ для количественного определения ангиогенный потенциал соединения. Он также образует платформу для дальнейших экспериментов, так как в одиночку, он не дает информации о конкретном механизме, посредством которого соединение на самом деле влияет на процесс формирования сосудов. Тем не менее, использование разнообразных внеклеточных матриц является примером того, как в дальнейшем создать основу для исследовательских вопросов, которые обычно не используется. Есть подходы к изучению конкретных био-химических механизмов соединения, включая специфические ингибиторы, которые нацелены на компонентыангиогенез путь. Другой подход может извлечь РНК из эндотелиальных клеток и использовать RT-PCR (ПЦР в реальном времени) ¹² для анализа изменений экспрессии генов , которые могут вызвать поведение роста наблюдается в анализе. Будущие приложения этого метода включают трансфицировали HUVECs для создания нокдауна анализов для конкретных стадий ангиогенеза. Существует потенциал для применения этого подхода для изучения лимфангиогенез пути. Изменяя компоненты внеклеточного матрикса, взаимодействие матрицы и клеточного процесса, поддерживающие ангиогенез при раке может быть дополнительно выяснены. Выделение РНК и белков из эндотелиальных клеток при этих условиях обеспечивают дополнительные количественные данные, соответствующие визуализации данных.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
EGM-2 complete growth medium (EGM-2 bullet kit CC-3162 )	Fisher	NC9525043	HUVEC complete growth medium: EGM-2 base medium mixed with BBE (Bovine Brain Extract), hEGF (Human Epidermal Growth Factor), Hydrocortisone, GA-1000 (Gentamicin, Amphotericin-B), 2% FBS (Fetal Bovine Serum), VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), hFGF-β (Human Fibroblast Growth Factor Beta), R3-IGF-1 (Long R Insulin-like Growth Factor One), Ascorbic Acid, and Heparin. Aliquot the medium and its components and store them at -20 °C, warm in 37 °C before use.
MATRIGEL MATRIX 10ML Growth Factor Reduced (GFR); 10 ml; LDEV-Free	Fisher	CB-40230	Growth Factor Reduced (GFR) extracellular matrix, keep in -20 °C, warm in 4 °C before use.
MATRIGEL MATRIX 10ML; 10 ml; LDEV-Free	Fisher	CB-40234	extracellular matrix, keep in -20 °C, warm in 4 °C before use.
SB225002	Fisher	559405	CXCR2 inhibitor, keep in -20 °C, warm in room temperature before use.
Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)	ScienCell Research Laboratories	8000	culture it according reference  10.
Trypsin 0.05%-EDTA phenol red	Invitrogen	25300-054	keep in 4 °C, warm in 37 °C before use.
Nikon ECLIPSE Ti	Nikon		Inverted Research Microscope.
NIS-Elements AR 4.20.02 64 bit	Nikon		Inverted Research Microscope software
Graph-pad Prism 5	GraphPad Software, Inc.		scientific 2D graphing and statistics software, to calculate IC50.