El estudio de la función de los macrófagos alveolares en cáncer de mama metástasis

Resumen

Here we describe the model and approach to study functions of pulmonary alveolar macrophages in cancer metastasis. To demonstrate the role of these cells in metastasis, the syngeneic (4T1) model of breast cancer in conjunction with the depletion of alveolar macrophage with clodronate liposomes was used.

Resumen

This paper describes the application of the syngeneic model of breast cancer (4T1) to the studies on a role of pulmonary alveolar macrophages in cancer metastasis. The 4T1 cells expressing GFP in combination with imaging and confocal microscopy are used to monitor tumor growth, track metastasizing tumor cells, and quantify the metastatic burden. These approaches are supplemented by digital histopathology that allows the automated and unbiased quantification of metastases. In this method the routinely prepared histological lung sections, which are stained with hematoxylin and eosin, are scanned and converted to the digital slides that are then analyzed by the self-trained pattern recognition software. In addition, we describe the flow cytometry approaches with the use of multiple cell surface markers to identify alveolar macrophages in the lungs. To determine impact of alveolar macrophages on metastases and antitumor immunity these cells are depleted with the clodronate-containing liposomes administrated intranasally to tumor-bearing mice. This approach leads to the specific and efficient depletion of this cell population as confirmed by flow cytometry. Tumor volumes and lung metastases are evaluated in mice depleted of alveolar macrophages, to determine the role of these cells in the metastatic progression of breast cancer.

Introducción

The premetastatic niche is an important process in cancer metastasis defined as a set of alterations that occur in the organs that are targets for metastases prior to arrival of tumor cells^1,2. Therefore, therapeutic targeting of this step of cancer progression may prevent metastases to the vital organs that cause approximately 90% of cancer-associated deaths. Although the concept of the premetastatic niche, also known as the "seed and soil" theory, was introduced more than a century ago, no experimental proof has been provided until recently, when the bone marrow-derived cells were demonstrated to contribute to the premetastatic soil^1,3-7. Despite these developments, the premetastatic niche remains a largely understudied aspect of cancer pathophysiology and further research to identify cellular players and mechanisms involved is needed.

Here we report the in vivo approaches to study the role of alveolar macrophages in breast cancer metastases and the lung premetastatic niche. The alveolar macrophages arrive to the lungs early during the embryonic development and self-renew there during adulthood⁸. They also have important immunomodulatory and homeostatic functions including the protection of this organ from undesired inflammatory responses to the environmental innocuous antigens⁹. Therefore, we hypothesize that tumors exploit this physiological immunosuppression, imposed by alveolar macrophages, and, consequently, alveolar macrophages contribute to the lung premetastatic niche by suppressing antitumor immunity. This hypothesis is supported by our recent report demonstrating that the specific depletion of these cells reduces lung metastases and enhances antitumor T cell responses¹⁰.

For these studies we apply a well-established syngeneic model of breast cancer (4T1), which mimics stage IV metastatic breast cancer¹¹; and has been previously reported in studies of the premetastatic niche⁶. To track metastasizing tumor cells in vivo we use 4T1 cells expressing GFP (4T1-GFP) in conjunction with animal imaging and confocal microscopy. We focus on the lung premetastatic niche, since this organ is one of the most common targets of hematogenous metastases of human malignancies¹². To investigate functions of alveolar macrophages in the premetastatic niche, we use clodronate liposomes to deplete these cells¹³; and evaluate impact of this depletion on lung metastases. Of note, this method specifically depletes alveolar macrophages but no other phagocytic cells in the lungs or in circulation¹⁰.

Protocolo

Todos los estudios con animales han sido aprobados por Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión de Texas Tech University Health Sciences Center y siguió las directrices que se describen en la "Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio", publicado por los Institutos Nacionales de Salud. Utilice ocho a doce semanas de edad ratones BALB / c hembra que están disponibles comercialmente. Inyectar 1 x 10 ⁵ 4T1 o 1 x 10 ⁵ 4T1 células que expresan GFP, que se puede adquirir de varios fabricantes, en la almohadilla de grasa mamaria.

1. Cultura de 4T1 y 4T1-GFP Células y Preparación de tumor de células de suspensión para inyección ¹⁴

1. 4T1 y 4T1-GFP de Cultivos Celulares
   NOTA: Realizar todos los pasos que utilizan soluciones estériles en un flujo de aire laminar (LAF) del gabinete de bioseguridad a menos que se especifique lo contrario.
   1. Mantener las células 4T1 y 4T1-GFP en medio RPMI suplementado con calor suero fetal inactivado bovino al 10% y 100 U / ml de penicilinaG y 100 mg de sulfato de estreptomicina / ml.
      NOTA: Determinar un número de pases por contar cada tripsinización y chapado de las células. Es importante el uso de células con el mismo número de pases para todos los experimentos de ratón, como el número de pasajes afecta a la tumorigenicidad de células y el potencial metastásico.
   2. Antes de inyecciones de células retire el T75 cm ² frasco, que contiene las células tumorales en el 80% de confluencia, a partir de un medio de incubadora y aspirado. Añadir 10 ml de PBS y girar el matraz suavemente para lavar medio restante, y luego aspirar PBS.
   3. Añadir 2 ml de 0,25% de tripsina con EDTA al matraz y la inclinación para distribuir la solución uniformemente sobre la superficie y se incuban en un incubador humidificado durante 3 min a 37 ° C con 5% de CO _2.
   4. Toque en el matraz para facilitar el desprendimiento de las células y añadir 8 ml de medio fresco. Pipetear arriba y abajo varias veces para interrumpir grumos y obtener una suspensión de células individuales.
   5. Centrifugar las células durante 5 min. a 500 xg a TA.Aspirar el sobrenadante y lavar las células en 10 ml de PBS.
   6. Pipetear arriba y abajo varias veces para interrumpir grumos y obtener una suspensión de células individuales. Tomar 100 l de una suspensión de células y contar las células utilizando el analizador de la viabilidad celular según las instrucciones del fabricante.
   7. Calcular el número de células necesarias para todas las inyecciones utilizando la fórmula: 10 ⁵ células por ratón x # de ratones utilizados en un experimento (siempre preparar células adicionales para estar en un lado seguro).
   8. Centrifugar las células como en 1.1.5. Eliminar el sobrenadante a través de células de aspiración y resuspender en la cantidad de PBS fresco necesario para obtener una concentración final de células de 1 x 10 ⁶ células / ml. Mantener la suspensión de células en hielo hasta que esté lista para la inyección.
2. 4T1 4T1-GFP o celulares procedimientos de inyección-ratón
   1. El día antes de la inyección de células tumorales, anestesiar los ratones en una cámara de inducción con 3% de isoflurano. Una vez que los ratones duermen y respiran regularmente, lugar tque el ratón sobre una almohadilla quirúrgica con la nariz en el interior del cono de la nariz, y conectarlo con el vaporizador de isoflurano. Mantener la anestesia con isoflurano al 2,5%. Apriete la punta del ratón para asegurarse de que el ratón se anestesia.
   2. Aplicar crema de depilación utilizando un hisopo de algodón para el sitio de inyección (pectoral almohadilla de grasa mamaria derecha) y espere durante 2 minutos. Limpiar el sitio usando una toalla de papel húmeda, colocar el ratón en la jaula y controlar a un animal hasta que recupere la conciencia suficiente para mantener el decúbito esternal.
   3. En el día de la inyección, anestesiar a los ratones como en 1.2.2 y colocar en la plataforma quirúrgica.
   4. Vortex el tubo que contiene las células tumorales para obtener la suspensión celular uniforme. Aspirar 100 l de una suspensión de células, que contienen 1 x 10 ⁵ células tumorales, en una jeringa de 0,5 ml de insulina (29 g, 12,7 mm de longitud con aguja).
   5. Levantar la piel usando el índice y el dedo pulgar cerca del 2 ^y 3 ^de pezón, insertar la aguja de la jeringa en el Mammarla capa de grasa y justo debajo de la tercera boquilla de debajo de la piel entre los dedos e inyectar las células lentamente para formar una burbuja (inyección subcutánea).
   6. Coloque el ratón en la jaula después de la inyección y el monitor como en el punto 1.2.2.
3. Crecimiento Tumoral monitoreo
   1. Las mediciones de la pinza ¹⁴
      NOTA: Inyectados o 4T1 4T1-GFP células forman tumores de mama agresivo. Por lo general, los tumores palpables parecen ~ en el día 4 - 5 después de la inoculación de células. Las células 4T1-GFP forman tumores que crecen más lento y dan metástasis posterior. Mida el tumor de dos a tres veces a la semana. Si el estado clínico de los animales se deteriora, los animales pierden peso corporal superior al 10%, tumores superan el 10% del peso corporal o ulcerarse, la eutanasia a los ratones inmediatamente.
      1. Anestesiar a un ratón como en 1.2.1., Pesar, su lugar en la plataforma quirúrgica y humedecer la zona con 70% de etanol.
      2. Se palpa tumor en el sitio de inyección (4 - 5 días después de la inoculación de células).
      3. Medir el diámetro más grande (D) y de menor diámetro (d1) con un calibrador.
      4. Calcular el volumen del tumor utilizando la fórmula: Volumen = (DX X d1 d1) / 2 mm ^3. Seguimiento de la recuperación de la anestesia del ratón como en 1.2.2.
   2. Imaging (Sólo para 4T1 células GFP)
      1. Anestesiar el ratón como en 1.2.1. Coloca el ratón sobre una plataforma móvil en el interior del instrumento de imagen. Mantener la anestesia a través del cono de la nariz.
      2. Encienda el instrumento de imagen y la fuente de luz según las instrucciones del fabricante.
      3. En virtud de la "Adquisición" ir a la pestaña "Iluminación" y cambiar a la posición vacía (sin filtro) para la luz blanca. Asegúrese de que el motor de la luz está en ON y seleccione 'trans' en la mesa de luz.
      4. En la pestaña "Microscopio", seleccione "Borrar" filtro de emisión y la ampliación 0.5X. En la pestaña "Cámara", asegúrese de que se va a agrupar para la captura es '1 x 1' y la vista previa '4 x 4'.
      5. Haga clic en la vista previa para localizar el tumor con luz blanca, se centran para obtener una imagen clara, y haga clic en la captura.
      6. Ir a la pestaña de iluminación y el cambio "Adquisición" para filtrar 1 (filtro de GFP de acuerdo con las instrucciones del fabricante). En la pestaña "microscopio", cambiar filtro de emisión a "GF 530/20". captura de la imagen de vista previa y en un canal verde. Ajustar el tiempo de exposición para obtener el brillo adecuado.
      7. Aplicar pseudocolor a la imagen y guardar en la carpeta correspondiente (Figura 1).

2. Administración intranasal de liposomas ¹⁰

NOTA: Realizar todos los pasos que utilizan soluciones estériles en un flujo de aire laminar (LAF) Gabinete de Bioseguridad menos que se especifique lo contrario.

1. En el día 6 después de la inyección de células tumorales anestesiar a los ratones como en 1.2.1.
2. Vórtex con la suspensión clodronato o el control de liposomas (PBS) obtenido del fabricante. Tomar 60 l de liposomas sUSPENSIÓN utilizando puntas de pipeta estéril.
3. liberar lentamente solución de liposomas (5 l cada vez), cerca de las fosas nasales que permiten el ratón para respirar en la solución, repetir hasta que se administre la dosis completa de 60 l.
4. Deje el ratón recobre el conocimiento antes de colocarlo de nuevo en la jaula.
5. Repetir la administración de liposomas son sacrificados cada 3 días hasta que los ratones. No administrar liposomas en un día de sacrificio.

3. Sacrificio Mouse y Recogida de tejido

NOTA: El uso en autoclave e instrumentos estériles para la disección del ratón. La eutanasia a los ratones, mientras que bajo anestesia a través de la exanguinación y la eliminación de los órganos vitales.

1. En el día 22 (Para células 4T1) o el día 26 (para células 4T1-GFP) después de la inyección de células tumorales anestesiar el ratón como en 1.2.1. y colocar en la plataforma quirúrgica con un cono de la nariz conectada al vaporizador, mantener la anestesia como en 1.2.1. Pellizcar uno de los dedos de los pies para garantizar que el mouse está inconsciente.
2. Pin de los dedos de los pies con agujas a la mesa de disección. Pulverizar etanol en la piel del ratón.
3. Levantar la piel con unas pinzas y hacer una incisión con las tijeras quirúrgicas. exponer lentamente el peritoneo y continuar el corte de la piel a través del tórax hasta el cuello.
4. El uso de las tijeras quirúrgicas hacer una incisión en el peritoneo y exponer cuidadosamente los órganos con puntas de algodón, evitando el daño a los vasos sanguíneos.
5. Mover los órganos a un lado y exponer la vena cava inferior. La punción de la vena y recoge la sangre con la jeringa de insulina 29 g. Coloque la sangre recogida en el tubo y dejar en hielo para su posterior procesamiento.
6. Cortar el diafragma para destapar los de la caja torácica, los pulmones y el corazón. Lentamente cortar las costillas en ambos lados utilizando el cortador de hueso y levantar la parte superior de la caja torácica. Coge el corazón con unas pinzas y cortar el tejido conectivo que conecta el corazón y los pulmones a la cavidad torácica.
7. Coloque los pulmones en pequeña cantidad de PBS en los 60 mmplaca de Petri en hielo hasta que esté listo para la formación de imágenes y procesamiento adicional para las secciones congeladas para microscopía de inmunofluorescencia o la histología de rutina [incluyendo hematoxilina y eosina (H & E) tinción].

4. Evaluación de pulmón metástasis

1. Contando y anotando metástasis superficiales
   1. Coloque la placa de Petri con los pulmones bajo el microscopio de disección. Enfoque para obtener una visión clara de la superficie del pulmón.
   2. El uso de un microscopio de disección observar la superficie del pulmón. Contar las metástasis en los lados anterior y posterior de ambos pulmones.
      NOTA: El pulmón normal es blanquecino o rosado y porosa y tiene una estructura tipo esponja. Metástasis 4T1 son sólidos y no poroso, a veces parece ser similar a una gota de líquido (Figura 2A).
2. de imágenes de pulmón
   1. Coloque la placa de Petri con los pulmones en el escenario móvil dentro del instrumento de imagen.
   2. Encienda el instrumento y elBioLite fuente multiespectral. Abra el software. En la pestaña "Adquisición", vaya a "Iluminación", y el interruptor a la posición vacía (sin filtro) para la luz blanca. La luz del motor -> ON, la luz de mesa -> Epi. En el marco del "Microscopio" Seleccionar la pestaña "claro" al filtro de emisión y magnificación 1.66X. En la pestaña "Cámara", asegúrese de que se va a agrupar para la captura es '1 x 1' y la vista previa '4 x 4'.
   3. Haga clic en la vista previa y el enfoque para obtener una imagen clara de los pulmones a la luz blanca y haga clic en la captura.
   4. Ir a la pestaña "Adquisición" y el cambio del filtro 1 (filtro de GFP de acuerdo con las instrucciones del fabricante). En la pestaña "microscopio", cambiar filtro de emisión a "GF 530/20". captura de la imagen de vista previa y en un canal verde. Ajustar el tiempo de exposición para obtener el brillo adecuado.
   5. Aplicar pseudocolor a la imagen y guardar en la carpeta correspondiente.
   6. Voltear los pulmones para obtener la imagen de la otra parte de una manera similar. este procedure genera imágenes de metástasis GFP-positivas que se pueden cuantificar aún más usando el software apropiado (Figura 2B) ^14.
3. Microscopía de inmunofluorescencia
   1. Fijar los pulmones en paraformaldehído al 4%, a 4 ° C durante 4 horas en la oscuridad.
   2. Lavar el tejido dos veces con 10 ml de PBS durante 5 min para eliminar completamente el fijador. Traslado al 18% de sacarosa en PBS y se incuba O / N a 4 ° C.
   3. Retire el tejido de la sacarosa y aplique el exceso.
   4. Tome un criomolde, cubrir la capa inferior con medio-OCT-. Coloque el tejido en un medio-OCT-. Llenar el molde con medio OCT para cubrir completamente el tejido y el lugar en hielo seco.
   5. bloque de almacenar a -80 ° C hasta el corte.
   6. Preparar 5 micras de grosor con un criostato y el lugar en portaobjetos cargados.
   7. Almacenar las diapositivas utilizadas en -80 ° C hasta su posterior uso.
   8. Secar las preparaciones durante 7 minutos. y lavar con PBS para eliminar octubre Wipe la corredera con una toalla de tejido o de papel para eliminar el exceso de agua, de montaje en cubreobjetos con medio que contiene DAPI de montaje y visualizar con filtro de GFP bajo el microscopio.
   9. Cuantificar metástasis GFP (figura 3A) con el uso de software apropiado ^14.
4. Histología y Patología Digital
   1. Haga clic en el botón de carga manual bajo la pestaña de inicio y esperar a la celebración de la diapositiva estante para expulsar desde el escáner.
   2. Tome la sección de tejido teñida con H & E, limpiarlo con el tejido para eliminar la suciedad, y colocarlo de forma segura en la parrilla corrediza sostiene.
   3. Introduzca la descripción de diapositivas en la ventana lanzada hacia arriba.
   4. Seleccione la pestaña del área de escaneado en la ventana de la consola de imágenes SS y ajustar el cuadrado verde para definir la región de interés (ROI) que deben analizarse.
   5. Arrastre el diamante azul de calibración a una parte clara de la corredera, donde el tejido está ausente, sin embargo, dentro de la ROI.
   6. A continuación, seleccione el enfoque PUNTOS ficha y haga clic en el botón de selección automática para obtener varios puntos de enfoque (amarillo signos más) sobre el tejido en el retorno de la inversión.
   7. Si es necesario, colocar puntos de enfoque adicionales de forma manual haciendo doble clic en el retorno de la inversión.
   8. Proceder a la pestaña de calibración y seleccione el botón de calibración para comenzar la calibración de diapositivas en el punto de calibración azul diamante. Una vez completada la calibración se mostrará la imagen desde el punto de calibración.
   9. Inspeccionar esta imagen para asegurarse de que es clara y libre de suciedad o artefactos.
   10. Proceder a la ficha Escanear y seleccione Iniciar análisis para iniciar la digitalización de la ROI. Sección histológica escaneada se convierte en un portaobjetos digital (Figura 3B y 4A)
   11. Cuantificar carga metastásico como se describe anteriormente (Figura 4B) ^14.

5. citometría de flujo (FACS) Análisis de los macrófagos alveolares en los Pulmones

1. Preparación de Suspensiòn de los organismos unicelularesen
   1. Después de formación de imágenes y el recuento de metástasis, se lavan los pulmones con PBS estéril y colocar a la placa de Petri. Hacer 1 - 2 mm piezas de los pulmones utilizando tijeras quirúrgicas y fórceps.
   2. La transferencia de las piezas de pulmón al tubo cónico de 15 ml con 3 ml del tampón de digestión que contiene 1 mg / ml de colagenasa P, 0,04 mg / ml de DNasa I, y 10 g / medio RPMI inhibidor de tripsina disuelto ml (estéril).
   3. Incubar el tubo cónico en un agitador que gira en la incubadora a 37 ° C durante 40 min.
   4. Retire el tubo cónico de la incubadora y la pipeta la solución de arriba a abajo para disociar el tejido.
   5. Hacerlo pasar a través del filtro de 40 micras para evitar grumos y obtener una suspensión de células individuales. Si es necesario, para desintegrar mejor el tejido digerido prensa tejido contra el filtro de células con la ayuda de un émbolo de jeringa.
   6. Cuando se ha conseguido una suspensión de células, recoger las células por centrifugación y lisis de las células rojas de la sangre con2 ml de tampón ACK para 10 min a TA. A continuación, lavar un pellet dos veces en 8 ml de RPMI.
   7. Resuspender las células en 3 ml del medio RPMI completo y proceder al recuento de células usando el analizador de la viabilidad celular según las instrucciones del fabricante.
2. La tinción de las células pulmonares de los marcadores de superficie
   NOTA: lleve a cabo todas las incubaciones a 4 ° C. placa de centrifugar a 500 x g y 4 ° C.
   1. Pipeta de 1 x 10 ⁶ células en 100 l de tampón FACS (1% de FBS en PBS) a los pocillos individuales de una placa de 96 pocillos de fondo en V. El uso de una placa de fondo en V de 96 facilita la entrega de múltiples muestras.
   2. Pre-incubar la suspensión de células con 1 g de Fc de ratón Bloquear purificado anti-ratón CD16 / CD32 en 100 l de tampón FACS para 15 min. Centrifugar la placa de 96 pocillos de fondo en V para sedimentar las células y eliminar el sobrenadante por voltear la placa y dejar que el drenaje de la solución.
   3. Para la tinción de superficie, por adelantado, diluir los anticuerpos a Murinantígenos correos en un tubo (mezcla maestra): BV605 CD45 (30-F11), PE CD11b (M1 / 70), PE / Cy7 F4 / 80 (BM8), APC / Cy7 CD11c (N418), PerCPCy5.5 I ^A / I ^E (MHCII) (M5 / 114.152), PE CD80 (16-10A1), AF 647 CD86 (GL-1) a una concentración final de 2,5 mg / ml en tampón FACS que contiene 10 g / ml de Fc bloque de CD16 / CD32 anticuerpo.
      NOTA: Este conjunto de anticuerpos es útil para la identificación y la evaluación de un estado funcional de macrófagos alveolares y células dendríticas.
   4. Añadir 100 l de anticuerpos diluidas (mezcla principal) a los pocillos de la placa de pocillos de fondo en V 96 y se incuba a 4 ° C durante 30 min.
   5. Se centrifuga la placa para sedimentar las células y eliminar el sobrenadante como en 5.2.2. Lavar las células con 200 l de tampón de FACS, se centrifuga a 500 g durante 5 min. Eliminar el sobrenadante como en 5.2.2. y resuspender las células en 200 l de PBS.
   6. Se centrifuga la placa para sedimentar las células y añadir colorante de viabilidad diluido en PBS (1: 1.000). Incubar durante 20 minutos a 4 ° C.
   7. Se centrifuga la placa para sedimentar las células y eliminar el sobrenadante como en 5.2.2. Se lava con 200 l de PBS y centrifugar la placa de nuevo.
   8. Resuspender las células en 100 l de paraformaldehído al 1% y se almacena a 4 ° C hasta el momento de la adquisición por parte de instrumento FACS. Antes de suspensiones de células de transferencia de adquisición a los tubos de polipropileno de FACS.

6. Análisis de los datos de FACS: Estrategias de apertura de puerta y la determinación de las subpoblaciones de células

1. Realizar análisis FACS como se informó anteriormente ^10. Puerta adquirió células / eventos basados ​​en el Reenvío (FSC) y dispersión lateral (SSC); y luego puerta en vivo y CD45 ⁺ células. Para la identificación de los macrófagos alveolares, puerta CD11b-negativos y luego las células CD11c ⁺ F4 / 80 ^+. (Figura 5A).

Resultados

La inyección de las células tumorales 4T1-GFP en la almohadilla de grasa mamaria conduce a la formación de tumores de ratón (figura 1A) que recapitular la propagación metastásica del cáncer de mama humano, como metástasis se forman rápidamente en los pulmones (Figura 2), hígado, huesos y el cerebro de los ratones ^11. La transfección estable de células 4T1 con GFP facilita el seguimiento del crecimiento del tumor (Figura 1B)...

Discusión

The recent insights into cancer biology and causative factors involved in carcinogenesis and tumor progression lead to development of genetically engineered mouse (GEM) models of cancer, in which tumors grow spontaneously, usually over a period of several months¹⁵. Although these tumor models appear to reflect better the natural history of human malignancies than xenografts or syngeneic models, much time required for tumor development and various degrees of malignant phenotype penetrance limit the use of these...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
4T1 cell line	American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	CRL 2539	Tumor cells
4T1-GFP cell line	Caliper life sciences/ Perkin Elmer, Waltham, MA, USA	BW128090	Tumor cells
RPMI	Corning, Corning, NY, USA	10-040-CM	Media
Heat inactivated FBS	Gibco (Thermo Scientific), USA	10082147	Media
Penicillin Streptomycin	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	MT-300-02-CI	Media
PBS	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	BP399-20	Dilute with distilled water
Trypsin 0.25% with EDTA	Hyclone, Logan, Utah, USA	SH30042.02	Tissue culture supplies
T75 cm2 flask	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	12-565-32	Tissue culture supplies
15 ml conical tube	BD falcon, Franklin Lakes, NJ, USA	352096	Tissue culture supplies
50 ml conical tube	BD falcon, Franklin Lakes, NJ, USA	352098	Tissue culture supplies
60 mm2 Petri dish	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	AS4052	For lung imaging
Isoflurane (Isothesia)	Butler Schein Animal health, Dublin, OH, USA	NDC 11695-6776-2	Mouse anesthesia
Clodronate liposomes	Formumax Scientific Inc, Palo Alto, CA, USA	F70101C-N	Macrophages depletion
Control liposomes	Formumax Scientific Inc, Palo Alto, CA, USA	F70101-N	Control PBS-liposomes
29 gauge insulin syringes (12.7 mm and 0.5 ml capacity)- Reli-On	Walmart, Bentonville, AR, USA		For tumor cell injection
Hair removal cream (Nair)	Walmart, Bentonville, AR, USA
Paraformaldehyde solution (4%)	Affymetrix, Santa Clara, CA, USA	19943-I Lt	Dilute to 4% or 1% using 1x PBS
OCT compound	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	230-730-571	For freezing tissue in cryomolds
Fluoro-Gel-II with DAPI	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	17985-51	Mounting medium
Sucrose	Sigma, St. Louis, MO, USA	S-9378	Cryopreservation
Collagenase P	Roche, Basel, Switzerland	11249002001	Components of tissue digestion buffer
Dnase I	Roche, Basel, Switzerland	10104159001	Components of tissue digestion buffer
Trypsin inhibitor	Sigma, St. Louis, MO, USA	T9253	Components of tissue digestion buffer
40 micron cell strainers	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	22-363-547	Used in tissue digestion to remove clumps
Trustain FcX-Fc Block (CD16/CD32)	Biolegend, San Diego, CA, USA	101320	Antibodies for flow cytometry
BV605 CD45	Biolegend, San Diego, CA, USA	103139	Antibodies for flow cytometry
PE CD11b	Biolegend, San Diego, CA, USA	101207	Antibodies for flow cytometry
PE Cy7 F4/80	Biolegend, San Diego, CA, USA	123113	Antibodies for flow cytometry
APC/Cy7 CD11c	Biolegend, San Diego, CA, USA	117323	Antibodies for flow cytometry
PerCPcy5.5 IA/IE (MHCII)	Biolegend, San Diego, CA, USA	107625	Antibodies for flow cytometry
PE CD80	Biolegend, San Diego, CA, USA	104707	Antibodies for flow cytometry
AF647 CD86	Biolegend, San Diego, CA, USA	105019	Antibodies for flow cytometry
Fixable viability Dye eflour 506	eBioscience, San Diego, CA,USA	65-0866	Antibodies for flow cytometry
Cryostat	Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA	CM1850	Cryosectioning
UVP iBox Explorer	UVP Inc, Upland, CA, USA		Mouse and lung fluorescent imaging
Aperio Scanscope CS	Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA		Digital pathology
BD LSRFortessa	BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA		Flow cytometry/data acquisition
Nikon A1 confocal TE2000 microscope	Nikon Instruments Inc., Melville, NY 11747-3064, U.S.A.		Imaging and quantifying GFP fluorescence in lung cryosections
UVP visionworks software (Version 7.1RC3.38)	UVP Inc, Upland, CA, USA		Imaging software for iBOX
Aperio Imagescope software (v12.1.0.5029)	Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA		Imaging software for analysis of digital slides
Flow JO software (version 9.8.1)	Flow JO LLC, Ashland, OR, USA		Analysis of flow cytometric data
NIS Elements AR (version 4.20.01) 64 Bit	Nikon Instruments Inc., Melville, NY 11747-3064, U.S.A.		Acquisition and analysis of lung cryosections for GFP