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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Zellen in einem dreidimensionalen (3-D) -Umgebung wachsenden stellen eine deutliche Verbesserung gegenüber der Zellkultivierung in 2-D - Umgebungen (beispielsweise Kolben oder Geschirr). Hier beschreiben wir die Entwicklung eines vielzelligen 3-D organotypischen Modell der menschlichen Schleimhaut Darm unter Schwerelosigkeit kultiviert, die von rotierenden Wandgefäß (RWV) Bioreaktoren.

Zusammenfassung

Da die Zellen in einem dreidimensionalen (3-D) Umwelt haben das Potenzial wachsen viele Lücken der Zellkultivierung zu überbrücken , in 2-D - Umgebungen (z. B. Flaschen oder Geschirr). In der Tat ist es allgemein anerkannt, dass in Flaschen oder Geschirr neigen gezüchtete Zellen zu dedifferenzieren und spezielle Funktionen der Gewebe verliert, aus dem sie abgeleitet wurden. Derzeit gibt es im Wesentlichen zwei Arten von 3-D-Kultursysteme, wo die Zellen in Gerüste geimpft werden die native extrazelluläre Matrix (ECM) nachahmt: Bioreaktoren (a) statische Modelle und (b) Modellen. Der erste Durchbruch war die statischen 3-D-Modelle. 3-D-Modelle Bioreaktoren wie der rotierenden Wandgefäß (RWV) Bioreaktoren sind eine neuere Entwicklung verwendet wird. Das ursprüngliche Konzept der RWV Bioreaktoren wurde am NASA Johnson Space Center in den frühen 1990er Jahren entwickelt und wird angenommen, dass die Grenzen der statischen Modelle wie die Entwicklung von hypoxischen, nekrotischen Kerne zu überwinden. Die RWV Bioreaktoren könnten umgehen thist Problem durch Bereitstellung fluid dynamics, die die effiziente Diffusion von Nährstoffen und Sauerstoff erlauben. Diese Bioreaktoren bestehen aus einem Rotator Basis, und drehen Sie zwei verschiedene Formate der Kulturgefäße zur Unterstützung dient , die durch ihre Belüftungsquellentyp unterscheiden: (1) langsames Drehen Lateral Vessels (STLVs) mit einer koaxialen Oxygenator in der Mitte, oder (2 ) Hohe Seitenverhältnis Vessels (HARVs) mit Sauerstoffversorgung über einen flachen, Silikonkautschuk Gasübertragungsmembran. Diese Gefäße ermöglichen eine effiziente Gastransfer während der Blasenbildung und damit Turbulenzen zu vermeiden. Diese Bedingungen führen zu einer laminaren Strömung und minimale Scherkraft, die Modelle der Schwerkraft (Schwerelosigkeit) reduziert im Inneren des Kulturgefäßes. Hier beschreiben wir die Entwicklung eines vielzelligen 3-D organotypischen Modell des menschlichen Darmschleimhaut besteht aus einer intestinalen Epithelzellen Zelllinie und primären humanen Lymphozyten, Endothelzellen und Fibroblasten gezüchtet unter Schwerelosigkeit durch den RWV Bioreaktor zur Verfügung gestellt. </ P>

Einleitung

Der erste Durchbruch beim Aufbau eines 3-D - Modell wurde in den frühen der 1980er Jahre berichtet , als die Wissenschaftler verschiedene Arten des Gerüsts (z. B. Laminin, Kollagen Typ I, Kollagen IV und Fibronektin) und Cocktails von Wachstumsfaktoren zu untersuchen begann zu verbessern Zelle-zu-Zelle und ECM - Wechselwirkungen von "statischen" 3-D - Modelle 1-7. Seitdem hat das Hauptproblem bei diesen Modellen Einschränkungen waren bei der Übertragung von Nährstoffen und Sauerstoff in dem Medium und Gewebekonstrukten 8. Im Gegensatz zu den Zellen in der in vivo Umgebung , die von umgebenden Netzen von Blutgefäßen einen stetigen Fluss von Nährstoffen und Sauerstoff erhält, behindert die statische Natur dieser Modelle , um die effektive Verteilung von ihnen zu den Zellen. Zum Beispiel Zellaggregate in in - vitro - statische Modelle erzeugt , die ein paar Millimeter groß überschreiten wird unweigerlich hypoxischen, nekrotischen Kerne 9 entwickeln. Die RWV Bioreaktoren könnte dieses Problem zu umgehendurch fluid dynamics , vorausgesetzt die effiziente Diffusion von Nährstoffen und Sauerstoff 10-12 ermöglichen. Doch bis heute, die Arbeit mit RWV Bioreaktoren wurden auf die Aufnahme von ein oder zwei Zelltypen 13-17 begrenzt. Außerdem kann anstelle eines räumlichen Orientierung ähnlich zu nativem Gewebe bildeten die Zellen Zellaggregate. Der Hauptgrund für diese Einschränkung ist das Fehlen eines Gerüst Lage, Zellen in einer integrierten Weise zu integrieren. Die Gerüste in den RWV Bioreaktoren bisher verwendet werden , bestehen, mit wenigen Ausnahmen 16-18, vor allem von synthetischen Mikrokügelchen, rohrförmigen Zylinder oder kleine Blätter 13-15,19-23. Diese sind steife Materialien, deren Zusammensetzung und Flexibilität nicht manipuliert werden können, und an die Zellen an ihre Oberfläche gebunden. Somit ist es unwahrscheinlich , dass diese Modelle ein System , in dem bieten wird zu bewerten, in einer integrierten Weise, die verschiedenen Zellkomponenten wie Stromazellen (z. B. Fibroblasten, Immun- und Endothelzellen) , dass should im Gerüst verteilt werden, um eng menschlichem Gewebe nachahmen.

Hier beschreiben wir die Entwicklung eines mehrzelligen 3-D organotypischen Modell der menschlichen Darmschleimhaut , bestehend aus einer intestinalen epithelialen Zelllinie und primären humanen Lymphozyten, Endothelzellen und Fibroblasten 24. Diese Zellen wurden unter Schwerelosigkeit zur Verfügung stellen von der RWV Bioreaktor 13,25-30. Im 3-D - Modell besitzt die ECM viele verschiedene Eigenschaften, wie beispielsweise eine Osmolalität ähnlich dem Kulturmedium (z. B. vernachlässigbaren Diffusionsbeschränkungen während der Kultur) und die Fähigkeit , Zellen und anderen relevanten extrazelluläre Matrixproteine, sowie die einzuarbeiten entsprechende Steifigkeit in Bioreaktoren 24 verwendet werden. Biologische Systeme sind sehr komplex, und in den letzten Jahren hat mit der Umgebung eher eine Verschiebung des Fokus von Schleimhaut Forschung in Richtung auf die Untersuchung von Zell-Wechselwirkungen war, als sie in isolatio Studiumn. Insbesondere wird die Bedeutung der Zell-Zell - Wechselwirkungen bei der Beeinflussung intestinale Zellüberlebens und der Differenzierung gut 31-34 dokumentiert. Insbesondere weist die Verbindung zwischen Epithelzellen und ihre Nische einen profunden Einfluss auf die Epithelzelle Expansion und Differenzierung 35. Tatsächlich ist es allgemein anerkannt, dass nicht nur die Zelle-zu-Zelle, sondern auch Zell-ECM-Wechselwirkungen sind für die Wartung und die Differenzierung von Epithelzellen in 3-D Kulturmodellen. Frühere Studien haben gezeigt, dass gut ECM - Proteine ​​wie Kollagen zeigte ich 24,36,37, Laminin 38 und Fibronektin 39 instrumental sind in intestinalen Epithelzellen beeinflussen räumliche Orientierung ähnlich der nativen Schleimhaut zu erwerben. So kann die Entwicklung neuer Technologien, wie unsere 3-D - Modell 24, dass imitieren die phänotypische Vielfalt des Darms ist erforderlich, wenn die Forscher die komplexe zelluläre und strukturelle Architektur neu zu erstellen beabsichtigenund die Funktion des Darms Mikroumgebung. Diese Modelle stellen ein wichtiges Instrument bei der Entwicklung und Evaluierung von neuen oralen Medikamenten und Impfstoff-Kandidaten.

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Protokoll

Ethik Aussage: Alle Blutproben wurden von Freiwilligen gesammelt , die in der Protokollnummer HP-00040025-1 teilgenommen. Die University of Maryland Institutional Review Board genehmigt dieses Protokoll und ermächtigt, die Sammlung von Blutproben von gesunden Freiwilligen für die Studien in diesem Manuskript enthalten. Der Zweck dieser Studie an Freiwilligen wurde erklärt, und alle Freiwilligen gab informiert unterzeichnete Zustimmung vor Ende der Blutentnahme.

Hinweis: Siehe Tabelle 1 für mittlere Ergänzung Vorbereitung. Siehe Tabelle 2 für die Herstellung der 3-D - Kulturmedien.

1. Vorbereitung der Kulturgefäße

  1. Schrauben Sie den Deckel der Einfüllöffnung des 50 ml-Gefäß füllen und mit 50 ml sterilem Kulturmedium (z. B. RPMI). Führen Sie alle unter sterilen Bedingungen in einer laminaren Haube.
  2. Setzen Sie die Kappe und wischen Sie verschüttete Medium auf jeder Oberfläche mit 70% Ethanol.
  3. Lassen Sie das Schiff zu incubmindestens 15 min O / N bei RT aßen.
  4. Verwenden Sie die Einfüllöffnung des Kulturmediums zu verwerfen und 30 ml 3-D-Kulturmedium.
  5. Wischen Sie verschüttete Medium auf jeder Oberfläche mit 70% Ethanol.

2. Herstellung der Zellen

  1. Humanen epithelialen Zelllinie (HCT-8) 24,40.
    1. Kulturzellen in RPMI, ergänzt mit 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 50 ug / ml Gentamicin, 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 10 mM HEPES-Puffer und 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS ) (Beilage 1). Bei 70% Konfluenz, geteilte Zellen in einem Verhältnis von 1: 5.
  2. Menschliche Kolon - Fibroblasten (CCD-18Co - Zellen) 24,41.
    1. Kulturzellen in Basal Eagle-Medium , angereichert mit Beiblatt 1 Bei Konfluenz, geteilte Zellen in einem Verhältnis von 1:. 3.
  3. Nabelvene des Menschen Endothelial (HUVEC - Zellen) 24,42.
    1. Kulturzellen in Endothelial Basal Medium (EBM) Medium mit 100 ug angereichert / ml Heparin, 3 ug / ml Endothelzellwachstums Supplement (EKGs) und 1 ergänzen Bei 70% Konfluenz, geteilte Zellen in einem Verhältnis von 1:. 2.
  4. Lymphozyten / Monozyten
    1. Isolieren Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) aus dem Blut durch Dichtegradientenzentrifugation unter Verwendung von Standardtechniken 43.
      1. Kurz gesagt, eine 10 ml-Pipette vorsichtig 30 ml verdünntem Blut (1: 1 Blut: Phosphat-gepufferte Saline (PBS)) in einem 50 ml konischen Röhrchen 10 ml Dichtezentrifugation Medien enthält. Nach dem Zentrifugationsschritt, Lymphozyten und Monozyten werden zwischen den Dichtezentrifugation Medien und Plasma-Schichten in der "weißen" Schicht befinden.
      2. Sammeln Sie die weiße Schicht eine Transferpipette. Vermeiden Sie Granulozytkontaminierung durch die Sammlung von Dichtezentrifugation Medien zu begrenzen. Nach 43 Waschen, use PBMC wie oder kryokonserviert in flüssigem N 2.
        Hinweis: Es ist wichtig zu betonen, dass PBMC besteht im Wesentlichen aus Lymphozyten und Monozyten, mit einem kleinen Anteil von dendritischen Zellen und anderen Zelltypen.
  5. Wachsen alle Zellen unter Standardkulturbedingungen bei 37 ° C in einer Atmosphäre von 5% CO 2.

3. Herstellung von Kollagen-eingebetteten Zellen

  1. Bestimmen Sie die Anzahl der Einsätze auf die Zahlen von experimentellen Bedingungen benötigt Basis-Set-up zu werden. Legen Sie die entsprechende Anzahl von Einsätzen in die Vertiefungen einer 6-Well-Platte.
  2. Eine Suspension von HUVEC und Fibroblasten:
    1. Waschen Sie die Kolben zweimal in PBS und lösen die Zellen unter Verwendung von Trypsin, 0,25% (1x) mit 0,05% Trypsin-Tetranatriumethylendiamintetraacetat (Trypsin-EDTA). Fügen Sie genug Trypsinlösung die Gesamtheit der Zellkulturoberfläche zu bedecken. Detachment erfolgt in der Regel innerhalb von 5 bis 15 min
    2. Sammelnabgelösten Zellen in einer 50 ml-Rohr 30 ml Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) -30% FBS Medium enthält.
    3. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 500 g für 10 min.
    4. Resuspendieren der Zellen in 30 ml DMEM-30% FBS-Medium.
    5. Zählen der Gesamtzahl der lebenden Zellen durch Verdünnen von 20 & mgr; l der resuspendierten Zellen mit 20 ul Trypan-Blau-Farbstoff. Legen Sie das Hämozytometer mit dem Zellgemisch. Tragfähige PBMCs wird weiß klar; nonviable PBMC wird der Farbstoff und werden blau erwerben.
      1. Resuspendieren jeden Zelltyp in DMEM-30% FBS - Medium bei einer Konzentration von 5 - 8 x 10 & sup7 ; Zellen ml - 1.
  3. Bereiten Sie zellhaltigen Collagengele
    Hinweis: Jeder Behälter wird die Herstellung von ~ 5 ml zellhaltigen Kollagengel erfordern.
    1. In einem 50 ml-konischen Röhrchen durch Zugabe von 1 x DMEM-Medium, das Kollagen-Mischung herzustellen, ergänzt mit 50 ug / ml Gentamicin, 2 mM L-Glutamin und 10% hitze inactivated FBS plus 3 mg / ml bovinem Kollagen-I, 10 ug / ml Laminin, 40 ug / ml Collagen IV, 10 ug / ml Fibronektin, 2 ug / ml Heparinsulfat-Proteoglykan und 15 mM NaOH (den physiologischen pH zu erreichen).
    2. Schließen Sie den Schlauch und mischen mehrmals durch Umdrehen, bis die Mischung vollständig homogenisiert. Vermeiden Sie Blasenbildung.
      Wichtig: Halten Sie die Mischung auf Eis Gelieren zu verhindern.
      1. Critical Schritt: Wenn die Mischung ein saures Aussehen (gelbliche Farbe) entwickelt, ein paar Tropfen steriler 1 N NaOH das Gemisch zu neutralisieren.
    3. Konzentrierte HUVEC und Fibroblasten in einer Dichte von 1,0 bis 1,2 und 1,5 bis 2,0 x 10 6 Zellen / ml, jeweils mit dem angereicherten Kollagen-Mischung (oben beschrieben). Schließen Sie die Rohre und mischen mehrmals durch Umdrehen, bis die Mischung vollständig homogenisiert. Vermeiden Sie Blasenbildung. Wichtig: Halten Sie die Mischung auf Eis Gelieren zu verhindern.
    4. Hinzufügen von 4 bis 5 ml des zellhaltigen KollagenGel nach jedem Einsatz, die zuvor in eine 6-Well-Platte geladen ist, und in der Haube mit wenig oder keiner Bewegung für 1 h zu gelieren gelassen.
    5. Nach 1 Stunde, übertragen Sie die 6-Well - Platte auf einem 37 ° C, 5% CO 2 Inkubator für 1 - 2 zusätzliche Stunden.
    6. Bringen Sie den 6-Well-Platte mit der Haube und mit Hilfe einer sterilen Pinzette und Skalpell aseptisch abgeschnittene die Membran von dem Einsatz Lösen der zellhaltigen Gels aus der Membran. Schneiden Sie das freistehende Gel in kleine Quadrate (~ 5 x 5 mm).
    7. Fügen Sie die kleinen Zellen enthaltende Quadrate in ein 50-ml HARV mit der Füllöffnung.
  4. Eine Suspension von HCT-8-Epithelzellen:
    1. Waschen Sie die Kolben zweimal in PBS und lösen die Zellen unter Verwendung von Trypsin, 0,25% (1x) mit Trypsin-EDTA-Behandlung. Fügen Sie genug Trypsinlösung die Gesamtheit der Zellkulturoberfläche zu bedecken. Detachment erfolgt in der Regel innerhalb von 10 bis 15 Minuten.
    2. Sammeln abgelösten Zellen in 30 ml DMEM-30% FBS-Medium.
    3. Zentri- fugalkrUGE DMEM-30% FBS-Medium Rohr bei 500 xg für 10 min enthält.
    4. Resuspendieren der Zellen in 30 ml DMEM-30% FBS-Medium.
    5. Zählen der Gesamtzahl der lebensfähigen Zellen, wie in 3.2.5 beschrieben.
    6. Resuspendieren der HCT-8 - Epithelzellen in DMEM-30% FBS - Medium bei einer Konzentration von 10 7 Zellen ml - 1.
    7. 1 ml der konzentrierten HCT-8-Epithelzellen in die 50-ml HARV mit der Füllöffnung.
  5. Durch die Verwendung der Einfüllöffnung, fügen Sie weitere 3-D-Kulturmedium, bis der Behälter fast voll ist (~ 20 ml).
  6. Setzen Sie die Kappe und wischen Sie die Lippe der Einfüllöffnung mit 70% Ethanol.
  7. Legen Sie eine Spritze in jeder Spritze Port des RWV: Ort, um eine 5 ml-Spritze mit 3 bis 4 ml 3-D-Kulturmedium in einem Hafen und eine 5 ml-leere Spritze in den anderen Port.
  8. Entfernen Sie alle sichtbaren Blasen, die durch in die leere Spritze ziehen, während etwa das gleiche Volumen des Mediums durch den anderen Spritzenkanal injiziert wird.
  9. Legen Sie die vesSels im Bioreaktor, schalten Sie das Gerät und stellen Sie die Geschwindigkeit auf etwa 13 bis 14 Umdrehungen pro Minute.
    Hinweis: Critical Schritt: Rotation Rate müssen möglicherweise einige Male während eines Experiments eingestellt werden , um die Zellen zu halten innerhalb des Behälters umlaufenden, um dadurch die Vermeidung von Kontakt mit den Gefäßwänden.
  10. Kulturzellen bei 37 ° C, 5% CO 2 unter Schwerelosigkeit, durch den RWV Bioreaktor vorgesehen.
  11. Ändern Kulturmedium alle 3 - 4 Tage durch das Ersetzen ca. 30 ml mit frischem 3-D-Kulturmedium.
  12. Nach 4 Tagen (± 1 Tag), die Gefäße aus dem Bioreaktor zu entfernen und Lymphozyten / Monozyten zu den Gefäßen (2 x 10 7 / Schiff) hinzuzufügen.
  13. Platzieren der Gefäße wieder in dem Bioreaktor bei 37 ° C, 5% CO 2 für weitere 5 Tage (± 1 Tag).
  14. Nach den weiteren 5 Tagen (Tag 9 der Kultur), Lymphozyten / Monozyten zu den Gefäßen (2 x 10 7 / Gefäß) hinzuzufügen und die Kulturen für 12 weitere Tage fortgesetzt.
  15. Ändern Kulturmedium alle 3 - 4 Tage durch das Ersetzen ca. 30 ml mit frischem 3-D-Kulturmedium.

4. Ernten 3-D-Kulturen für die Histologie

  1. Mit Hilfe einer Transferpipette Ernte jeder kleine Gelfragment, jetzt genannt "Konstrukt", in einem Sechs-Well-Platte, enthaltend 10 ml 10% Formalin-Puffer. Verlassen 3 h bei RT oder für 12 bis 16 Stunden bei 4 ° C.
  2. Bereiten Sie die Gewebeverarbeitung und Einbettkassetten durch Markierung und das Hinzufügen von zwei Stücke von Biopsie Schaumstoffpolster in jeder Kassette.
  3. Tauchen Sie die Kassetten in 10% Formalin-Puffer.
  4. Mit Hilfe der Zange stellen die Fest Konstrukten zwischen den beiden Schaumstoffpolster.
  5. Tauchen Sie die Kassetten in 10% Formalin-Puffer.
  6. Fahren Sie mit dem Standardverfahren für die Einbettung, Schneiden und Färben 44.

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Ergebnisse

Bisher haben wir einen mehrzelligen 3-D organotypischen Modell des menschlichen Darmschleimhaut bestehend aus einer Darmepithel - Zelllinie und primären humanen Lymphozyten, Endothelzellen und Fibroblasten unter Schwerelosigkeit 24 (1) kultiviert entwickelt. Fibroblasten und Endothelzellen wurden in einer Kollagen - Matrix mit zusätzlichen I gut Basalmembranproteine ​​45 (dh., Laminin, Kollagen IV, Fibronectin und Heparinsulfat ...

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Diskussion

In diesem Manuskript beschreiben wir die Entwicklung eines biotechnologisch - Modell der menschlichen Schleimhaut Darm von Multiples Zelle besteht Typen , einschließlich primären humanen Lymphozyten, Fibroblasten und Endothelzellen, sowie Darmepithel - Zelllinien 24. In diesem 3-D - Modell werden die Zellen in einem Kollagen-reiche extrazellulären Matrix unter Schwerelosigkeit 24 kultiviert.

Wie bereits beschrieben, sind die wichtigsten Merkmale dieses Modells:

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Offenlegungen

The authors declare that a US Non-Provisional Patent Application has been filed in the U.S.Patent and Trademark Office (Number: 13/360,539).

Danksagungen

This work was supported, in part, by NIAID, NIH, DHHS federal research grants R01 AI036525 and U19 AI082655 (CCHI) to MBS and by NIH grant DK048373 to AF. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institute of Allergy And Infectious Diseases or the National Institutes of Health.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Quad Rotator/Independent Rotating Wall Vessel (RWV) bioreactor SyntheconRCCs-4DQFor up to 4 vessels. Models with more or less vessels are also available.
Disposable 50 ml-vesselSyntheconD-405Box with 4 vessels
HCT-8 epithelial cells ATCCCCL-244
CCD-18Co Fibroblasts ATCCCRL-1459
Human Umbilical Vein Endothelial CellsATCCCRL-1730HUVEC
Fibroblast Growth Factor-Basic SigmaF0291bFGF
Stem Cell Factor SigmaS7901SCF
Hepatocyte Growth Factor SigmaH1404HGF
Endothelin 3SigmaE9137
LamininSigmaL2020Isolated from mouse Engelbreth-Holm-Swarm tumor
Vascular Endothelial Growth Factor SigmaV7259VEGF
Leukemia Inhibitory Factor Santa Cruzsc-4377(LIF
AdenineSigmaA2786
InsulinSigmaI-6634
3,3',5-triiodo-L-thyronine SigmaT-6397T3
Cholera ToxinSigmaC-8052
FibronectinBD354008Isolated from human plasma
apo-TransferrinSigmaT-1147
HeparinSigmaH3149
Heparan sulfate  proteoglycanSigmaH4777Isolated from basement membrane of mouse  Engelbreth-Holm-Swarm tumor
Collagen IVSigmaC5533Isolated from human placenta
Heat-inactivated fetal bovine serum Invitrogen10437-028
D-MEM, powderInvitrogen12800-017
10% formalin–PBS Fisher ScientificSF100-4
Bovine type I collagen InvitrogenA1064401
Trypsin-EDTA Fisher ScientificMT25-052-CI
Sodium pyruvateInvitrogen11360-070
Gentamicin Invitrogen15750-060
Penicillin/streptomincin Invitrogen15140-122
L-GlutamineInvitrogen25030-081
HepesInvitrogen15630-080
Ham's F-12Invitrogen11765-054
Basal Medium EagleInvitrogen21010-046BME
RPMI-1640Invitrogen11875-093
Endothelial Basal MediumLonzaCC-3156EBM-2
Endothelial cell growth supplementMillipore02-102ECGS

Referenzen

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