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  • Discusión
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  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

mutagénesis gen de la orientación es ahora posible en una amplia gama de organismos utilizando técnicas de edición genoma. Aquí, demostramos un protocolo para la mutagénesis dirigida de genes usando activador de la transcripción como nucleasas efectoras (Talens) en Astyanax mexicanus, una especie de peces que incluye a los peces de superficie y cavefish.

Resumen

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs. Towards this end, much recent work has focused on identifying candidate genes for the evolution of traits in a variety of species. However, until recently it has been challenging to functionally validate interesting candidate genes. Recently developed tools for genetic engineering make it possible to manipulate specific genes in a wide range of organisms. Application of this technology in evolutionarily relevant organisms will allow for unprecedented insight into the role of candidate genes in evolution. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) is a species of fish with both surface-dwelling and cave-dwelling forms. Multiple independent lines of cave-dwelling forms have evolved from ancestral surface fish, which are interfertile with one another and with surface fish, allowing elucidation of the genetic basis of cave traits. A. mexicanus has been used for a number of evolutionary studies, including linkage analysis to identify candidate genes responsible for a number of traits. Thus, A. mexicanus is an ideal system for the application of genome editing to test the role of candidate genes. Here we report a method for using transcription activator-like effector nucleases (TALENs) to mutate genes in surface A. mexicanus. Genome editing using TALENs in A. mexicanus has been utilized to generate mutations in pigmentation genes. This technique can also be utilized to evaluate the role of candidate genes for a number of other traits that have evolved in cave forms of A. mexicanus.

Introducción

La comprensión de la base genética de la evolución rasgo es un objetivo de investigación crítica de los biólogos evolutivos. Se ha logrado un progreso considerable en la identificación de loci que subyacen a la evolución de los rasgos y la localización de genes candidatos dentro de estos loci (por ejemplo 1-3). Sin embargo, las pruebas funcionalmente el papel de estos genes se ha mantenido desafiante como muchos organismos utilizados para el estudio de la evolución de los rasgos no son actualmente manejable de forma genética. El advenimiento de las tecnologías de edición genoma ha aumentado considerablemente manipulabilidad genética de una amplia gama de organismos. Nucleasas de transcripción activador de efectoras (Talens) y agrupados espaciadas regularmente repeticiones palindrómicas cortas (CRISPRs) se han utilizado para generar mutaciones específicas en los genes en un número de organismos (por ejemplo 4-11). Estas herramientas, aplicado en un sistema evolutivamente relevante, tienen el potencial de revolucionar la forma en que los biólogos evolutivos estudiar la base genética de la evolución.

Astyanax mexicanus es una especie de pez que existe en dos formas: a. (Peces de superficie) que habitan en el río forma superficial y múltiples formas cavernícolas (cavefish) A. cavefish mexicanus evolucionó de ancestros de peces de superficie (revisado en 12). Las poblaciones de cavefish han desarrollado una serie de características, incluyendo la pérdida de los ojos, disminución o pérdida de la pigmentación, el número de papilas gustativas y neuromastos craneales, y los cambios de aumento en el comportamiento, tales como la pérdida de la conducta escolar, aumento de la agresividad, los cambios en la alimentación de la postura y la hiperfagia 13 -19. Cavefish y pescado superficie son interfértiles, y los experimentos de mapeo genético se han realizado para identificar loci y genes candidatos para los rasgos de la cueva 1,20-26. Algunos genes candidatos han sido probados para un papel funcional en la contribución a los rasgos de la cueva en el cultivo celular 1,19, en organismos modelo de otras especies de 21 o 27 por la sobreexpresión o una caída transitoria ucantar morfolinos 28 en A. mexicanus. Sin embargo, cada uno de estos métodos tiene limitaciones. La capacidad de generar alelos mutantes de estos genes en A. mexicanus es crítica para la comprensión de su función en la evolución de cavefish. Por lo tanto, A. mexicanus es un organismo candidato ideal para la aplicación de las tecnologías de edición genoma.

Aquí describimos un método para la edición del genoma de A. mexicanus usando Talens. Este método se puede utilizar para evaluar mosaico inyectado peces fundador para fenotipos y para el aislamiento de líneas de pescado con mutaciones estables en los genes de interés 29.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales estaban en conformidad con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad Estatal de Iowa y la Universidad de Maryland.

1. Diseño TALEN

  1. De entrada deseada secuencia diana a un sitio web de diseño TALEN. (Por ejemplo: https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen ). Entrada elegido longitudes de matriz espaciador / repetición.
    1. Copiar la secuencia genómica en la casilla "Secuencia".
    2. Dentro de la pestaña "Usuario Proporciona espaciador / RVD Longitudes" seleccionar la longitud del espaciador y la longitud de la matriz.
      Nota: Las longitudes del espaciador de 15 pares de bases y repetir longitudes de matriz de 15-17 trabajo bien y hacer el montaje menos complejo.
  2. Seleccionar un par TALEN. pares TALEN diseñado alrededor de un sitio de enzima de restricción único permiten para el genotipado por digestión de enzima de restricciónun producto de PCR.
  3. Cebadores Diseño para amplificar la región genómica que rodea el sitio de destino TALEN el uso de un sitio web, como Primer3 30-32. Cuando genotipo con una enzima de restricción, cebadores de diseño para amplificar una región que contiene el sitio de enzima de restricción sólo una vez. Se recomienda que esta región se amplifica y se secuenció antes de la construcción para identificar cualquier TALEN polimorfismos presentes en el A. mexicanus población laboratorio para ser utilizado para la microinyección.

2. Asamblea TALEN (Modificado de Protocolo TALEN Kit) 33,34

Para detalles adicionales y solución de problemas, consulte el protocolo 34.

  1. Preparar y secuenciar los plásmidos necesarios del kit TALEN de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  2. Configurar el # 1 para las reacciones reacciones A y B. Incluir repetir variable diresidues (1-10) RVDS y la pFUS_A vector de destinación en la Reacción A. Incluir RVDS 11- (N-1) y THvector e destino pFUS_B (N-1) en la Reacción B, donde N es el número total de RVDS en la TALEN.
    1. Añadir a cada reacción: 1 l de cada plásmido que contiene cada RVD (100 ng / l), el vector de destino (100 ng / l), 1 l Bsa I enzima de restricción, 1 l albúmina de suero bovino (BSA) (2 mg / ml ), 1 l de ligasa, 2 l de tampón de ligasa 10X y x l de agua para un volumen total de 20 l. Por ejemplo, véase la Tabla 1.
      Nota: La mitad de reacciones también se pueden utilizar.
    2. Coloque reacciones en un termociclador y ejecute el ciclo: 10 veces (37 ° C / 5 min + 16 ° C / 10 min) + 50 ° C / 5 min + 80 ° C / 5 min.
  3. Se incuban las reacciones con nucleasa. Para cada reacción de añadir 1 l de ATP 25 mM y 1 l de nucleasa. Se incuban las reacciones a 37 ° C durante 1 hora.
  4. Transformar reacciones.
    1. Transformar 2,5 l de cada reacción en 25 l químicamente células competentes.
      Nota: Hecho en casa c competenteells se pueden utilizar. Sin embargo, las células con baja competencia puede dar lugar a la falta de colonias.
      1. Mezclar 2,5 l de la reacción con 25 l de células químicamente competentes. Incubar en hielo durante cinco min. Se incuban las células durante 30 segundos a 42 ° C.
      2. Colocar los tubos en hielo durante 2 min. Añadir 125 l de caldo de Super óptima con la represión catabólica (SOC). Agitar los tubos a 37 ° C durante 1 hora.
    2. Plate 100 l de las células transformadas en placas LB con espectinomicina (50 g / ml), X-gal e isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG). Crecer O / N a 37 ° C.
  5. Escoja 2-3 colonias blancas para cada reacción y comprobar mediante PCR de colonias usando cebadores pCR8_F1 y pCR8_R1 (Tabla 2).
    1. Hacer una mezcla maestra de los reactivos. Por ejemplo, véase la Tabla 3.
    2. Escoja una colonia y untarlo en el fondo de un tubo de PCR, y luego poner los restos de la colonia en 2 ml de LB con espectinomicina(50 mg / ml). Colocar 15 l de la mezcla maestra en el tubo con la colonia.
    3. Ejecute el siguiente programa de PCR (Tabla 4)
    4. Compruebe el PCR (ejecutar todo el volumen) en un gel de agarosa al 1,5% mediante electroforesis. Los clones correctos tendrán una banda en el tamaño esperado, así como una mancha y una escalera de bandas. Para un ejemplo de la mancha apropiada, consulte 34,33.
    5. Grow 2 ml de cultivos de los clones correctos en medio LB O / N a 37 ° C en una incubadora con agitación.
  6. Miniprep los plásmidos de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  7. Secuencia de verificación de secuencia TALEN con pCR8_F1 y pCR8_R1. Siga los procedimientos descritos anteriormente 35.
  8. El uso de los clones correctos verificadas por secuenciación, configurar la reacción # 2 (kit TALEN), que situará a los RVDS de los vectores A y B y el final de RVD en el vector de destino.
    1. Preparar la mezcla de reacción 2 (Tabla 5).
      Nota: Jareacciones LF pueden ser utilizados.
    2. Colocar las reacciones en un termociclador y ejecute el siguiente programa: 37 ° C / 10 min + 16 ° C / 15 min + 37 ° C / 15 min + 80 ° C / 5 min.
  9. Transformar reacciones.
    1. Transformar 2,5 l de cada reacción en 25 l químicamente células competentes.
      1. Mezclar 2,5 l de la reacción con 25 l de células químicamente competentes. Incubar en hielo durante 5 min. Choque térmico de las células durante 30 segundos a 42 ° C.
      2. Colocar los tubos en hielo. Añadir 125 l de SOC. Colocar los tubos en una incubadora de agitación a 37 ° C durante 1 hr.
    2. Plate 100 l de las células transformadas en placas LB con ampicilina (100 mg / ml), X-gal e IPTG. Crecer O / N a 37 ° C.
  10. Escoja 1-3 colonias blancas para cada reacción y comprobar mediante PCR de colonias usando cebadores TAL_F1 y TAL_R2 (Tabla 2).
    1. Hacer una solución de la polimerasa de Mastermix, agua y cebadores tal como sese describe en la Tabla 3. Escoja una colonia y untarlo en el fondo de un tubo de PCR, y luego poner los restos de la colonia en 2 ml de LB con ampicilina (100 mg / ml). Colocar 15 l de la solución en el tubo con la colonia.
    2. Ejecutar el programa de PCR (Tabla 6).
    3. Compruebe la PCR en un gel de agarosa al 1,5% mediante electroforesis. Los clones correctos tendrán un emborronamiento y una escalera de bandas. Para un ejemplo de la mancha apropiada, consulte 34,33.
    4. Grow 2 ml de cultivos de los clones correctos en medio LB O / N a 37 ° C en una incubadora con agitación.
  11. Miniprep los plásmidos de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  12. Secuencia de verificación de secuencia TALEN con TAL_F1 y TAL_R2 siguiendo los métodos descritos anteriormente 35.

3. La transcripción de ARNm Talens

  1. Digerir 4 g de plantilla de secuencia verificada con 2 l Sac I durante 2 horas a 37 ° C.
  2. Ejecutar 2 l de plásmido digerido con Sac en un gel de agarosa al 1,5% mediante electroforesis. Los plásmidos que se digieren correctamente se mostrará una sola banda.
  3. Se purifica el plásmido digerido con Sac restante siguiendo el protocolo de kit de purificación de PCR. Lavar dos veces con la solución de lavado antes de la elución. Eluir en 30 l de agua libre de nucleasa.
  4. Siga el protocolo estándar para la producción de T3 mRNA.
    1. Configurar medias reacciones utilizando 0,5 g de plantilla linealizado (preparado anteriormente). Incubar a 37 ° C durante 2 hr.
    2. Añadir 0,5 l de DNasa (incluido en el kit) y se incuba a 37 ° C durante 15 minutos.
  5. Se purifica el mRNA, siguiendo las instrucciones del fabricante. Eluir en 30 l de agua libre de nucleasa.
  6. Ejecutar un gel de agarosa al 1,5% mediante electroforesis para comprobar el mRNA.
    1. Limpiar el aparato de gel con un producto para eliminar la contaminación de ARNasa y preparar un gel de 1,2%.
    2. Mezcla 1 mRNA l + 4 y# 181; l de agua + 5 l de tinte de carga glioxilo libre de nucleasa. Incubar las muestras a 50 ° C durante 30 min. Centrifugar los tubos brevemente y colocar en hielo antes de ejecutar el gel.
  7. Comprobar la concentración utilizando un método de cuantificación de las concentraciones de ácidos nucleicos y almacenar el RNA en alícuotas a -80 ° C. Elija un tamaño de alícuota de tal manera que el ARN no está congelado / descongelado más de una vez.
    Nota: Las concentraciones de 500-1000 ng / nl se obtienen típicamente. ARN con una concentración más baja se puede utilizar como el tiempo que se mantiene la integridad del ARN (tal como se evaluó por una banda en lugar de una mancha en el gel).

4. Inyectar Astyanax mexicanus Los embriones con TALEN ARNm

  1. Preparar Herramientas para inyección.
    1. Verter en las placas de inyección mediante el vertido de 1,2% de agarosa en agua de pescado (agua acondicionada con bicarbonato de sodio y sal de mar a pH 7,4 y la conductividad de 700 mS) en una placa de Petri. Colocar un molde (pieza de plástico con las proyecciones de hacer pozos para peceshuevos) en el interior del plato. Retire el molde cuando la agarosa se ha endurecido y se almacena a 4 ° C. Para más detalles sobre el molde ver 36.
    2. Tire de agujas para inyección utilizando un extractor de aguja de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
      Nota: longitud de la aguja apropiada es importante para inyecciones. Agujas que son demasiado largos serán demasiado flexible para inyecciones. El protocolo para agujas de tracción variará con el equipo utilizado para tirar de las agujas. Un ejemplo de una aguja apropiada se muestra en la Figura 1. Para nuestro equipo, que tire las agujas que son de 5-6 cm de longitud, y tienen un diámetro exterior en la punta de aproximadamente 0,011 mm cuando se rompen. Sin embargo, las agujas deben ser calibrados (paso 4.3.4) para determinar el ancho de la abertura. Un programa de ejemplo para tirar de las agujas se puede encontrar en la Tabla 7.
    3. Preparar pipetas de vidrio para la transferencia de embriones rompiendo la pipeta de modo que la abertura sea suficientemente grande para un huevo pase a través. Flamear el extremo roto hastaya no es agudo.
      Nota: Es importante utilizar pipetas de vidrio y recipientes de vidrio cuando se trabaja con A. huevos mexicanus y embriones, ya que son pegajosos y se adhieren al plástico.
  2. Recoge 1 de células Etapa huevos.
    1. Raza A. mexicanus siguiendo protocolos estándar 37.
      Nota: Por ejemplo, si los peces se mantienen en un 14 ciclo de luz: oscuridad 10 y usando el tiempo Zeitgerber (ZT) con Zt0 como luces encendidas y ZT14 como las luces apagadas, nuestra peces desovan superficie entre ZT15 y ZT19. la época de reproducción exacta debe determinarse para cada laboratorio individual.
    2. Inducir el desove de los peces sobrealimentación durante 3-4 días antes del apareamiento y la colocación de los peces en agua dulce. Elevar la temperatura de 2 ° C. Nota: Nuestro temperatura inicial del agua es de aproximadamente 74 ° C.
    3. Recoger los huevos de peces de la superficie en la oscuridad, comprobando cada 15 min para obtener huevos en la etapa de 1 célula. Cientos de huevos se pueden obtener de un único par de peces superficie.
    4. Recogerhuevos en recipientes de vidrio para evitar que se pegue a las superficies de plástico y de tipo para aislar embriones en la etapa de 1 célula antes de la inyección mediante la observación de los huevos bajo el microscopio y la recogida de los huevos que son una sola célula. Mantenga los huevos en agua dulce del sistema (agua del tanque en el que se alojan los peces adultos, que ha sido tratado para el pH y la conductividad).
  3. Inyectar TALEN mRNA.
    1. Inyectar diferentes cantidades de mRNA total (cantidades iguales de cada TALEN en el par) para determinar la concentración óptima para la inyección como la toxicidad y la eficacia varían por TALEN par. Para empezar, la inyección de concentraciones de ARNm totales que son 400-800 pg. Diluir y combinar mRNA a concentraciones deseadas para la inyección de 1,5 nl.
    2. Cargar diluyó ARNm en la parte posterior de la aguja y colocar la aguja a un micro-inyector.
    3. Romper la aguja con unas pinzas.
    4. Calibrar la aguja. Por ejemplo, expulse 10 veces y recoger el consiguiente descenso de un capilar micro. Por 10 x 100 1.0 desechable81; l, 32 mm micro capilar, la caída debe llenar el micro capilar de 0,5 mm para la inyección de 1,5 nl / 1. Ajustar el tiempo de inyección y la presión según sea necesario.
    5. Insertar la aguja en la celda única e inyectar el ARNm. Inyectar el mRNA directamente en la célula, no en la yema.
    6. Recoger los embriones inyectados en recipientes de vidrio. Mantener embriones a 23-25 ​​° C. Retire los embriones muertos (que se convierten en embriones nublado y de forma irregular) regularmente durante los primeros días después de la inyección. Un número récord de embriones muertos y deformes de control (no inyectada) y las placas inyectadas.
      Nota: El aumento de la concentración de ARNm puede conducir a un aumento de la toxicidad y la deformidad / muerte de los embriones. Por lo tanto, la toxicidad frente a la eficiencia debe ser equilibrado para determinar la mejor concentración de ARNm para inyectar.

5. El fenotipo de los pescados Fundador y evaluar la eficiencia TALEN

  1. Sacrificar embriones de animales según el protocolo institucional.
    Nota: Se practicar la eutanasiaembriones se refrigera rápidamente en hielo.
  2. Recoger los embriones en 0,8 l de PCR tiras de tubos utilizando una pipeta de transferencia.
    Nota: El genotipado puede realizarse en embriones o piscinas de embriones individuales.
  3. Extraer el ADN.
    1. Coloque los embriones en 100 l de hidróxido de sodio 50 mM (NaOH) y se incuba a 95 ° C durante 30 min, después se enfría a 4 ° C.
    2. Añadir 1/10 volumen (10 l) de 1 M Tris-HCl pH 8.
  4. Realizar una PCR en la región utilizando los cebadores diseñados en el paso 1.3 (véase las Tablas 8 y 9 para los protocolos de muestra). Para los embriones individuales 1 l de ADN es suficiente para la reacción de PCR.
  5. Se digiere el producto de PCR resultante con la enzima de restricción apropiada y correr un gel de agarosa al 1,5% mediante electroforesis.
    1. Por ejemplo, para la genotipificación del locus albinismo oculocutáneo 2 (OCA2) en embriones inyectados digerir el producto de PCR usando la enzima de restricción Bsr I mediante la adición de 0.5 L de Bsr I directamente a 12,5 l de la reacción de PCR completado, incubando a 65 ° C durante 2 horas. Ejecutar el no digerido y el producto digerido en un gel. Bandas resistentes de enzimas de restricción (es decir, bandas que no digieren) indican que las mutaciones inducidas por TALEN están presentes (Figura 2).
  6. (Opcional) Calcular la tasa de mutación porcentaje determinando el porcentaje de producto sin cortar mediante el análisis de imágenes de los geles en Fiji 38 utilizando la herramienta de análisis de gel para calcular el valor de intensidad de cada banda como se ha descrito previamente 29.
  7. Determinar la secuencia de los alelos mutantes por clonación TA la banda mutante resistente se purificó en gel de enzima de restricción y secuenciación de clones.
    1. Gel purificar la enzima de restricción banda mutante resistente siguiendo las instrucciones del fabricante. TA clonar la banda siguiendo las instrucciones del fabricante. Recoger colonias y crecer en 1,5 ml de LB O / N a 37 ° C en un zarandeoincubadora.
    2. culturas Miniprep siguientes instrucciones del fabricante. Enviar el ADN para la secuenciación.
    3. El uso de un programa como el mono, alinear las secuencias mutantes de la secuencia de tipo salvaje.
      1. Copiar y pegar las dos secuencias en archivos APE. Elija la herramienta "alinear dos secuencias" en el menú "Herramientas".
      2. Especificar las dos secuencias de ADN utilizando los menús desplegables.
        Nota: puede ser necesario utilizar dependiendo de la dirección de la PCR entró en el vector de clonación el complemento inverso de la secuencia clonada. Si las secuencias no se alinean, repita los pasos marcando la casilla "Rev-Com" en el cuadro "ADN Align".
  8. Evaluar los peces fundador de fenotipos en la etapa adecuada y mediante métodos apropiados para el fenotipo esperado 29 (Por ejemplo, la Figura 3). Los métodos de fenotipificación se basarán en el fenotipo esperado para el gen diana por el investigador usando el protocol.

6. Pantalla de transmisión de la línea germinal

Nota: A. mexicanus alcanzar la madurez sexual a los 4-8 meses.

  1. Cruzar los peces sexualmente maduros fundador de peces de tipo salvaje.
  2. Embriones de pantalla o peces adultos usando métodos en los pasos 5.1-5.7 (Figura 4). Para peces adultos, un trozo de la cola se puede enganchar tras la anestesia.
    1. Anestesiar pescado sumergiendo pescado en una solución de tricaína (éster etílico del ácido 3-aminobenzoico) para reducir la tensión durante el recorte de la aleta. Tras corte de una aleta, permiten que los peces se recuperen en agua dulce. Los peces se recuperan con rapidez; observar hasta que se recuperen (normalmente son la natación).

Resultados

TALEN par inyecciones dan como resultado la unión de los RVDS a los nucleótidos de ADN específicas y por lo tanto la dimerización de los dominios de FokI, dando lugar a roturas de doble cadena 39 que pueden ser reparados a través de extremos no homólogos (NHEJ). NHEJ menudo introduce errores que resultan en inserciones o deleciones (indeles). Indeles pueden ser identificados mediante la amplificación de la región que rodea el sitio de destino TALEN y digerir e...

Discusión

Grandes avances se han hecho en los últimos años hacia la comprensión de la base genética de la evolución de los rasgos. Aunque se han identificado los genes candidatos que subyacen a la evolución de una serie de rasgos, se ha mantenido un reto para poner a prueba estos genes in vivo debido a la falta de maleabilidad genética de las especies evolutivamente más interesantes. Aquí mostramos un método para la edición del genoma de A. mexicanus, una especie usada para estudiar la evolución de l...

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por el Departamento de Genética, Desarrollo y Biología Celular y la Universidad Estatal de Iowa y por el NIH subvención EY024941 (WJ) .dr. Jeffrey Essner proporcionó comentarios sobre el manuscrito.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
Thermocycler
Injection station
Gel apparatus
Needle puller
Nanodrop
NameCompanyCatalog NumberComments
Supplies
Note: As far as we know, supplies from different companies can be used unless otherwise indicated
Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit 2.0AddgeneKit #1000000024
Fisher BioReagents LB Agar, Miller (Granulated)FisherBP9724-500
Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, MillerFisherBP1426-500
Teknova TET-15 in 50% EtOHTeknova (ordered through Fisher)50-843-314
Spectinomycin Dihydrochloride, Fisher BioReagentsFisherBP2957-1
Super Ampicillin (1,000x solution)DNA Technologies6060-1
ThermoScientific X-Gal Solution, ready-to-useThermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher)FERR0941
IPTG, Fisher BioReagentsFisherBP1620-1
Petri dishesFisher08-757-13
BsaINew England Biolabs (ordered through Fisher)50-812-203Use BsaI, not BsaI-HF (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol)
BSANew England Biolabsprovided with restriction enzymes
10x T4 ligase bufferPromega (ordered through Fisher)PR-C1263
GoTaq Green Master mixPromega (ordered through Fisher)PRM7123Other Taq can be used, but the reaction should be adjusted accordingly
Quick ligation kitNew England Biolabs (ordered through Fisher)50-811-728We use Quick Ligase for all TALEN assembly reactions
One Shot TOP10 Chemically Competent E.coliInvitrogenC4040-06Other chemically competent cells or homemade competent cells can be used
Esp 3IThermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher)FERER0451
Plasmid-Safe ATP-dependent DNaseEpicentre (Ordered through Fisher)NC9046399
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106The Qiagen kit should be used for the initial plasmid preparation (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol)
QIAquick PCR Purification KitQiagen28104
GeneMate LE Quick Dissolve AgaraoseBioExpressE-3119-125
Sac IPromega (Ordered through Fisher)PR-R6061
mMESSAGE mMACHINE T3 Transcription kitAmbionAM1348M
Rneasy MinElute Cleanup KitQiagen74204
NorthernMax-Gly Sample Loading Dye Ambion (ordered through Fisher)AM8551
EliminaseDecon (ordered through Fisher)04-355-32
Fisherbrand Disposable Soda-Lime Glass Pasteur PipetsFisher13-678-6B
Standard Glass CapillariesWorld Precision Instruments1B100-4
MicrocapsDrummond Scientific Company1-000-0010
Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet MicroinjectorEppendorf (ordered through Fisher)E5242956003
Sodium hydroxideFisherS318-500
Tris baseFisherBP152-1

Referencias

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