JoVE Logo
Autores
Contáctenos

Iniciar sesión

Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

En este artículo

  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Las células que crecen en un entorno tridimensional (3-D) representan una mejora marcada sobre el cultivo de células en entornos 2-D (por ejemplo, frascos o platos). Aquí se describe el desarrollo de un modelo organotípico 3-D multicelular de la mucosa intestinal humana cultivadas en microgravedad proporcionada por la rotación de la pared de los vasos biorreactores (RWV).

Resumen

Dado que las células que crecen en un entorno tridimensional (3-D) tienen el potencial de salvar muchas lagunas de cultivo celular en ambientes 2-D (por ejemplo., Frascos o platos). De hecho, se reconoce ampliamente que las células cultivadas en frascos o platos tienden a DE-diferenciarse y perder características especializadas de los tejidos de los que se derivaron. Actualmente, existen principalmente dos tipos de sistemas de cultivo de 3-D, donde las células se sembraron en andamios que imitan la matriz nativa extracelular (ECM): (a) modelos estáticos y modelos (b) utilizando biorreactores. El primer gran avance fueron los modelos estáticos en 3-D. modelos en 3-D utilizando biorreactores como la pared de los vasos giratorio (RWV) biorreactores son un desarrollo más reciente. El concepto original de los biorreactores RWV fue desarrollado en el Centro Espacial Johnson de la NASA en la década de 1990 y se cree que superar las limitaciones de los modelos estáticos, tales como el desarrollo de hipoxia, núcleos necróticos. Los biorreactores RWV podrían eludir THes problema proporcionando la dinámica de fluidos que permiten la difusión eficiente de los nutrientes y el oxígeno. Estos biorreactores constan de una base rotador que sirve para soportar y rotar dos formatos diferentes de recipientes de cultivo que se diferencian por su tipo de fuente de aireación: (1) Slow giro Los buques laterales (STLVs) con un oxigenador de co-axial en el centro, o (2 ) Los buques de alta Relación de aspecto (HARVs) con la oxigenación a través de una membrana de transferencia de gas de caucho de silicona plana. Estos recipientes permiten la transferencia de gas eficiente, evitando la formación de burbujas y la consiguiente turbulencia. Estas condiciones resultan en el flujo laminar y la fuerza de corte mínima que los modelos de gravedad reducida (microgravedad) en el interior del recipiente de cultivo. Aquí se describe el desarrollo de un modelo organotípico 3-D multicelular de la mucosa intestinal humana compuesta de una línea de células epiteliales intestinal y linfocitos humanos primarios, células endoteliales y fibroblastos cultivadas en microgravedad proporcionada por el biorreactor RWV. </ P>

Introducción

El primer gran avance en la construcción de un modelo 3-D se informó a principios de la década de 1980 cuando los científicos empezaron a investigar los diferentes tipos de andamio (por ejemplo., Laminina, colágeno tipo I, colágeno IV y fibronectina) y cócteles de factores de crecimiento para mejorar célula a célula y ECM interacciones de modelos en 3-D "estáticos" 1-7. Desde entonces, el principal problema de estos modelos ha sido limitaciones en la transferencia de nutrientes y oxígeno dentro de las construcciones medianas y tejidos 8. En contraste con las células en el entorno in vivo que recibe un flujo constante de nutrientes y el oxígeno de los alrededores de las redes de los vasos sanguíneos, la naturaleza estática de estos modelos dificulta la distribución efectiva de ellos a las células. Por ejemplo, los agregados de células generadas en modelos estáticos in vitro que superan unos pocos milímetros de tamaño invariablemente desarrollar hipoxia, 9 núcleos necróticos. Los biorreactores RWV podrían eludir este problemaproporcionando la dinámica de fluidos que permiten la difusión eficiente de los nutrientes y 10-12 oxígeno. Sin embargo, hasta la fecha, el trabajo usando biorreactores RWV se han limitado a la inclusión de uno o dos tipos de células 13-17. Además, en lugar de una orientación espacial similar a tejidos nativos, las células forman agregados celulares. La razón principal de estas limitaciones ha sido la falta de un andamio capaz de incorporar las células de una manera integrada. Los andamios utilizados en los biorreactores RWV hasta la fecha consisten, con pocas excepciones, 16-18, sobre todo de microperlas sintéticas, cilindros tubulares o pequeñas hojas 13-15,19-23. Estos son materiales rígidos cuya composición y de flexibilidad no puede ser manipulado, y para el cual las células están unidas a su superficie. Por lo tanto, es poco probable que estos modelos proporcionar un sistema en el que evaluar, de una manera integrada, los diversos componentes celulares tales como las células del estroma (por ejemplo., Fibroblastos, células inmunes y endoteliales) que should dispersarse dentro del andamiaje para imitar el tejido humano.

Aquí se describe el desarrollo de un modelo organotípico 3-D multicelular de la mucosa intestinal humana compuesta de una línea de células epiteliales intestinal y linfocitos humanos primarios, células endoteliales, fibroblastos y 24. Estas células se cultivaron en condiciones de microgravedad proporcionar por el biorreactor RWV 13,25-30. En nuestro modelo de 3-D, el ECM posee muchas propiedades distintas, tales como una osmolalidad similar al medio de cultivo (por ejemplo., Las restricciones de difusión despreciables durante el cultivo) y la capacidad de incorporar las células y otras proteínas de la matriz extracelular pertinentes, así como la rigidez apropiado para ser utilizado en los biorreactores de 24. Los sistemas biológicos son muy complejas, y en los últimos años, ha habido un cambio en el foco de la investigación de la mucosa hacia el examen de las interacciones de las células con su entorno en lugar de estudiar en isolationorte. En particular, la importancia de las interacciones célula-célula para influir en la supervivencia celular y la diferenciación intestinal está bien documentada 31-34. En concreto, la comunicación entre las células epiteliales y su nicho tiene una profunda influencia en la expansión de las células epiteliales y la diferenciación 35. De hecho, es ampliamente aceptado que no sólo de célula a célula, pero también las interacciones célula-ECM son críticos para el mantenimiento y la diferenciación de las células epiteliales en modelos de cultivo de 3-D. Estudios previos han demostrado que las proteínas ECM intestino tales como el colágeno I 24,36,37, laminina y fibronectina 38 39 son instrumentales para influir en las células epiteliales intestinales para adquirir la orientación espacial similar a la mucosa nativo. Por lo tanto, el desarrollo de nuevas tecnologías, como nuestro modelo en 3-D 24, que puede imitar es necesaria la diversidad fenotípica del intestino si los investigadores tienen la intención de recrear la arquitectura celular y estructural complejay la función del microambiente intestino. Estos modelos representan una herramienta importante en el desarrollo y evaluación de nuevos fármacos orales y candidatos vacunales.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

Declaración de la ética: Todas las muestras de sangre se obtuvieron de voluntarios que participaron en número de protocolo HP-00040025-1. La Universidad de Maryland Junta de Revisión Institucional aprobado este protocolo y autoriza la recogida de muestras de sangre de voluntarios sanos para los estudios incluidos en este manuscrito. El propósito de este estudio fue explicado a los voluntarios, y todos los voluntarios dieron su, firmado el consentimiento antes de la extracción de sangre.

Nota: Véase la Tabla 1 para la preparación suplemento de medio. Véase la Tabla 2 para la preparación de los medios de cultivo 3-D.

1. Preparación de recipientes de cultivo

  1. Desenroscar el tapón del orificio de llenado del recipiente de 50 ml-y rellenar con 50 ml de medio de cultivo estéril (por ejemplo, RPMI.). Realizar todos los procedimientos en condiciones estériles en una campana laminar.
  2. Coloque la tapa y limpie cualquier medio derramado sobre cualquier superficie con etanol al 70%.
  3. Deje que la embarcación incubcomió durante al menos 15 minutos a O / N a temperatura ambiente.
  4. Utilice el puerto de llenado para desechar el medio de cultivo y añadir 30 ml de medio de cultivo en 3-D.
  5. Limpie cualquier medio derramado sobre cualquier superficie con etanol al 70%.

2. Preparación de las células

  1. Línea celular epitelial humana (HCT-8) de 24,40.
    1. células de cultivo en RPMI suplementado con 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 50 mg / ml de gentamicina, 2 mM L-glutamina, piruvato de sodio 1 mM, HEPES 10 mM tampón y suero bovino fetal inactivado por calor al 10% (FBS ) (suplemento 1). Al 70% de confluencia, las células divididas en una proporción de 1: 5.
  2. Fibroblastos de colon humano (células CCD-18Co) 24,41.
    1. Células de cultivo en medio de Basal de Eagle enriquecido con suplemento 1 en confluencia, las células divididas en una proporción de 1: 3..
  3. Células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) 24,42.
    1. Células de cultivo en medio basal endotelial (EBM) medio enriquecido con 100 mg / ml de heparina, 3 mg / ml de suplemento de crecimiento de células endoteliales (ECG), y complementan 1 Al 70% de confluencia, las células divididas en una proporción de 1:. 2.
  4. Los linfocitos / monocitos
    1. Aislar las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de la sangre por centrifugación en gradiente de densidad utilizando técnicas estándar 43.
      1. Brevemente, utilizando una pipeta ml-10, añadir cuidadosamente 30 ml de sangre diluida (1: 1 de sangre: Tampón fosfato salino (PBS)) en un tubo de 50 ml que contiene-cónica 10 ml de medio de centrifugación por densidad. Después de la etapa de centrifugación, los linfocitos y monocitos residirán en la capa de "blanco" entre los medios de centrifugación de densidad y capas de plasma.
      2. Recoger la capa blanca con una pipeta de transferencia. Evitar la contaminación de granulocitos mediante la limitación de la colección de los medios de densidad de centrifugación. Después de lavar 43, uSE PBMC criopreservados como está o en N2 líquido.
        Nota: Es importante destacar que PBMC consiste en gran parte de los linfocitos y monocitos, con una pequeña proporción de las células dendríticas y otros tipos celulares.
  5. Crecer todas las células bajo condiciones de cultivo estándar a 37 ° C en una atmósfera de CO2 al 5%.

3. Preparación de las células embebidas-colágeno

  1. Determinar el número de inserciones necesario en base a los números de las condiciones experimentales para ser puesta en marcha. Coloque el número apropiado de insertos en los pocillos de una placa de 6 pocillos.
  2. Preparar una suspensión de HUVEC y fibroblastos:
    1. Lavar los matraces dos veces en PBS y separar las células utilizando tripsina, 0,25% (1x) con etilendiaminotetraacetato 0,05% de tripsina-tetrasódico (Tripsina-EDTA). Añadir suficiente solución de tripsina para cubrir la totalidad de la superficie de cultivo celular. El desprendimiento ocurre generalmente dentro de 5 a 15 min
    2. Recogercélulas separadas en un 50 ml-tubo que contiene 30 ml de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) -30% de SFB medio.
    3. Centrifugar el tubo a 500 xg durante 10 min.
    4. Resuspender las células en 30 ml de DMEM-30 medio FBS%.
    5. Contar el número total de células viables por dilución de 20 l de las células resuspendidas con 20 l de colorante azul de tripano. Cargar el hemocitómetro con la mezcla de células. CMSP viables serán de color blanco claro; inviable PBMC adquirirá el colorante y se convierten en azul.
      1. Resuspender cada tipo de células en DMEM-30 medio FBS% a una concentración de 5 - 8 x 10 7 células ml - 1.
  3. Preparar geles de colágeno que contienen células
    Nota: Cada recipiente requerirá la preparación de ~ 5 ml de gel de colágeno que contiene células.
    1. En un tubo de 50 ml-cónica preparar la mezcla de colágeno mediante la adición de 1 x medios DMEM, suplementado con 50 g / ml de gentamicina, 2 mM L-glutamina y 10% de calor-inactivated FBS más 3 mg / ml de colágeno bovino-I, 10 g / laminina ml, 40 mg / ml de colágeno IV, 10 mg / ml de fibronectina, 2 mg / ml de proteoglicanos de sulfato de heparina y NaOH 15 mM (para alcanzar el pH fisiológico).
    2. Cerrar el tubo y mezclar invirtiendo varias veces hasta que la mezcla esté completamente homogeneizada. Evitar la formación de burbujas.
      IMPORTANTE: Mantener la mezcla en hielo para evitar la gelificación.
      1. Paso crítico: Si la mezcla se desarrolla una apariencia ácida (color amarillento), añadir unas gotas de NaOH 1 N estéril para neutralizar la mezcla.
    3. Añadir HUVEC concentrado y fibroblastos a una densidad de 1,0 - 1,2 y 1,5 - 2,0 x 10 6 células / ml, respectivamente, a la mezcla enriquecida en colágeno (descrito anteriormente). Cierre los tubos y mezclar invirtiendo varias veces hasta que la mezcla esté completamente homogeneizada. Evitar la formación de burbujas. IMPORTANTE: Mantener la mezcla en hielo para evitar la gelificación.
    4. Añadir 4 - 5 ml del colágeno que contiene célulasgel para cada inserción, cargado previamente en un pozo de la placa 6, y se deja gelificar en la campana con poco o ningún movimiento durante 1 hora.
    5. Después de 1 hora, la transferencia de la placa de 6 pocillos a un 37 ° C, 5% CO2 durante 1 - 2 horas adicionales.
    6. Devolver la placa de 6 pocillos a la campana, y con la ayuda de unas pinzas esterilizadas y el bisturí asépticamente de corte de la membrana de la pieza de inserción de extraer el gel que contiene células de la membrana. Cortar el gel individual en cuadrados pequeños (~ 5 x 5 mm).
    7. Añadir los pequeños cuadrados que contienen células en un HARV de 50 ml usando el puerto de llenado.
  4. Preparar una suspensión de 8-HCT células epiteliales:
    1. Lavar los matraces dos veces en PBS y separar las células utilizando tripsina, 0,25% (1x) con el tratamiento con tripsina-EDTA. Añadir suficiente solución de tripsina para cubrir la totalidad de la superficie de cultivo celular. El desprendimiento ocurre generalmente dentro de 10 a 15 min.
    2. Recoger las células desprendidas en 30 ml de DMEM-FBS al 30% medio.
    3. CentrifUGE DMEM-30% de medio FBS que contiene tubo a 500 xg durante 10 min.
    4. Resuspender las células en 30 ml de DMEM-30 medio FBS%.
    5. Contar el número total de células viables como se describe en 3.2.5.
    6. Resuspender las HCT-8 células epiteliales en DMEM-30 medio FBS% a una concentración de 10 7 células ml - 1.
    7. Añadir 1 ml de los HCT-8 células epiteliales concentradas en el 50-ml HARV usando el puerto de llenado.
  5. Al utilizar el puerto de llenado, se añade medio de cultivo adicional 3-D hasta que el recipiente está casi llena (~ 20 ml).
  6. Coloque la tapa y limpiar el borde del orificio de llenado con un 70% de etanol.
  7. Colocar una jeringa en cada puerto de jeringa de la RWV: lugar un 5 ml-jeringa que contiene 3 - 4 ml de medio de cultivo 3-D en un puerto y una jeringa de 5 ml vacía en el otro puerto.
  8. Eliminar las burbujas visibles, tirando en la jeringa vacía mientras que aproximadamente el mismo volumen de medio se inyecta a través del otro puerto de jeringa.
  9. Coloque los vesseles en el biorreactor, conecte la alimentación y ajuste la velocidad de alrededor de 13 a 14 revoluciones por minuto.
    Nota: El paso crítico: puede necesitar velocidad de rotación para ajustar un par de veces durante un experimento para mantener las células en órbita dentro del recipiente, evitando así el contacto con las paredes del recipiente.
  10. Células de cultivo a 37 ° C, 5% de CO 2 en condiciones de microgravedad, proporcionados por el biorreactor RWV.
  11. Cambio medio de cultivo cada 3 - 4 días mediante la sustitución de aproximadamente 30 ml con medio de cultivo fresco 3-D.
  12. Después de 4 días (± 1 día), retire los buques del biorreactor y añadir linfocitos / monocitos a los vasos (2 x 10 7 / recipiente).
  13. Coloque los vasos de nuevo en el biorreactor a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 5 días adicionales (± 1 día).
  14. Después de los 5 días adicionales (día 9 del cultivo), añadir linfocitos / monocitos a los vasos (2 x 10 7 / recipiente) y seguir las culturas de hasta 12 días adicionales.
  15. Cambio medio de cultivo cada 3 - 4 días mediante la sustitución de aproximadamente 30 ml con medio de cultivo fresco 3-D.

4. Recolección de 3-D Los cultivos para Histología

  1. Con la ayuda de una pipeta de transferencia de la cosecha cada fragmento de gel pequeño, que ahora se llama "construir", en una placa de seis pocillos que contenía 10 ml de tampón de formalina 10%. Dejar durante 3 horas a temperatura ambiente o por 12 - 16 horas a 4 ° C.
  2. Preparar el procesamiento de tejidos y cassettes de inclusión mediante el etiquetado y la adición de dos piezas de almohadillas de espuma para biopsia en cada casete.
  3. Sumergir los casetes en tampón de formalina al 10%.
  4. Con la ayuda de fórceps colocar los constructos fijas entre las dos almohadillas de espuma.
  5. Sumergir los casetes en tampón de formalina al 10%.
  6. Continúe con los procedimientos estándar para la inserción, el seccionamiento y tinción 44.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Anteriormente hemos diseñado un modelo organotípico 3-D multicelular de la mucosa intestinal humana compuesta de una línea de células epiteliales intestinal y linfocitos humanos primarios, células endoteliales y fibroblastos cultivados en condiciones de microgravedad 24 (Figura 1). Los fibroblastos y las células endoteliales fueron incorporados en una matriz de colágeno I enriquecido con proteínas de la membrana basal intestino adicional 45<...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discusión

En este manuscrito, se describe el desarrollo de un modelo de bioingeniería de la mucosa intestinal humana compuesta de tipos de células incluyendo linfocitos múltiplos primarios humanos, fibroblastos y células endoteliales, así como líneas de células epiteliales intestinales 24. En este modelo 3-D, las células se cultivaron dentro de una matriz extracelular rica en colágeno en condiciones de microgravedad 24.

Como se ha descrito anteriormente, las característ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Divulgaciones

The authors declare that a US Non-Provisional Patent Application has been filed in the U.S.Patent and Trademark Office (Number: 13/360,539).

Agradecimientos

This work was supported, in part, by NIAID, NIH, DHHS federal research grants R01 AI036525 and U19 AI082655 (CCHI) to MBS and by NIH grant DK048373 to AF. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institute of Allergy And Infectious Diseases or the National Institutes of Health.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Quad Rotator/Independent Rotating Wall Vessel (RWV) bioreactor SyntheconRCCs-4DQFor up to 4 vessels. Models with more or less vessels are also available.
Disposable 50 ml-vesselSyntheconD-405Box with 4 vessels
HCT-8 epithelial cells ATCCCCL-244
CCD-18Co Fibroblasts ATCCCRL-1459
Human Umbilical Vein Endothelial CellsATCCCRL-1730HUVEC
Fibroblast Growth Factor-Basic SigmaF0291bFGF
Stem Cell Factor SigmaS7901SCF
Hepatocyte Growth Factor SigmaH1404HGF
Endothelin 3SigmaE9137
LamininSigmaL2020Isolated from mouse Engelbreth-Holm-Swarm tumor
Vascular Endothelial Growth Factor SigmaV7259VEGF
Leukemia Inhibitory Factor Santa Cruzsc-4377(LIF
AdenineSigmaA2786
InsulinSigmaI-6634
3,3',5-triiodo-L-thyronine SigmaT-6397T3
Cholera ToxinSigmaC-8052
FibronectinBD354008Isolated from human plasma
apo-TransferrinSigmaT-1147
HeparinSigmaH3149
Heparan sulfate  proteoglycanSigmaH4777Isolated from basement membrane of mouse  Engelbreth-Holm-Swarm tumor
Collagen IVSigmaC5533Isolated from human placenta
Heat-inactivated fetal bovine serum Invitrogen10437-028
D-MEM, powderInvitrogen12800-017
10% formalin–PBS Fisher ScientificSF100-4
Bovine type I collagen InvitrogenA1064401
Trypsin-EDTA Fisher ScientificMT25-052-CI
Sodium pyruvateInvitrogen11360-070
Gentamicin Invitrogen15750-060
Penicillin/streptomincin Invitrogen15140-122
L-GlutamineInvitrogen25030-081
HepesInvitrogen15630-080
Ham's F-12Invitrogen11765-054
Basal Medium EagleInvitrogen21010-046BME
RPMI-1640Invitrogen11875-093
Endothelial Basal MediumLonzaCC-3156EBM-2
Endothelial cell growth supplementMillipore02-102ECGS

Referencias

  1. Aumailley, M., Timpl, R. Attachment of cells to basement membrane collagen type IV. J Cell Biol. 103, 1569-1575 (1986).
  2. Buset, M., Winawer, S., Friedman, E. Defining conditions to promote the attachment of adult human colonic epithelial cells. In Vitro Cell Dev Biol. 23, 403-412 (1987).
  3. Fitzgerald, T. J., Repesh, L. A., Blanco, D. R., Miller, J. N. Attachment of Treponema pallidum to fibronectin, laminin, collagen IV, and collagen I, and blockage of attachment by immune rabbit IgG. Br J Vener Dis. 60, 357-363 (1984).
  4. Goetschy, J. F., Ulrich, G., Aunis, D., Ciesielski-Treska, J. Fibronectin and collagens modulate the proliferation and morphology of astroglial cells in culture. Int J Dev Neurosci. 5, 63-70 (1987).
  5. Paye, M., Lapiere, C. M. The lack of attachment of transformed embryonic lung epithelial cells to collagen I is corrected by fibronectin and FXIII. J Cell Sci. 86, 95-107 (1986).
  6. Pourreau-Schneider, N., et al. Estrogen response of MCF-7 cells grown on diverse substrates and in suspension culture: promotion of morphological heterogeneity, modulation of progestin receptor induction; cell-substrate interactions on collagen gels. J Steroid Biochem. 21, 763-771 (1984).
  7. Pratt, B. M., Harris, A. S., Morrow, J. S., Madri, J. A. Mechanisms of cytoskeletal regulation. Modulation of aortic endothelial cell spectrin by the extracellular matrix. Am J Pathol. 117, 349-354 (1984).
  8. Jessup, J. M., et al. Microgravity culture reduces apoptosis and increases the differentiation of a human colorectal carcinoma cell line. In vitro cellular & developmental biology - Animal. 36, 367-373 (2000).
  9. Sutherland, R. M., et al. Oxygenation and differentiation in multicellular spheroids of human colon carcinoma. Cancer Res. 46, 5320-5329 (1986).
  10. Unsworth, B. R., Lelkes, P. I. Growing tissues in microgravity. Nat Med. 4, 901-907 (1998).
  11. Zwezdaryk, K. J., Warner, J. A., Machado, H. L., Morris, C. A., Honerzu Bentrup, K. Rotating cell culture systems for human cell culture: human trophoblast cells as a model. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
  12. Radtke, A. L., Herbst-Kralovetz, M. M. Culturing and Applications of Rotating Wall Vessel Bioreactor Derived 3D Epithelial Cell Models. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
  13. Barrila, J., et al. Organotypic 3D cell culture models: using the rotating wall vessel to study host-pathogen interactions. Nat Rev Microbiol. 8, 791-801 (2010).
  14. Honer zu Bentrup, K., et al. Three-dimensional organotypic models of human colonic epithelium to study the early stages of enteric salmonellosis. Microbes and infection / Institut Pasteur. 8, 1813-1825 (2006).
  15. Nickerson, C. A., et al. Three-dimensional tissue assemblies: novel models for the study of Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenesis. Infect Immun. 69, 7106-7120 (2001).
  16. Alcantara Warren, C., et al. Detection of epithelial-cell injury, and quantification of infection, in the HCT-8 organoid model of cryptosporidiosis. J Infect Dis. 198, 143-149 (2008).
  17. Carvalho, H. M., Teel, L. D., Goping, G., O'Brien, A. D. A three-dimensional tissue culture model for the study of attach and efface lesion formation by enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli. Cell Microbiol. 7, 1771-1781 (2005).
  18. Lin, H. J., O'Shaughnessy, T. J., Kelly, J., Ma, W. Neural stem cell differentiation in a cell-collagen-bioreactor culture system. Brain Res. Dev Brain Res. 153, 163-173 (2004).
  19. He, L., et al. Increased proliferation and adhesion properties of human dental pulp stem cells in PLGA scaffolds via simulated microgravity. Intl Endo J. , (2015).
  20. Straub, T. M., et al. In vitro cell culture infectivity assay for human noroviruses. Emerg Infect Dis. 13, 396-403 (2007).
  21. Herbst-Kralovetz, M. M., et al. Lack of norovirus replication and histo-blood group antigen expression in 3-dimensional intestinal epithelial cells. Emerg Infect Dis. 19, 431-438 (2013).
  22. Goodwin, T. J., Schroeder, W. F., Wolf, D. A., Moyer, M. P. Rotating-wall vessel coculture of small intestine as a prelude to tissue modeling: aspects of simulated microgravity. Proc Soc Exp Biol Med. 202, 181-192 (1993).
  23. Goodwin, T. J., Jessup, J. M., Wolf, D. A. Morphologic differentiation of colon carcinoma cell lines HT-29 and HT-29KM in rotating-wall vessels. In Vitro Cell Dev Biol. 28, 47-60 (1992).
  24. Salerno-Goncalves, R., Fasano, A., Sztein, M. B. Engineering of a multicellular organotypic model of the human intestinal mucosa. Gastroenterology. 141, 18-20 (2011).
  25. Hammond, T. G., Hammond, J. M. Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel. Am J Physiol Renal Physiol. 281, 12-25 (2001).
  26. Cherry, R. S., Papoutsakis, E. T. Physical mechanisms of cell damage in microcarrier cell culture bioreactors. Biotech and Bioeng. 32, 1001-1014 (1988).
  27. Bergmann, S., Steinert, M. From Single Cells to Engineered and Explanted Tissues: New Perspectives in Bacterial Infection Biology. Int Rev Cell Mol Biol. 319, 1-44 (2015).
  28. Xu, B., et al. Simulated microgravity affects ciprofloxacin susceptibility and expression of acrAB-tolC genes in E. coli ATCC25922. Int J Clin Exp Pathol. 8, 7945-7952 (2015).
  29. Han, C., Jiang, C., Yu, C., Shen, H. Differentiation of transforming growth factor beta1-induced mesenchymal stem cells into nucleus pulposus-like cells under simulated microgravity conditions. Cell Mol Biol (Noisy-le-Grand, France). 61, 50-55 (2015).
  30. Wang, C., et al. Microgravity activates p38 MAPK-C/EBPbeta pathway to regulate the expression of arginase and inflammatory cytokines in macrophages. Inflamm Res. 64, 303-311 (2015).
  31. Iliev, I. D., et al. Human intestinal epithelial cells promote the differentiation of tolerogenic dendritic cells. Gut. 58, 1481-1489 (2009).
  32. Kerneis, S., Bogdanova, A., Kraehenbuhl, J. P., Pringault, E. Conversion by Peyer's patch lymphocytes of human enterocytes into M cells that transport bacteria. Science. 277, 949-952 (1997).
  33. Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. , (2010).
  34. Lei, N. Y., et al. Intestinal subepithelial myofibroblasts support the growth of intestinal epithelial stem cells. PLoS One. 9, e84651(2014).
  35. Voog, J., Jones, D. L. Stem cells and the niche: a dynamic duo. Cell Stem Cell. 6, 103-115 (2010).
  36. Jabaji, Z., et al. Use of collagen gel as an alternative extracellular matrix for the in vitro and in vivo growth of murine small intestinal epithelium. Tissue Eng Part C Methods. 19, 961-969 (2013).
  37. Jabaji, Z., et al. Type I collagen as an extracellular matrix for the in vitro growth of human small intestinal epithelium. PLoS One. 9, e107814(2014).
  38. Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nat Protoc. 9, 2354-2368 (2014).
  39. Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Exp Biol Med. 239, Maywood, N.J. 1124-1134 (2014).
  40. Tompkins, W. A., Watrach, A. M., Schmale, J. D., Schultz, R. M., Harris, J. A. Cultural and antigenic properties of newly established cell strains derived from adenocarcinomas of the human colon and rectum. J Natl Cancer Inst. 52, 1101-1110 (1974).
  41. Hinterleitner, T. A., Saada, J. I., Berschneider, H. M., Powell, D. W., Valentich, J. D. IL-1 stimulates intestinal myofibroblast COX gene expression and augments activation of Cl- secretion in T84 cells. Am J Physiol. 271, 1262-1268 (1996).
  42. Hoshi, H., McKeehan, W. L. Brain- and liver cell-derived factors are required for growth of human endothelial cells in serum-free culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 81, 6413-6417 (1984).
  43. Salerno-Goncalves, R., Pasetti, M. F., Sztein, M. B. Characterization of CD8(+) Effector T Cell Responses in Volunteers Immunized with Salmonella enterica. Serovar Typhi Strain Ty21a Typhoid Vaccine. J Immunol. 169, 2196-2203 (2002).
  44. Poggioli, T., Sarathchandra, P., Rosenthal, N., Santini, M. P. Intramyocardial cell delivery: observations in murine hearts. J Vis Exp. , e51064(2014).
  45. Eastburn, D. J., Mostov, K. E. Laying the foundation for epithelia: insights into polarized basement membrane deposition. EMBO Rep. 11, 329-330 (2010).
  46. Coecke, S., et al. Guidance on good cell culture practice. a report of the second ECVAM task force on good cell culture practice. Altern Lab Anim. 33, 261-287 (2005).
  47. Geraghty, R. J., et al. Guidelines for the use of cell lines in biomedical research. Br J Cancer. 111, 1021-1046 (2014).
  48. Hartung, T., et al. Good Cell Culture Practice. ECVAM Good Cell Culture Practice Task Force Report 1. Altern Lab Anim. 30, 407-414 (2002).
  49. Blanchet, O., et al. Altered binding of regulatory factors to HLA class I enhancer sequence in human tumor cell lines lacking class I antigen expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 3488-3492 (1992).
  50. Palmisano, G. L., et al. HLA-E surface expression is independent of the availability of HLA class I signal sequence-derived peptides in human tumor cell lines. Hum Immunol. 66, 1-12 (2005).
  51. Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nat Med. 15, 701-706 (2009).
  52. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
  53. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
  54. Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunol. , (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reimpresiones y Permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este JoVE artículos

Solicitar permiso

Explorar más artículos

Bioingenier aNo 113humanotridimensional 3 Dla microgravedadrecipiente giratorio pared RWVel intestinolas c lulas epiteliales

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Contáctenos

RECOMIENDE A LA BIBLIOTECA

BOLETINES de JoVE

Investigación

Educación

Autores

Bibliotecarios

ACERCA DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados