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  • matériels
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Résumé

Anastasis est techniquement difficile à détecter en vivo , parce que les cellules qui ont inversé le processus de mort cellulaire peuvent être morphologiquement impossibles à distinguer des cellules saines normales. Nous décrivons ici les protocoles pour détecter et suivre des cellules subissant anastasis animaux vivants à l’aide de notre système de biocapteur nouvellement mis au point en vivo CaspaseTracker.

Résumé

Anastasis (« ressusciter à la vie » en grec) est un phénomène de récupération cellulaire récemment découverte par lequel mourir cellules peut inverser les processus de mort cellulaire avancé qui sont généralement considérées comme intrinsèquement irréversibles. Promotion anastasis pourraient blesser dans le sauvetage de principe ou de conserver des cellules qui sont difficiles à remplacer comme cardiomyocytes ou neurones, facilitant ainsi la récupération de tissu. À l’inverse, supprimant l’anastasis dans les cellules cancéreuses, en apoptose après traitements anticancéreux, peut assurer la mort des cellules cancéreuses et réduire les risques de récidive. Toutefois, ces études ont été entravés par le manque d’outils pour suivre le destin des cellules subissant anastasis animaux vivants. Le défi consiste à identifier les cellules qui ont inversé le processus de mort cellulaire malgré leur apparence morphologiquement normaux après récupération. Pour surmonter cette difficulté, nous avons développé la drosophile et les systèmes mammaliens biocapteur CaspaseTracker qui peuvent d’identifier et de suivre en permanence l’anastatique cellules in vitro ou in vivo. Nous présentons ici en vivo de protocoles pour la génération et l’utilisation du système dual biocapteur CaspaseTracker pour détecter et pister anastasis chez Drosophila melanogaster après exposition transitoire à des stimuli de mort cellulaire. Tandis que les biocapteurs classiques et protocoles peuvent marquer des cellules mort cellulaire par apoptose activement en cours, le biocapteur CaspaseTracker peut marquer définitivement les cellules qui ont récupéré après activation de la caspase - une caractéristique de l’apoptose des stades, et en même temps identifier les processus apoptotique active. Ce biocapteur permet également de suivre la récupération des cellules qui ont tenté d’autres formes de mort cellulaire qui impliqués directement ou indirectement l’activité caspase. Par conséquent, ce protocole permet de suivre en permanence le sort de ces cellules et leur progéniture, facilitant les études futures des fonctions biologiques, les mécanismes moléculaires, les conséquences physiologiques et pathologiques et implications thérapeutiques de Anastasis. Nous discutons également les contrôles appropriés pour distinguer les cellules subissant anastasis de ceux qui affichent non-apoptotic caspase activité in vivo.

Introduction

Mort programmée de cellules, telles que l’apoptose, joue un rôle essentiel dans le développement embryonnaire et l’homéostasie normale en éliminant les cellules indésirables, blessés ou dangereux dans les organismes multicellulaires1,2,3. La perte de l’équilibre entre la mort cellulaire et la survie peut conduire à des conséquences mortelles comme le cancer, insuffisance cardiaque, auto-immunité et dégénérescence4,5,6,7,8. L’activation de bourreau caspases a traditionnellement été considérée comme le « point de non retour » dans l’apoptose9,10,11, telle qu’elle déclenche rapide et massive de destruction cellulaire12, 13,14,15,16. Contestant ce dogme général, nous avons démontré que les cellules primaires mourants cultivées et des cellules cancéreuses peuvent récupérer non seulement après l’activation de la caspase, mais aussi suivant cellule important poinçons de mort dont la membrane plasmique blebbing, rétrécissement de la cellule, fragmentation mitochondriale, libération de mitochondrial du cytochrome c dans le cytosol, nucléaire et condensation de la chromatine, dommages à l’ADN, fragmentation nucléaire, exposition de surface cellulaire de la phosphatidylsérine (PS) et la formation de corps apoptotiques 17 , 18 , 19 , 20 , 21. nous proposons cette anastasis est un phénomène de récupération cellule intrinsèques, comme les cellules mourantes peuvent récupérer après le retrait de cellule mort des stimuli17,18,19,20, 21. on a inventé le terme « Anastasis » (Αναστάσης)18, qui signifie « s’élevant à vie » en grec, à décrire ce phénomène de récupération cellule inattendu. Notre observation d’anastasis est confirmée par récentes études indépendantes qui révèlent également la récupération des cellules après phosphatidylsérine externalisation22,23,24, limitée mitochondriale externe membrane perméabilisation25, activation de lignée mixte comme kinase (MLKL) et cellule rétrécissement26.

Caractériser les mécanismes régulant l’anastasis aura des implications de physiologiques, pathologiques, thérapeutiques ou de paradigme. Anastasis pourrait représenter un mécanisme de cytoprotecteurs jusque-là inconnues sauver ou préserver les cellules postmitotiques importantes et les tissus qui sont difficiles à remplacer et éventuellement compte d’inversion de l’insuffisance cardiaque par décharge ventriculaire avec ventriculaire gauche aider les dispositifs (LVAD)27,28, récupération des cellules photoréceptrices après exposition transitoire de lumière excessive29,30,31, ou la réparation des neurones après lésion de cerveau32. Si donc promouvoir anastasis pourrait améliorer la récupération de cellules et de tissus. À l’inverse, l’anastasis pourrait être une tactique inattendue d’échappement utilisée par les cellules cancéreuses de survivre à la thérapie cellulaire-induisant la mort, causant le cancer récidive17,18. Par conséquent, supprimant anastasis en mourant de cellules cancéreuses pendant et après que le traitement du cancer pourrait être une nouvelle stratégie thérapeutique pour guérir le cancer en empêchant leur rechute.

Au cours du processus de l’anastasis, nous avons trouvé que certaines cellules récupérées acquis des altérations génétiques permanentes et a subi une transformation oncogénique, probablement en raison de dommages à l’ADN engagées au cours de l’apoptose18,20,21 . Inverser le processus de mort des cellules endommagées de l’ADN pourrait être un mécanisme de la tumorigenèse, potentiellement qui sous-tend l’observation qui répète la lésion tissulaire augmente le risque de cancer dans une variété de tissus, comme une lésion thermique chronique dans l’oesophage provoquée par par la consommation de boissons très chaudes33,34,35, atteinte hépatique due à l’alcoolisme36,37, évolution de la tumeur après génotoxique du cancer therapy38, 39,40et le développement de nouveaux cancers des tissus normaux qui surviennent pendant les intervalles entre les cycles de traitement anticancéreux41,42,43,44 . Si true, ciblant l’anastasis pourrait prévenir ou arrêter le développement du cancer et la progression. Nous avons trouvé que la famine induite par les cellules germinales mourants subissent anastasis réalimenté Drosophila19.  Si anastasis se produit dans les cellules germinales avec altération de l’ADN, ça pourrait être responsables de l’observation qui prolonge le stress environnemental favorise le développement des maladies génétiques. Par exemple, famines contribuent à l’apparition de maladies héréditaires transgénérationnel comme le diabète et les maladies coronariennes,45. Par conséquent, compréhension anastasis pourrait conduire à des stratégies de prévention des maladies héréditaires causée par ce mécanisme potentiel.

Pour exploiter la découverte de l’anastasis et dirigez-la à développer des thérapies innovantes, il est essentiel d’étudier la cause et la conséquence de l’anastasis animaux vivants. Toutefois, il est techniquement difficile de repérer les cellules anastatique in vivo, car les cellules qui recouvré des processus de mort cellulaire apparaissent morphologiquement impossibles à distinguer des cellules saines normales, et il n’y a aucun marqueur biologique de l’anastasis identifiés encore17,18,21. Pour résoudre ces problèmes, nous avons récemment mis au point un nouveau en vivo caspase biocapteur désigné « CaspaseTracker »19, pour repérer les cellules qui survivent l’apoptose après activation de caspases19,46, le caractéristique de l’apoptose10,14. Il distingue les biocapteurs « temps réel » caspase tels que SCAT12,47, Apoliner48, CA-GFP49, ApoAlert18,50, C3AIs51 et iCasper52 détectant l’activité en cours de caspase, le biocapteur CaspaseTracker dispose en plus de la possibilité d’étiqueter en permanence des cellules cette activité de caspase express même éphémère. Le biocapteur CaspaseTracker permet donc, suivi à long terme de l’anastasis après le renversement de caspase-mediated cell death processus in vivo.

Protocole

1) préparation du biocapteur CaspaseTracker mouches

  1. Anesthésier les mouches avec du CO2et utiliser un pinceau pour transférer les femelles vierges de 7 à 10 caspase sensibles Gal4 (DQVD)19 et 7 à 10 G-Trace53 Gal4 journaliste jeunes mouches mâles (ou vice versa) dans le même flacon avec alimentation mouche et la pâte de levure fraîche.
    Remarque : Croix de mouches Gal4 Caspase-sensibles (DQVD) et G-Trace produira des mouches de descendance CaspaseTracker. Croix de Caspase -danssensibles (DQVA)19 Gal4 et mouches G-Trace fournira les mouches de contrôle négatif (Voir discussion). Levure fraîche pâte sert de source de protéines pour améliorer la production d’oeufs, ce qui augmente le nombre de descendants. Choisissez les femelles vierges et les jeunes mouches mâles selon leurs phénotypes54.
  2. Incuber les mouches à 18 degrés Celsius (o-C) au cours de la Croix pendant 3 à 7 jours et puis transférez les mouches dans un nouveau flacon de mettre en place une nouvelle croix à 18 ° C. Continuer à incuber le flacon d’origine à 18 ° C jusqu'à ce que la progéniture vole eclose.
    Remarque : Transférer les mouches de parent à nouveaux flacons pour éviter le surpeuplement de la progéniture dans le flacon d’origine. Mouches de parent peuvent produire la progéniture avec des aliments frais et pâte de levure d’abord 2 ou 3 aiguilles, et puis la productivité diminuera sensiblement avec le temps. Élever des mouches 18 ° C peut réduire le signal non spécifique du biocapteur CaspaseTracker (Voir discussion).
  3. Sélectionnez progéniture vole avec des phénotypes correcte54 pour les expériences suivantes.
    Remarque : Les transgènes de caspase sensibles Gal4 et G-Trace ici sont situés dans le deuxième chromosome, équilibré avec équilibreur de CyO. Sélectionnez la progéniture d’aile non bouclés (sans CyO), qui a les deux transgènes de Gal4 et G-Trace de caspase-dépendantes.

2) demande d’Induction de mort cellule transitoire de biocapteur CaspaseTracker mouches

  1. Le transfert de 10 à 20 nouvellement éclos femelle vole à nouveau dans une cuvette avec des aliments frais de mouche et la pâte de levure fraîche pour 1 jour à 18 ° C pour permettre la production de œufs chambre par ovogenèse.
    Remarque : Garder la femelle avec les mouches mâles pourrait améliorer la chambre de ponte.
  2. Pour provoquer l’oeuf chambres d’apoptose par choc hypothermique, transfert la femelle vole à nouveau flacon vide, qui est ensuite placé à-7 ° C pendant 1 h.
    NOTE: choc hypothermique blesse des cellules en provoquant la rupture de la membrane plasmique55,56.
  3. Pour provoquer l’oeuf chambres d’apoptose par la famine de protéine, transférer les mouches femelles dans un nouveau flacon avec 8 % de sucrose et de 1 % des aliments agar à 18 ° C pendant 3 jours.
    Remarque : Famine de protéine (non protéique alimentaire) peut déclencher des oeufs chambres pour subir l’apoptosis57,58,59 et autophagie60,61. Interrupteur vole à nouveau dans une cuvette avec de la nourriture de 8 % de sucrose et 1 % d’agar chaque jour pour maintenir les conditions optimales de saccharose aliments mouche.
  4. Transférer les mouches stressées à une cuvette de nouveau avec des aliments frais de mouche et la pâte de levure fraîche pendant 3 jours à 18 ° C, pour leur permettre de récupérer. Disséquer les affamés et les mouches de faim-récupéré pour obtenir des œufs chambres à ovaires comme décrit62.
    Remarque : Pour disséquer la drosophile pour obtenir des ovaires, anesthésier les mouches avec du CO2et 2 paires de pinces permet de supprimer la tête de mouche et utilisez la pince pour tirer sur la base de l’abdomen pour retirer les ovaires des mouches.

3) fixation et coloration des oeufs disséqués Chambers pour l’imagerie

  1. Transférer les chambres oeuf disséqué avec autour de 0,5 mL tamponné phosphate salin (PBS) à tubes à centrifuger 1 mL. Laissez les oeufs se sédentariser.
    Remarque : Enduire les pointes de pipette en plastique avec 1 % albumine sérique bovine (BSA) dissous dans l’eau ou PBS pour empêcher les chambres de l’oeuf à coller sur la surface en plastique des conseils. Exécutez les procédures suivantes dans l’obscurité, afin d’éviter le photoblanchiment de la protéine fluorescente rouge (DP, également connu sous le nom de DsRed) et la protéine fluorescente verte (GFP) dans les chambres de l’oeuf.
  2. Supprimer les PBS en pipettant également et ensuite appliquer 0,5 mL de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS pour fixer les chambres de le œuf à température ambiante dans l’obscurité pendant 20 à 30 min.
    Remarque : Appliquer la rotation douce dans ce domaine et les étapes suivantes de l’incubation.
  3. Retirer le paraformaldéhyde en pipettant également et ensuite lavé la couveuse avec 0,5 mL PBST (PBS + 0,1 % Triton X-100) pour 3 fois.
    Remarque : La fixation prolongée pourrait réduire les signaux DP et GFP.
  4. Incuber les chambres de l’oeuf avec PBST pendant 1 à 2 h à température ambiante ou pendant la nuit à 4 ° C, avec légère rotation pour permeabilize les chambres de l’oeuf.
    NOTE: PBST peut aussi éviter les oeufs chambres s’en tenir à la surface en plastique non-BSA.
  5. Supprimer le PBST en pipettant également et ensuite appliquer 0,5 mL de 10 μg/mL de colorant bleu de Hoechst nucléaire dans du PBST aux oeufs chambres pour 1 à 2 h à température ambiante sur la tache pour le noyau.
    Remarque 1 : Éviter une incubation prolongée avec un colorant nucléaire car cela va augmenter le signal non spécifique.
    Note 2 : Une approche alternative pour colorer le noyau sans Hoechst est d’ajouter 200 μL anti-blanchiment montage agent au DAPI (voir documentation) et incuber une nuit63, avant de monter les tissus sur la lamelle de verre, tel que décrit au protocole 3,8.
    NOTE3: effectuer la coloration et les procédures suivantes dans l’obscurité, afin d’éviter le photoblanchiment.
  6. Enlever le colorant nucléaire en pipettant également et ensuite appliquer 0,5 mL PBST pour laver les chambres de le œuf dans les tubes à centrifuger 1 mL pour 3 fois, avec 10 à 20 min d’incubation avec légère rotation entre chaque étape de lavage.
  7. Supprimer tous les PBST avec fine pipette et appliquez ensuite 200 agent de montage anti-blanchiment μL (voir documents) à incuber les chambres de le œuf à température ambiante pendant 3 h, ou toute la nuit à 4 ° C jusqu'à ce que les chambres de le œuf coulent au fond du tube.
    Remarque: les tissus qui ont totalement absorbé l’agent montage coulent au fond du tube.
  8. Monter les chambres des oeufs colorés en transférant leur avec 200 μL anti-blanchiment montage agent sur une lame de verre préalablement nettoyé pour l’imagerie de pipetage, couvrir les chambres de le œuf avec une lamelle de verre préalablement nettoyé de 20 x 20 mm et sceller la lamelle couvre-objet sur lame de verre en mettant vernis à ongles au bord de la lamelle couvre-objet.
    Remarque 1 : Un nettoyage préalable de la lame de verre et de la lamelle couvre-objet avec de l’eau, soit 70 % éthanol.
    Note 2 : Appliquer la gelée de pétrole entre la lame de verre et de la lamelle couvre-objet pour éviter de détruire les chambres de l’oeuf par surcompression.
  9. Les chambres de l’oeuf à l’aide de fluorescence ou microscope confocal, utilisez un 20 x, NA 0,8 d’image objectif Plan-Apochromat, avec excitation légère longueur d’onde de 405 nm pour la coloration des noyaux (détecteur d’émission ~ 461 nm), 561 nm pour les DP (en cours ou récentes caspase activity) signal ( détecteur d’émission ~ 590 nm) et 488 nm pour le signal de la GFP (ancien caspase activity) (détecter des émissions ~ 518nm).
    Remarque : Voir nos protocoles publiés pour microscopie20,,64.

Résultats

Microscopie des cellules vivantes Time-lapse est une méthode fiable pour tract anastasis dans des cellules cultivées20, mais il est difficile d’identifier les cellules qui ont subi l’anastasis chez les animaux, parce que les cellules récupérés apparaissent morphologiquement indiscernables des cellules saines normales qui n’ont pas tenté de mort cellulaire. Par exemple, les cellules humaines de cancer du col utérin HeLa affichent des caractéristiques morphologiques de l’apoptose

Discussion

Le système de double biocapteur CaspaseTracker est un outil unique qui permet de détecter ces dernières et novateur ou activité de la caspase en cours et le suivi des cellules qui ont renversé la mort cellulaire traitent et survivent après avoir connu caspase activité in vivo. Alors que l’activité de la caspase a été traditionnellement considérée comme une caractéristique de l’apoptose, croissant des études révèlent que non-apoptotic caspase activité joue un ...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions Darren Obbard Drosophila image dans la Figure 3 et vidéo manuscrit ; J. Marie Hardwick, Wade Gibson et Heather M. Lamb pour une analyse précieuse de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par un Sir Edward Youde Memorial Fellowship (H.L.T.), Dr. Walter Szeto Memorial Scholarship (H.L.T.), Fulbright grant 007-2009 (H.L.T.), Life Science Research Foundation fellowship (H.L.T.) et NCI K22 accordent CA204458 (H.L.T.). Ho Lam Tang était un h et Kay Curci Foundation Fellow de la Fondation de recherche de Sciences de la vie (2014-2017).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
CONSUMABLES AND REAGENTS
Vectashield mounting mediumVector ProductsH-1000Antifade mounting medium
Vectashield mounting medium (with DAPI)Vector ProductsH-1200Antifade mounting medium with DAPI
ForcepsTed Pella#505 (110mm, #5)Dumont tweezer biology grade, stainless steel
Hanging Drop SlidesFisher Scientific12-565BGlass slides
Hoechst 33342Molecular ProbesH1399DNA stain
Mitotracker Red CMXRos Molecular ProbesM-7512Mitochondria stain
Cleaved caspase-3 (Asp175) antibodyCell Signaling Technology#9661Stain for active fragment of caspase-3
Bovine Serum Albumin (BAS)Sigma-AldrichA8806Blocking agent for immunostaining
Phosphate Buffered Saline VWR114-056-101Medium for washing and immunostaining
Triton™ X-100Sigma-AldrichT8787Detergent for cell permeabilization
NameCompanyCatalog NumberComments
EQUIPMENT
LSM780 confocal microscopeCarl ZeissN/AImaging
Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000 Carl ZeissN/ADrosophila dissection
AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150WAmScopeWBM99316 Light source

Références

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