유방암 전이에 폐포 대 식세포의 역할을 공부

요약

Here we describe the model and approach to study functions of pulmonary alveolar macrophages in cancer metastasis. To demonstrate the role of these cells in metastasis, the syngeneic (4T1) model of breast cancer in conjunction with the depletion of alveolar macrophage with clodronate liposomes was used.

초록

This paper describes the application of the syngeneic model of breast cancer (4T1) to the studies on a role of pulmonary alveolar macrophages in cancer metastasis. The 4T1 cells expressing GFP in combination with imaging and confocal microscopy are used to monitor tumor growth, track metastasizing tumor cells, and quantify the metastatic burden. These approaches are supplemented by digital histopathology that allows the automated and unbiased quantification of metastases. In this method the routinely prepared histological lung sections, which are stained with hematoxylin and eosin, are scanned and converted to the digital slides that are then analyzed by the self-trained pattern recognition software. In addition, we describe the flow cytometry approaches with the use of multiple cell surface markers to identify alveolar macrophages in the lungs. To determine impact of alveolar macrophages on metastases and antitumor immunity these cells are depleted with the clodronate-containing liposomes administrated intranasally to tumor-bearing mice. This approach leads to the specific and efficient depletion of this cell population as confirmed by flow cytometry. Tumor volumes and lung metastases are evaluated in mice depleted of alveolar macrophages, to determine the role of these cells in the metastatic progression of breast cancer.

서문

The premetastatic niche is an important process in cancer metastasis defined as a set of alterations that occur in the organs that are targets for metastases prior to arrival of tumor cells^1,2. Therefore, therapeutic targeting of this step of cancer progression may prevent metastases to the vital organs that cause approximately 90% of cancer-associated deaths. Although the concept of the premetastatic niche, also known as the "seed and soil" theory, was introduced more than a century ago, no experimental proof has been provided until recently, when the bone marrow-derived cells were demonstrated to contribute to the premetastatic soil^1,3-7. Despite these developments, the premetastatic niche remains a largely understudied aspect of cancer pathophysiology and further research to identify cellular players and mechanisms involved is needed.

Here we report the in vivo approaches to study the role of alveolar macrophages in breast cancer metastases and the lung premetastatic niche. The alveolar macrophages arrive to the lungs early during the embryonic development and self-renew there during adulthood⁸. They also have important immunomodulatory and homeostatic functions including the protection of this organ from undesired inflammatory responses to the environmental innocuous antigens⁹. Therefore, we hypothesize that tumors exploit this physiological immunosuppression, imposed by alveolar macrophages, and, consequently, alveolar macrophages contribute to the lung premetastatic niche by suppressing antitumor immunity. This hypothesis is supported by our recent report demonstrating that the specific depletion of these cells reduces lung metastases and enhances antitumor T cell responses¹⁰.

For these studies we apply a well-established syngeneic model of breast cancer (4T1), which mimics stage IV metastatic breast cancer¹¹; and has been previously reported in studies of the premetastatic niche⁶. To track metastasizing tumor cells in vivo we use 4T1 cells expressing GFP (4T1-GFP) in conjunction with animal imaging and confocal microscopy. We focus on the lung premetastatic niche, since this organ is one of the most common targets of hematogenous metastases of human malignancies¹². To investigate functions of alveolar macrophages in the premetastatic niche, we use clodronate liposomes to deplete these cells¹³; and evaluate impact of this depletion on lung metastases. Of note, this method specifically depletes alveolar macrophages but no other phagocytic cells in the lungs or in circulation¹⁰.

프로토콜

모든 동물 연구는 국립 보건원 (National Institutes of Health)에서 발표 한 "실험 동물의 관리 및 사용을위한 가이드"에 설명 된 지침을 기관 동물 관리 및 텍사스 테크 대학 보건 과학 센터의 사용위원회의 승인을 이어왔다. 상업적으로 사용할 수있는 팔주 십이 세 여성 BALB / c 마우스를 사용합니다. 주사 1 × 10 ⁵ 4T1 또는 1 × 유방 지방 패드로 다양한 업체에서 구입할 수 있습니다 GFP를 표현하는 10 ⁵ 4T1 세포.

1. 4T1의 문화와 4T1-GFP 세포 및 주사 ^(14)에 대한 종양 세포 현탁액의 준비

1. 4T1 및 4T1-GFP 세포 배양
   참고 : 달리 명시하지 않는 한 층류 (LAF) 생물 안전 캐비닛에 멸균 솔루션을 사용하여 모든 단계를 수행합니다.
   1. RPMI 배지에서 4T1 및 4T1-GFP 세포는 10 % 열 불 활성화 소 태아 혈청, 100 U / ㎖ 페니실린를 유지한다G 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 황산염.
      주 : 셀의 모든 트립신 처리 및 도금을 계산하여 통로 번호를 확인합니다. 통로의 수는 세포의 발암 및 전이성 전위 영향으로는, 모든 마우스 실험 동일한 통로 번호 세포를 사용하는 것이 중요하다.
   2. 세포 주입에 앞서 인큐베이터 및 흡 배지에서 80 % 컨 플루 언시에 종양 세포를 함유하는 상기 ² cm T75 플라스크를 제거한다. PBS의 10 ML을 추가하고 나머지 매체를 씻어 부드럽게 플라스크를 회전 한 후 PBS를 대기음.
   3. 플라스크에 EDTA와 0.25 % 트립신 2 ㎖를 첨가하고, 5 % CO _2로 37 ℃에서 3 분 동안 습한 인큐베이터에서 표면에 균일 용액을 분산 및 배양 기울.
   4. 세포의 분리를 용이하게하고 신선한 매체의 8 ml에 추가 할 수있는 플라스크를 누릅니다. 최대 피펫 아래로 여러 번 덩어리를 중단하고 단일 세포 현탁액을 얻을 수 있습니다.
   5. 5 분 동안 원심 분리기 세포. 실온에서 500 XG에.뜨는을 기음과 PBS 10ml에 세포를 씻는다.
   6. 최대 피펫 아래로 여러 번 덩어리를 중단하고 단일 세포 현탁액을 얻을 수 있습니다. 세포 현탁액 100 ㎕를 취하여 제조자의 지시에 따라 세포 생존력 분석을 이용하여 세포 수를 계산.
   7. 실험에 사용 된 마우스의 마우스 X 번호 당 10 ⁵ 세포 (항상 안전을 위해 여분의 세포를 준비) : 공식을 사용하여 모든 주사에 필요한 세포의 수를 계산합니다.
   8. 1.1.5에서와 같이 원심 분리기 세포. 신선한 PBS의 양 흡입 재현 탁하고 세포를 통해 상청액을 제거하여 1 × ¹⁰⁶ 세포 / ml의 최종 세포 농도를 얻기 위해 필요한. 주입을위한 준비가 될 때까지 얼음에 세포 현탁액을 유지합니다.
2. 4T1 또는 4T1-GFP 세포 주입 마우스 절차
   1. 종양 세포 주입 전날, 3 % 이소 플루 란 유도 챔버 마우스 마취. 마우스가 잠 정기적으로 호흡하면, 장소 t그는 코 콘 내부 코 수술 패드 마우스와 이소 플루 란 기화기에 연결합니다. 2.5 %의 이소 플루 란으로 마취를 유지한다. 마우스가 마취되어 있는지 확인하기 위해 마우스 발가락을 꼬집어.
   2. 주사 부위에 면봉 (오른쪽 가슴 유방 지방 패드)를 사용하여 제모 크림을 적용하고 2 분 동안 기다립니다. 젖은 종이 타월을 사용하여 사이트를 청소, 다시 케이지에 마우스를 놓고는 흉골 드러 누움을 유지하기에 충분한 의식을 회복 할 때까지 동물을 모니터링 할 수 있습니다.
   3. 주사 당일 1.2.2과 쥐를 마취하고 수술 용 패드 위에 놓는다.
   4. 균일 한 세포 현탁액을 얻기 위해 종양 세포를 함유하는 튜브를 소용돌이. 대기음 0.5 ml의 인슐린 주사기에 1 × 105 ^개 종양 세포를 함유하는 세포 현탁액 100 ㎕ (29 G 12.7 mm 바늘 길이).
   5. 2 ^차 및 3 ^차 젖꼭지 근처에 엄지 손가락 인덱스를 사용하여 피부를 들어 올려 mammar에 주사기의 바늘을 삽입Y 지방 그냥 손가락 사이의 피부 아래에 세 번째 젖꼭지 아래 패드와 주입 세포는 천천히 거품 (피하 주사)을 형성한다.
   6. 다시 주입 후 케이지에 마우스를 놓고 1.2.2에서와 같이 모니터링 할 수 있습니다.
3. 모니터링 종양 성장
   1. 캘리퍼스 측정 ⁽¹⁴⁾
      참고 : 4T1 주조 또는 4T1-GFP 세포는 공격적인 유방 종양을 형성한다. 세포 접종 후 5 - 일반적으로 만져서 알 수있는 종양은 4 일에서 ~ 나타납니다. 4T1-GFP 세포는 느리게 성장하고 나중에 전이를 제공 종양을 형성한다. 종양을 2 ~ 3 배 일주일을 측정합니다. 동물의 임상 적 상태가 악화되면 동물 종양 체중의 10 %를 초과하거나 즉시 마우스를 안락사, 궤양되고, 10 % 이상의 체중을 잃는다.
      1. . 1.2.1에서와 같이 마우스를 마취 수술 패드 장소 무게와 70 % 에탄올로 영역을 적시고.
      2. (- 오일 세포 접종 후 4) 주사 부위에 종양이 만져.
      <리> 캘리퍼와 가장 큰 직경 (D) 및 작은 직경 (D1)을 측정한다.
      3. 식 볼륨 = (DX (D1)의 X의 D1) / 2mm ^3를 사용하여 종양 체적을 계산합니다. 1.2.2에서와 같이 마취에서 마우스 복구를 모니터링합니다.
   2. 이미징 (전용에 대한 4T1 GFP 세포)
      1. 1.2.1와 같이 마우스를 마취. 이미징 기기 내부의 가동 단계에 마우스를 놓습니다. 코 콘을 통해 마취를 유지한다.
      2. 이미징 기기 및 제조업체의 지침에 따라 광원을 켭니다.
      3. 탭 "취득"에서 "조명"으로 이동하여 백색광의 빈 위치 (아무 필터)로 전환합니다. 빛 엔진이 켜져 있는지 확인하고 라이트 테이블에 '트랜스'를 선택합니다.
      4. 탭 "현미경"에서 "지우기"배출 필터와 0.5X 배율을 선택합니다. "카메라"탭에서 캡처 비닝하는 '1 × 1'미리보기 '는 4 × 4'인지 확인하십시오.
      5. 흰색 빛 종양의 위치를​​ 미리보기를 클릭 선명한 영상을 얻을 수 초점을 캡처을 클릭합니다.
      6. 1 (제조업체의 지시에 따라 GFP에 대한 필터) 필터링 "취득"탭을 변경 조명으로 이동합니다. 은 "현미경"탭에서 "20분의 530의 GF"에 방출 필터를 변경합니다. 녹색 채널의 미리보기 및 캡처 이미지. 적절한 밝기를 얻을 노출 시간을 조정합니다.
      7. 이미지에 사색을 적용하고 해당 폴더 (그림 1)에 저장합니다.

리포좀 ¹⁰ 2. 비강 관리

참고 : 달리 명시하지 않는 한 층류 (LAF) 생물 안전 캐비닛에 멸균 솔루션을 사용하여 모든 단계를 수행합니다.

1. 종양 세포 주입 후 6 일째 1.2.1에서와 같이 마우스 마취.
2. 제조업체에서 얻은 클로드 또는 제어 (PBS) 리포좀 현탁액을 소용돌이. 리포좀의 μL (60)를 타고uspension 멸균 피펫 팁을 사용.
3. 천천히, 마우스 용액에 숨을 쉴 수 있도록 콧 구멍 근처 (5 ㎕를 각 시간) 리포좀 솔루션을 출시 60 μL의 전체 용량이 투여 될 때까지 반복합니다.
4. 마우스가 케이지에 다시 배치하기 전에 의식을 회복하자.
5. 반복 리포좀 관리는 마우스까지 3 일마다 희생된다. 희생의 날에 리포좀을 관리하지 마십시오.

3. 마우스의 희생과 조직 컬렉션

참고 : 사용 멸균 및 마우스 해부에 대한 무균 악기. 동안 중요한 장기의 방혈 및 제거를 통해 마취 쥐를 안락사.

1. 일 22 또는 일 (4T1 셀) (26) 종양 세포 주입 후 (4T1-GFP 세포) 1.2.1에서와 같이 마우스를 마취. 그리고, 기화기에 연결된 코 콘 수술 패드에 배치 1.2.1에서와 같이 마취를 유지한다. m 개의 않도록 발가락 중 하나를 꼬집어여러개 의식이다.
2. 해부 보드에 바늘을 사용하여 발가락을 고정. 마우스 피부에 에탄올을 스프레이.
3. 집게를 사용하여 피부를 들어 올려 수술 가위로 절개를합니다. 천천히 복막을 노출하고 목까지 흉부 피부를 통해 절단을 계속합니다.
4. 수술 가위를 사용하여 복막에 절개를하고, 혈관의 손상을 방지면 팁 신중 장기 노출.
5. 한쪽으로 장기를 이동하고 하대 정맥을 노출. 정맥에 구멍과 29 G 인슐린 주사기로 피를 수집합니다. 튜브에 수집 된 혈액을 놓고 추가 처리를 위해 얼음에 둡니다.
6. 흉곽, 폐와 심장을 노출 다이어프램을 잘라. 천천히 뼈 커터를 사용하여 양쪽의 갈비뼈를 잘라 흉곽의 상단을 들어 올립니다. 집게로 마음을 잡고 흉강에 심장과 폐를 연결하는 결합 조직을 잘라.
7. 60 mm 단위 PBS 소량의 폐 배치면역 형광 현미경 또는 [헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E) 염색 포함] 루틴 조직학에 대한 동결 절편에 이미징 및 추가 처리를 위해 준비 될 때까지 얼음에 페트리 접시.

4. 폐 전이 평가

1. 표면 전이 계산 및 채점
   1. 해부 현미경으로 폐와 페트리 접시를 놓습니다. 폐 표면의 밝은 전망을 얻기 위해 초점을 맞 춥니 다.
   2. 해부 현미경을 사용하여 폐 표면을 관찰한다. 모두 폐의 전방 및 후방 측면에 전이를 계산합니다.
      주 : 정상적인 폐는 약간 흰 또는 분홍빛 및 다공성 구조와 같은 스폰지가 있습니다. 4T1 전이 종종 액체 (도 2A) 한 방울과 유사하게 나타나, 단단하고 비 다공성이다.
2. 폐 영상
   1. 이미징 기기 내부의 이동식 무대에서 폐와 페트리 접시를 놓습니다.
   2. 악기와 켭니다멀티 스펙트럼 소스를 biolite. 소프트웨어를 엽니 다. 탭에서, "취득", "조명"로 이동하여 백색광 빈 위치 (아무 필터)로 전환합니다. 라이트 엔진 -> ON, 라이트 테이블 -> 에피. 탭 '현미경'에서 '지우기'방출 필터와 1.66X 배율을 선택합니다. "카메라"탭에서 캡처 비닝하는 '1 × 1'미리보기 '는 4 × 4'인지 확인하십시오.
   3. 미리보기를 클릭하고 흰색 빛 폐의 명확한 그림을 얻을 캡처를 클릭하여 초점을 맞 춥니 다.
   4. (제조업체의 지시에 따라 GFP에 대한 필터) 필터 1 "취득"탭과 변화에 이동합니다. 은 "현미경"탭에서 "20분의 530의 GF"에 방출 필터를 변경합니다. 녹색 채널의 미리보기 및 캡처 이미지. 적절한 밝기를 얻을 노출 시간을 조정합니다.
   5. 이미지에 사색을 적용하고 해당 폴더에 저장합니다.
   6. 유사한 방식으로, 다른 쪽의 화상을 얻기 위해 폐 플립. 이 PROCedure 더 적절한 소프트웨어 (그림 2B) ^(14)를 사용하여 정량화 할 수있다 GFP 양성 전이의 이미지를 생성합니다.
3. 면역 형광 현미경
   1. 어두운 곳에서 4 시간 동안 4 ℃에서 4 % 파라 포름 알데히드에서 폐 수정.
   2. 완전히 정착을 제거하기 위해 5 분 동안 10 ml의 PBS로 두 번 조직을 씻으십시오. PBS의 18 % 자당에 전송하고 4 ℃에서 O / N을 품어.
   3. 자당에서 조직을 제거하고 초과를 줘봐.
   4. cryomold을 가지고, 간섭 단층 매체와 바닥 층을 커버한다. 간섭 단층 매체에 조직을 놓습니다. 완전히 드라이 아이스의 조직과 장소를 커버하는 간섭 단층 매체와 금형을 입력합니다.
   5. 절편 때까지 -80 ° C에서 보관 블록.
   6. 충전 슬라이드에 저온 유지 장치와 장소 5 μm의 두께 섹션을 준비합니다.
   7. 또한 사용 때까지 -80 ° C에서 사용되지 않는 슬라이드를 저장합니다.
   8. 공기는 7 분 동안 슬라이드를 건조. 및 OCT를 제거하는 PBS로 세척. WIP전자 조직이나 종이 타월로 슬라이드 물을 초과를 제거 DAPI를 포함하는 매체를 장착하여 커버 슬립을 탑재하고 현미경으로 GFP 필터를 시각화한다.
   9. 적절한 소프트웨어 ^(14)의 사용과 GFP 전이 (도 3A)을 정량화.
4. 조직학 및 디지털 병리학
   1. 시작 탭에서 수동로드 버튼을 클릭하고 스캐너에서 배출 랙을 들고 슬라이드를 기다립니다.
   2. 의 H & E 염색 조직 절편을 가지고있는 먼지를 제거 티슈로 청소하고, 슬라이드 들고 랙에 안전하게 배치합니다.
   3. 팝 업 창에서 슬라이드 설명을 입력합니다.
   4. 친위대 영상 콘솔 창에서 스캔 영역 탭을 선택하고 관심 (ROI)의 영역 스캔 할을 정의 할 수있는 녹색 사각형을 조정합니다.
   5. 조직이 투자 수익 (ROI) 내에서, 그러나, 결석 슬라이드의 명확한 부분에 푸른 교정 다이아몬드를 드래그합니다.
   6. 다음으로, 초점 P를 선택oints 탭은 ROI의 조직에 여러 개의 초점 포인트를 얻을 수있는 자동 선택 버튼 (노란색 더하기 기호)를 클릭합니다.
   7. 필요한 경우, 투자 수익 (ROI) 내에서 두 번 클릭하여 수동으로 추가 초점 포인트를 놓습니다.
   8. 교정 탭으로 이동하고 푸른 교정 다이아몬드 포인트에서 슬라이드 교정을 시작하기 위해 보정 버튼을 선택합니다. 교정이 완료된 후, 교정 포인트의 이미지가 표시된다.
   9. 이 명확하고 먼지 나 유물이 없는지 확인하기 위해이 이미지를 검사합니다.
   10. 스캔 탭으로 이동하고, 투자 수익 (ROI)의 스캔을 시작하기 위해 스캔 시작을 선택합니다. 스캔 조직 학적 섹션은 디지털 슬라이드로 변환된다 (그림 3B 및 4A)
   11. 이전에 (그림 4B) ⁽¹⁴⁾ 설명에 따라 전이성 부담을 정량화.

폐의 폐포 대 식세포 5. 유동 세포 계측법 (FACS) 분석

1. 단일 셀 Suspensi의 준비...에
   1. 이미징 및 전이 계산 한 후, 멸균 PBS로 폐를 씻어 페트리 접시에 놓습니다. 수술 가위와 집게를 사용하여 폐의 2mm 조각 - 1을 확인합니다.
   2. (3) 1 ㎎ / ㎖의 콜라게나 P, 0.04mg / ㎖의 DNase I을 함유하는 분해 완충액 ㎖, 10 μg의 / ㎖ 트립신 용해 억제제 RPMI 배지 (멸균)과 15ml의 원뿔형 튜브에 폐 조각을 전송.
   3. 40 분 동안 37 ° C의 배양기에서 회전 진탕 기에서 인큐베이션 원추형 튜브.
   4. 조직을 떼어 놓다 아래로 인큐베이터에서 튜브 원뿔을 제거하고 솔루션을 피펫합니다.
   5. 덩어리를 방지하고 단일 세포 현탁액을 얻을 수있는 40 μm의 여과기를 통해 솔루션을 전달합니다. 필요한 경우, 주사기 플런저의 도움으로 셀 스트레이너에 대해 더 잘 소화 조직 프레스 조직을 분해합니다.
   6. 단일 세포 현탁액이 달성되면, 원심 분리하여 세포를 수집하고으로 적혈구를 용해시키기RT에서 10 분 동안 ACK 완충액 2 ㎖. 그 후, RPMI 8 ml의 펠릿 두 번 세척 하였다.
   7. 전체 RPMI 배지 3 ㎖와에 재현 탁 전지는 제조업체의 지침에 따라 세포 생존 분석기를 사용하여 계산 셀로 진행합니다.
2. 표면 마커에 대한 폐 세포의 염색
   참고 : 4 ° C에서 모든 배양을 수행합니다. 500 XG, 4 ℃에서 원심 분리기 판.
   1. 피펫 V 바닥 96 웰 플레이트의 각각의 웰을 FACS 완충액 (PBS에 1 % FBS) 100 ㎕에 1 × ¹⁰⁶ 세포. V 자 바닥 96 웰 플레이트를 사용하면 여러 샘플을 나눠을 용이하게한다.
   2. 1 μg의 마우스와 차단 된 Fc 세포 현탁액을 사전 부화 15 분 동안 FACS 완충액 100 ㎕의 CD32 / 항 - 마우스 CD16 정제. 세포 펠렛과 판을 뒤집기 및 솔루션 드레인을 시켜서 뜨는을 제거하는 V 바닥 96 웰 플레이트를 원심 분리기.
   3. 표면 얼룩의 경우, 사전에 murin에 대한 항체를 희석하나의 튜브 (마스터 믹스)에 전자 항원 : BV605 CD45 (30-F11), PE CD11b를 (/ 70 M1), PE / Cy7 F4 / 80 (BM8), APC / Cy7의 CD11c (N418), PerCPCy5.5 I ^A / 된 Fc 블록 CD16 10 ㎍ / ml를 함유 FACS 완충액 중 2.5 ㎍ / ml의 최종 농도 I ^E (MHCII) (M5 / 114.152) PE CD80 (16-10A1) AF 647 CD86 (GL-1) / CD32 항독소.
      참고 : 항체의이 세트는 식별 및 폐포 대 식세포와 수지상 세포의 기능 상태를 평가하는 데 유용합니다.
   4. V 자 바닥 96 웰 플레이트에 희석 항체 (마스터 믹스) 100 μl를 추가하고 30 분 동안 4 ℃에서 배양한다.
   5. 세포 펠렛 및 5.2.2에서와 같이 뜨는을 제거하기 위해 플레이트를 원심 분리기. 5 분 동안 500g에 FACS 버퍼 200 μL, 원심 분리기로 세포를 씻으십시오. 5.2.2에서와 같이 뜨는을 제거합니다. 및 PBS 200 ㎕의 세포를 재현 탁.
   6. PBS (1,000 일)에 희석 가능성 염료를 세포 펠렛을 추가 할 수있는 판을 원심 분리기. 4 ℃에서 20 분 동안 품어.
   7. 세포 펠렛 및 5.2.2에서와 같이 뜨는을 제거 할 수있는 판을 원심 분리기. PBS 200 μL로 세척하고 다시 접시를 원심 분리기.
   8. FACS 악기에 의해 인수 될 때까지 4 ° C에서 1 % 파라 포름 알데히드 및​​ 저장 100 ㎕에 재현 탁 세포. 폴리 프로필렌 FACS 튜브에 수집 전송 세포 현탁액에 앞서.

6. FACS 데이터의 분석 : 게이팅 전략과 세포의 부분 집단의 식별

1. 이전에 ^{(10)를보고} FACS 분석을 수행합니다. 게이트 셀 포워드 (FSC)을 기반으로 / 이벤트 및 측면 산란 (SSC)를 취득; 다음 라이브 게이트와 CD45 ⁺ 세포. 폐포 대 식세포 식별, 게이트 부정적인 CD11b를-다음의 CD11c ⁺ F4 / 80 ⁺ 세포. (도 5a).

결과

전이가 빠르게 폐 (도 2), 간, 뼈 형성으로 유방 지방 패드로 4T1-GFP 종양 세포의 주입은, 인간 유방암 전이 확산 요점을 되풀이 마우스 종양 (도 1a)의 형성을 유도 와 마우스 ^(11)의 뇌. GFP와 4T1 세포의 안정한 형질 감염은 종양 성장의 모니터링을 용이하게한다 (도 1B), 전이되는 종양 세포의 추적 및 전이성 부담 (도 2B, 3B)을...

토론

The recent insights into cancer biology and causative factors involved in carcinogenesis and tumor progression lead to development of genetically engineered mouse (GEM) models of cancer, in which tumors grow spontaneously, usually over a period of several months¹⁵. Although these tumor models appear to reflect better the natural history of human malignancies than xenografts or syngeneic models, much time required for tumor development and various degrees of malignant phenotype penetrance limit the use of these...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
4T1 cell line	American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	CRL 2539	Tumor cells
4T1-GFP cell line	Caliper life sciences/ Perkin Elmer, Waltham, MA, USA	BW128090	Tumor cells
RPMI	Corning, Corning, NY, USA	10-040-CM	Media
Heat inactivated FBS	Gibco (Thermo Scientific), USA	10082147	Media
Penicillin Streptomycin	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	MT-300-02-CI	Media
PBS	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	BP399-20	Dilute with distilled water
Trypsin 0.25% with EDTA	Hyclone, Logan, Utah, USA	SH30042.02	Tissue culture supplies
T75 cm2 flask	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	12-565-32	Tissue culture supplies
15 ml conical tube	BD falcon, Franklin Lakes, NJ, USA	352096	Tissue culture supplies
50 ml conical tube	BD falcon, Franklin Lakes, NJ, USA	352098	Tissue culture supplies
60 mm2 Petri dish	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	AS4052	For lung imaging
Isoflurane (Isothesia)	Butler Schein Animal health, Dublin, OH, USA	NDC 11695-6776-2	Mouse anesthesia
Clodronate liposomes	Formumax Scientific Inc, Palo Alto, CA, USA	F70101C-N	Macrophages depletion
Control liposomes	Formumax Scientific Inc, Palo Alto, CA, USA	F70101-N	Control PBS-liposomes
29 gauge insulin syringes (12.7 mm and 0.5 ml capacity)- Reli-On	Walmart, Bentonville, AR, USA		For tumor cell injection
Hair removal cream (Nair)	Walmart, Bentonville, AR, USA
Paraformaldehyde solution (4%)	Affymetrix, Santa Clara, CA, USA	19943-I Lt	Dilute to 4% or 1% using 1x PBS
OCT compound	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	230-730-571	For freezing tissue in cryomolds
Fluoro-Gel-II with DAPI	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	17985-51	Mounting medium
Sucrose	Sigma, St. Louis, MO, USA	S-9378	Cryopreservation
Collagenase P	Roche, Basel, Switzerland	11249002001	Components of tissue digestion buffer
Dnase I	Roche, Basel, Switzerland	10104159001	Components of tissue digestion buffer
Trypsin inhibitor	Sigma, St. Louis, MO, USA	T9253	Components of tissue digestion buffer
40 micron cell strainers	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	22-363-547	Used in tissue digestion to remove clumps
Trustain FcX-Fc Block (CD16/CD32)	Biolegend, San Diego, CA, USA	101320	Antibodies for flow cytometry
BV605 CD45	Biolegend, San Diego, CA, USA	103139	Antibodies for flow cytometry
PE CD11b	Biolegend, San Diego, CA, USA	101207	Antibodies for flow cytometry
PE Cy7 F4/80	Biolegend, San Diego, CA, USA	123113	Antibodies for flow cytometry
APC/Cy7 CD11c	Biolegend, San Diego, CA, USA	117323	Antibodies for flow cytometry
PerCPcy5.5 IA/IE (MHCII)	Biolegend, San Diego, CA, USA	107625	Antibodies for flow cytometry
PE CD80	Biolegend, San Diego, CA, USA	104707	Antibodies for flow cytometry
AF647 CD86	Biolegend, San Diego, CA, USA	105019	Antibodies for flow cytometry
Fixable viability Dye eflour 506	eBioscience, San Diego, CA,USA	65-0866	Antibodies for flow cytometry
Cryostat	Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA	CM1850	Cryosectioning
UVP iBox Explorer	UVP Inc, Upland, CA, USA		Mouse and lung fluorescent imaging
Aperio Scanscope CS	Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA		Digital pathology
BD LSRFortessa	BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA		Flow cytometry/data acquisition
Nikon A1 confocal TE2000 microscope	Nikon Instruments Inc., Melville, NY 11747-3064, U.S.A.		Imaging and quantifying GFP fluorescence in lung cryosections
UVP visionworks software (Version 7.1RC3.38)	UVP Inc, Upland, CA, USA		Imaging software for iBOX
Aperio Imagescope software (v12.1.0.5029)	Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA		Imaging software for analysis of digital slides
Flow JO software (version 9.8.1)	Flow JO LLC, Ashland, OR, USA		Analysis of flow cytometric data
NIS Elements AR (version 4.20.01) 64 Bit	Nikon Instruments Inc., Melville, NY 11747-3064, U.S.A.		Acquisition and analysis of lung cryosections for GFP