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Resumen

Anastasis es técnicamente difícil de detectar en vivo porque las células que se han invertido el proceso de muerte celular pueden ser morfológicamente indistinguibles de las células sanas normales. Aquí se describen los protocolos para la detección y seguimiento de las células que se someten a la anastasis en animales vivos mediante nuestro sistema de biosensor desarrollado recientemente en vivo CaspaseTracker.

Resumen

Anastasis (griego para "elevar a la vida") es un fenómeno de recuperación celular recientemente descubierto por el que mueren las células puede revertir procesos de muerte celular de fase que se asumen generalmente para ser intrínsecamente irreversible. Promoción de anastasis podría en principio rescate o preservación lesionado las células que son difíciles de reemplazar como cardiomiocitos o neuronas, facilitando la recuperación del tejido. Por el contrario, supresión de la anastasis en células de cáncer, que experimenta apoptosis después de terapias contra el cáncer, puede asegurar la muerte de la célula de cáncer y reducir las posibilidades de recurrencia. Sin embargo, estos estudios se han visto obstaculizados por la falta de herramientas para el seguimiento del destino de las células que experimentan la anastasis en animales vivos. El desafío es identificar las células que se han invertido el proceso de muerte celular a pesar de su aspecto morfológico normal después de la recuperación. Para superar esta dificultad, hemos desarrollado Drosophila y mamíferos CaspaseTracker sistemas de biosensores que pueden identificar y rastrear permanentemente anastática células in vitro o en vivo. Aquí, presentamos en vivo los protocolos para la generación y uso del sistema CaspaseTracker doble biosensor para detectar y rastrear anastasis en Drosophila melanogaster después de la exposición transitoria a los estímulos de la muerte de la célula. Si bien biosensores convencionales y protocolos pueden etiquetar las células activamente en la muerte celular apoptótica, el biosensor CaspaseTracker puede etiquetar permanentemente las células que se han recuperado después de la activación de la caspasa - un rasgo distintivo de la etapa tardía de apoptosis, y al mismo tiempo identificar procesos apoptóticos activo. Este biosensor también puede seguir la recuperación de las células que otras formas de muerte celular que directa o indirectamente afectadas actividad caspasa. Por lo tanto, este protocolo nos permite seguir continuamente el destino de estas células y su progenie, facilitar futuros estudios de las funciones biológicas, mecanismos moleculares, las consecuencias fisiológicas y patológicas e implicaciones terapéuticas de Anastasis. También discutimos los controles adecuados para distinguir las células que se someten a anastasis que mostrar no apoptótica caspasa actividad in vivo.

Introducción

Programan la muerte celular, como la apoptosis, juega un papel esencial en el desarrollo embrionario y la homeostasis normal al eliminar no deseadas, heridas o peligrosas células en organismos multicelulares1,2,3. La pérdida del equilibrio entre la muerte celular y la supervivencia puede conducir a consecuencias fatales como cáncer, insuficiencia cardíaca, autoinmunidad y degeneración4,5,6,7,8. Desencadena la activación de caspasas ha sido considerada tradicionalmente como el "punto de no retorno" en apoptosis9,10,11, que verdugo demolición celular rápida y masiva12, 13,14,15,16. Desafiando este dogma general, hemos demostrado que cultivos de células primarias muertos y las células cancerosas pueden recuperar no sólo después de la activación de caspasas, pero importante también siguientes de la célula características distintivas de la muerte como membrana del plasma blebbing, contracción de la célula, la fragmentación mitocondrial, liberación mitocondrial del citocromo c al citosol, nuclear y condensación de la cromatina, daños en el ADN, fragmentación nuclear, la célula superficial exposición de fosfatidilserina (PS) y la formación de cuerpos apoptóticos 17 , 18 , 19 , 20 , 21. proponemos que anastasis es un fenómeno de recuperación de células intrínsecas, como la muerte de las células pueden recuperar después de la eliminación de la célula muerte estímulos17,18,19,20, 21. acuñó el término "Anastasis" (Αναστάσης)18, que significa "levantamiento a la vida" en griego, para describir este fenómeno de recuperación inesperada de la célula. Nuestra observación de anastasis es apoyado por estudios independientes recientes que revelan también la recuperación de las células después de fosfatidilserina externalización22,23,24, limitado mitocondrial externa permeabilización de membrana25, activación de linaje mixto como quinasa (MLKL) y de contracción celular26.

Caracterización de los mecanismos de regulación de la anastasis tendrá consecuencias fisiológicas, patológicas y terapéuticas cambian paradigmas. Anastasis podría representar un mecanismo previamente desconocido citoprotector para rescatar o preservar importantes postmitotic células y tejidos que son difíciles de reemplazar y posiblemente cuenta de reversión de la insuficiencia cardíaca, ventricular descarga con ventrículo izquierdo ayudar a los dispositivos (VAD)27,28, recuperación de células fotorreceptoras después de la exposición transitoria de excesiva luz29,30,31, o reparación de las neuronas después de lesión de cerebro32. Si es así, promover la anastasis podría mejorar la recuperación de células y tejidos. Por el contrario, anastasis podría ser una táctica de escape inesperado utilizada por las células cancerosas a sobrevivir la terapia de inducción de muerte celular, causando cáncer recurrencia17,18. Por lo tanto, supresión de la anastasis al morir las células de cáncer durante y después de tratamiento contra el cáncer podría ser una nueva estrategia terapéutica para curar el cáncer mediante la prevención de sus recaídas.

Durante el proceso de anastasis, hemos encontrado que algunas células recuperadas adquirieron permanentes alteraciones genéticas y experimentaron la transformación oncogénica, probablemente debido a daños en el ADN que se incurra durante apoptosis18,20,21 . Invertir el proceso de muerte de las células dañadas de ADN podría ser un mecanismo de tumorigénesis, potencialmente subyacente a la observación que se repite la lesión tisular aumenta el riesgo de cáncer en una variedad de tejidos, tales como crónicas lesiones térmicas en el esófago inducida por por el consumo de bebidas muy calientes33,34,35, daño hepático por alcoholismo36,37, evolución del tumor después de genotóxicos cáncer terapia38, 39,40y el desarrollo de nuevos cánceres de los tejidos normales que surgen durante los intervalos entre los ciclos de terapia contra el cáncer41,42,43,44 . Si es true, dirigidos a anastasis podrían prevenir o detener el desarrollo del cáncer y la progresión. Hemos encontrado que inducido por hambre morir células de germen se someten a anastasis en re-fed Drosophila19.  Si anastasis se produce en las células germinales con daño en el ADN, puede ser cuenta para la observación de que prolongado estrés ambiental promueve el desarrollo de enfermedades genéticas. Por ejemplo, las hambrunas contribuyen al desarrollo de enfermedades heredables transgeneracionales como la diabetes y enfermedades coronarias del corazón45. Por lo tanto, comprensión anastasis podría conducir a estrategias para la prevención de enfermedades hereditarias causadas por este mecanismo potencial de desarrollo.

Para aprovechar el descubrimiento de anastasis y dirigirla para desarrollar terapias innovadoras, es esencial para el estudio de la causa y la consecuencia de la anastasis en animales vivos. Sin embargo, es técnicamente difícil para identificar y rastrear anastática células en vivo, porque las células que recuperados del proceso de muerte celular aparecen morfológicamente indistinguibles de las células sanas normales, y no es ningún biomarcador de anastasis identificado sin embargo17,18,21. Para abordar estos problemas, hemos desarrollado recientemente un nuevo en vivo caspasa biosensor designado "CaspaseTracker"19, para identificar y rastrear las células que sobreviven apoptosis después de la activación de caspasas de19,46, el sello de apoptosis10,14. Distinción de los biosensores de caspasas "tiempo real" como SCAT12,47, Apoliner48, CA-GFP49, ApoAlert18,50, C3AIs51 iCasper52 que detecta actividad caspasa, el biosensor CaspaseTracker además cuenta con la capacidad para etiquetar permanentemente las células esa actividad caspasa expresa incluso transitoriamente. Por lo tanto, el biosensor CaspaseTracker permite seguimiento a largo plazo de anastasis después de reversión de caspase-mediada la célula muerte proceso in vivo.

Protocolo

1) preparación del CaspaseTracker Biosensor vuela

  1. Anestesiar a moscas con CO2y utilizar un pincel para transferir hembras vírgenes de 7 a 10 caspase sensibles Gal4 (DQVD)19 y 7 a 10 G-Trace53 Gal4 reportero joven macho vuela (o viceversa) en la misma cubeta con mosca comida y pasta de levadura fresca.
    Nota: Cruz de moscas Gal4 caspasa-sensible (DQVD) y G-Trace produce moscas de progenie de CaspaseTracker. Cruz de caspasa -ensensible (DQVA)19 Gal4 y moscas G rastro proporcionará control negativo vuela (ver discusión). Levadura fresca pasta sirve como fuente de proteína para mejorar la producción de huevos, por lo aumenta el número de progenie. Seleccionar hembras vírgenes y varón joven vuela según sus fenotipos54.
  2. Incubar las moscas a 18 grados centígrados (oC) en la Cruz por 3 a 7 días y luego se transfieren las moscas a un nuevo vial para configurar una nueva cruz a 18 ° C. Seguir a incubar el frasco original en 18 ° C hasta que la progenie vuela eclose.
    Nota: Transferencia de las moscas de padres nuevos viales para evitar hacinamiento de progenie en el vial original. Padre de moscas pueden producir progenie con alimentos frescos y la pasta de levadura en los primeros 2 a 3 interruptores, y entonces la productividad disminuirá significativamente con el tiempo. Criar moscas 18 ° C puede reducir la señal inespecífica de biosensor CaspaseTracker (ver discusión).
  3. Seleccionar progenie vuela con fenotipos correcta54 para los siguientes experimentos.
    Nota: Los transgenes de Gal4 y G-Trace caspase sensibles aquí se encuentran en el segundo cromosoma, equilibrado con balanceador de CyO. Seleccione la progenie no rizado ala (sin CyO), que tanto los transgenes de caspasa-Gal4 y G-Trace.

2) aplicación de la inducción de muerte celular transitoria a las moscas CaspaseTracker Biosensor

  1. La transferencia de 10 a 20 recién eclosed mujer vuela a un nuevo frasco con mosca alimentos frescos y pasta de levadura fresca por 1 día a 18 ° C para permitir la producción de huevos de la cámara por Oogénesis.
    Nota: Mantener a la hembra con las moscas macho podría mejorar la producción de la cámara de huevos.
  2. Para inducir a huevo las cámaras sufren apoptosis por shock frío, transferencia la hembra vuela a nuevo frasco vacío, que se coloca en-7 ° C por 1 h.
    Nota: shock frío lesiona las células por inducción de plasma membrana ruptura55,56.
  3. Para inducir el huevo las cámaras sufren apoptosis por inanición de proteína, transferencia de las moscas hembra a un nuevo frasco con alimentos del agar de sacarosa y 1% de 8% a 18 ° C durante 3 días.
    Nota: Hambre de proteínas (alimentos sin proteínas) puede activar cámaras de huevo para experimentar apoptosis57,58,59 y autofagia60,61. Interruptor vuela a un nuevo frasco con alimentos de agar de sacarosa y 1% 8% todos los días para mantener condiciones óptimas de la sucrosa alimentos mosca.
  4. Transferir las moscas estresadas a un nuevo frasco con mosca alimentos frescos y pasta de levadura fresca durante 3 días a 18 ° C para que puedan recuperar. Diseccionar la hambrienta y las moscas de hambre-se recuperó para obtener cámaras de huevo en los ovarios como descrito62.
    Nota: Para diseccionar Drosophila para obtener ovarios, anestesiar a moscas con CO2, use 2 pares de pinzas para quitar cabeza de mosca y utilice las pinzas para sacar la base del abdomen para eliminar los ovarios de las moscas.

3) fijación y tinción de huevo disecada salas para la proyección de imagen

  1. Transferencia de las cámaras de huevo disecada junto con alrededor de 0,5 mL fosfato tamponada salino (PBS) a tubos de centrífuga de 1 mL. Permita que los huevos a establecerse.
    Nota: Cubrir las puntas de pipeta de plástico con 1% albúmina de suero bovino (BSA) disuelto en agua o en PBS para evitar que las cámaras de huevo para pegar en la superficie de plástico de las puntas. Realizar los siguientes procedimientos en oscuridad para evitar el fotoblanqueo de proteína fluorescente roja (RFP, también conocido como DsRed) y proteína fluorescente verde (GFP) en la cámara del huevo.
  2. Retirar el PBS mediante pipeteo y luego paraformaldehído al de 4% de 0, 5 mL de PBS para fijar las cámaras de huevo a temperatura ambiente en oscuridad durante 20 a 30 minutos.
    Nota: Aplicar rotación suave en este y los siguientes pasos de incubación.
  3. Retire el paraformaldehido mediante pipeteo y luego se lava la cámara del huevo con 0.5 mL de SAFT (PBS + 0.1% Tritón X-100) para 3 veces.
    Nota: La fijación prolongada podría reducir las señales de RFP y GFP.
  4. Incubar las cámaras huevo con SAFT para 1 a 2 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C con rotación suave a permeabilizar las cámaras de huevo.
    Nota: Saft también puede evitar cámaras de huevo se adhiera a la superficie de plástico revestida de BSA no.
  5. Quitar el SAFT mediante pipeteo y luego 0,5 mL de 10 μg/mL de colorante Hoechst nuclear azul en SAFT para cámaras de huevo de 1 a 2 h a temperatura ambiente para tinción de núcleo.
    NOTE1: Evitar la incubación prolongada con tinte nuclear como esto aumentará la señal inespecífica.
    Nota 2: Enfoque alternativo para teñir el núcleo sin Hoechst es agregar 200 μL anti blanqueo montaje agente DAPI (ver materiales) e incubar durante la noche63, antes de montar los tejidos en vidrio cubreobjetos, como se describe en el protocolo de 3.8.
    Nota 3: realizar la tinción y los siguientes procedimientos en oscuridad para evitar el fotoblanqueo.
  6. Quitar el tinte nuclear mediante pipeteo y luego aplicar 0.5 mL SAFT para lavar las cámaras de huevo en los tubos de centrífuga de 1 mL por 3 veces, con 10 a 20 min de incubación con rotación suave entre cada paso de lavado.
  7. Quitar todos SAFT con pipeta fina y luego aplicar 200 agente de montaje anti blanqueo μL (ver materiales) al incubar las cámaras de huevo a temperatura ambiente durante 3 horas o durante la noche a 4 ° C hasta que las cámaras de huevo se hunden hasta el fondo del tubo.
    Nota: los tejidos que han absorbido completamente el agente de montaje se hunden hasta el fondo del tubo.
  8. Montaje de las cámaras de huevo manchado transfiriendo con 200 μL anti-blanqueo montaje agente sobre un portaobjeto previamente limpiado para la proyección de imagen mediante pipeteo, cubrir los compartimientos del huevo con un cubreobjetos de vidrio previamente limpiado de 20 x 20 mm y sellado de cubreobjetos en portaobjetos de vidrio, poniendo esmalte de uñas en el borde de la hoja de cubierta.
    NOTE1: Limpieza previa de la diapositiva de cristal y cubreobjetos con el agua o el 70% de etanol.
    Nota 2: Aplicar vaselina entre el portaobjetos de cristal y el cubreobjetos para evitar la destrucción de los compartimientos de huevo al súper.
  9. Imagen de las cámaras de huevo usando fluorescencia o microscopio confocal, usando un 20 x, NA 0.8 objetivo Plan-Apochromat, con excitación luz longitud de onda 405 nm para la tinción nuclear (detectar emisión ~ 461 nm), 561 nm para (señal RFP (actividad caspasa recientes o en curso) detectar emisión ~ 590 nm) y 488 nm para señal GFP (más allá de la actividad de caspasa) (detectar emisión ~ 518nm).
    Nota: Vea nuestros protocolos publicados para la microscopia20,64.

Resultados

Microscopía Celular en time-lapse es un método confiable para tracto anastasis en células cultivadas20, es difícil identificar que las células han sufrido anastasis en animales, porque las células recuperadas aparecen morfológicamente indistinguibles a las células sanas normales no han procurado la muerte celular. Por ejemplo, las células de cáncer de cérvix humano HeLa Mostrar características morfológicas de la apoptosis1,2

Discusión

El sistema de doble biosensor CaspaseTracker es una novedosa y exclusiva herramienta que permite la detección de los últimos o actividad caspasa continua y seguimiento de las células que se han invertido muerte celular procesan y sobrevivieron después de experimentar actividad caspasa en vivo. Mientras que la actividad de caspasas ha asumido tradicionalmente como una característica distintiva de la apoptosis, cada vez más estudios revelan que no apoptótica caspasa activida...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a Darren Obbard Drosophila imagen en Figura 3 y en manuscrito video; J. Marie Hardwick, Wade Gibson y Heather M. Lamb para la valiosa discusión de este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por un Sir Edward Youde Memorial Fellowship (H.L.T.), Dr. Walter Szeto Memorial Scholarship (H.L.T.), Fulbright concede 007-2009 (H.L.T.), beca de la Fundación de investigación de Ciencias de la vida (H.L.T.) y NCI K22 otorga CA204458 (H.L.T.). Ho Tang Lam era un Shurl y Kay Curci Foundation Fellow de la Fundación de investigación de Ciencias de la vida (2014-2017).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
CONSUMABLES AND REAGENTS
Vectashield mounting mediumVector ProductsH-1000Antifade mounting medium
Vectashield mounting medium (with DAPI)Vector ProductsH-1200Antifade mounting medium with DAPI
ForcepsTed Pella#505 (110mm, #5)Dumont tweezer biology grade, stainless steel
Hanging Drop SlidesFisher Scientific12-565BGlass slides
Hoechst 33342Molecular ProbesH1399DNA stain
Mitotracker Red CMXRos Molecular ProbesM-7512Mitochondria stain
Cleaved caspase-3 (Asp175) antibodyCell Signaling Technology#9661Stain for active fragment of caspase-3
Bovine Serum Albumin (BAS)Sigma-AldrichA8806Blocking agent for immunostaining
Phosphate Buffered Saline VWR114-056-101Medium for washing and immunostaining
Triton™ X-100Sigma-AldrichT8787Detergent for cell permeabilization
NameCompanyCatalog NumberComments
EQUIPMENT
LSM780 confocal microscopeCarl ZeissN/AImaging
Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000 Carl ZeissN/ADrosophila dissection
AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150WAmScopeWBM99316 Light source

Referencias

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