Eliminación de<em&gt; Drosophila</em&gt; Tejido muscular de larvas Filetes para el análisis de inmunofluorescencia de las neuronas sensoriales y las células epidérmicas

Resumen

Los estudios de la morfogénesis neuronal utilizando Drosophila arborización dendrítica larval (DA) se benefician de las neuronas en la visualización in situ de las proteínas neuronales y epidérmicas por inmunofluorescencia. Se describe un procedimiento que mejora el análisis de inmunofluorescencia de DA neuronas y las células epidérmicas que rodean mediante la eliminación de tejido muscular de la pared del cuerpo de la larva.

Resumen

Arborización dendrítica (DA), las neuronas de larvas de Drosophila son un modelo popular para la investigación de los mecanismos de morfogénesis neuronal. Da neuronas desarrollan en comunicación con las células epidérmicas que inervan y por tanto su análisis de beneficios de la visualización in situ de las dos proteínas expresadas neuronalmente y epidérmicamente por inmunofluorescencia. Los métodos tradicionales de preparación de filetes de larvas para experimentos de inmunofluorescencia dejan intacto el tejido muscular que cubre la mayor parte de la pared del cuerpo, que presenta varios desafíos para la formación de imágenes proteínas neuronales y epidérmicas. Aquí se describe un método para eliminar el tejido muscular de Drosophila filetes de larvas. Este protocolo permite que las imágenes de las proteínas que se oscurece de otra manera por el tejido muscular, mejora la relación señal a ruido, y facilita el uso de super-resolución microscopía para estudiar da el desarrollo de la neurona.

Introducción

Arborización dendrítica (da), las neuronas de larvas de Drosophila proporcionan un modelo valioso para el estudio del desarrollo neuronal debido a su susceptibilidad a la manipulación genética y la facilidad con la que pueden obtenerse imágenes. Estas neuronas sensoriales han sido instrumentales en la identificación de numerosas vías que controlan la morfogénesis de dendritas ^1-3.

Cuatro clases de neuronas DA (clase I - IV) inervar la epidermis de las larvas. Estas neuronas se encuentran entre la membrana basal y la epidermis, con sus dendritas formando matrices en gran medida de dos dimensiones ^4,5. De las cuatro clases, clase IV da neuronas tienen las glorietas más altamente ramificada y, al igual que las neuronas sensoriales de otros animales, la elaboración de estas pérgolas requiere factores intrínsecos, así como las señales de los tejidos vecinos, particularmente en la epidermis, para su desarrollo ^6-9 .

Los estudios para determinar las modalidades de dicha neuronal y hecho de extra-neuronalORS controlar beneficio morfogénesis dendrita de la capacidad de detectar la expresión de proteínas in situ por inmunofluorescencia. La cutícula exterior de la larva es impenetrable a los anticuerpos, pero este impedimento es fácilmente superada por la preparación de filetes de larvas a través de métodos de disección bien establecidos ^10,11. Sin embargo, el tejido muscular de la pared del cuerpo que se encuentra justo interior a la membrana basal presenta varios retos hacia la visualización de las neuronas DA y las células epidérmicas. En primer lugar, el tejido muscular, lo que la mayoría de las líneas de la pared del cuerpo, oscurece considerablemente señales fluorescentes que emanan de tejido neuronal o epidérmica. Esto reduce sustancialmente la relación señal a ruido en la muestra. En segundo lugar, muchas proteínas relevantes pueden expresarse en el tejido muscular, así como en las neuronas o epidermis. Esta señal de fluorescencia derivada de músculo es probable que aún más la detección oscura de una señal de fluorescencia de la neurona o epidermis. Por último, los avances en las tecnologías de microscopía sinw imágenes permiso de muestras a una resolución de sub-difracción y puede ser especialmente útil en el discernimiento de la localización de las proteínas que se expresan en las neuronas y células de la epidermis que rodea ^12,13. Sin embargo, las imágenes a través de super-resolución de microscopía se beneficia de una fuerte relación señal a ruido y la proximidad de la muestra al cubreobjetos. Además de reducir la relación señal a ruido, la pared del cuerpo distancias musculares larvas da a las neuronas de la cubreobjetos, limitando de este modo la resolución de imagen mejorado que se puede conseguir con métodos de microscopía super-resolución. Además de retos para el análisis de inmunofluorescencia, el tejido muscular presenta una barrera para el registro electrofisiológico de las neuronas sensoriales en la pared corporal de larvas. Por tanto, su eliminación se beneficia manipulación neurofisiológica de las neuronas sensoriales ^14.

Aquí se describe un método para la extracción manual de Drosophila tejido muscular larval. Se demuestra que nuestro protocolo permits de formación de imágenes de inmunofluorescencia de las proteínas que se oscurece de otra manera por el tejido muscular, mejora la relación señal a ruido para la visualización de clase IV neuronas DA, y permite el uso de super-resolución microscopía para discriminar mejor las relaciones espaciales de proteínas y estructuras celulares en Da neuronas y la epidermis.

Protocolo

Nota: El procedimiento para la eliminación de músculo (Figura 1) es una modificación de los métodos descritos anteriormente para la preparación de filetes de larvas. Los pasos que preceden y siguen a la eliminación del músculo se describen brevemente y se remite al lector a los trabajos previos ^{10, 11} para una descripción más detallada.

1. Dissect Larva en solución salina fría

1. Preparar una dilución de trabajo de solución salina fría HL3.1 ¹⁵ o Ca ^{2 +} libre frío HL3.1 solución salina ¹¹ (Tabla 1). Coloque la larva en una placa de elastómero de silicona con suficiente solución salina fría para cubrir el fondo del plato.
   Nota: Véase la discusión con respecto a la elección de la solución salina.

solución salina HL3.1 1x (pH 7,2)

HEPES 5 mM

NaCl 70 mM

KCl 5 mM

1,5 mM de CaCl2 (omitir para Ca2 + solución salina exento)

4 mM MgCl2

10 mM NaHCO 3

trehalosa 5 mM

sacarosa 115 mM

Se esteriliza con filtro y se almacena a 4 ° C

imita la composición de insectos hemolinfa: Nota

Tabla 1. Composición de frío Saline.

2. Coloque la larva con el lado ventral hacia arriba. La superficie ventral de la larva se puede identificar por las cintas dentical abdominales y el lado dorsal por los tubos traqueales larvas primarias que funcionan de anterior a posterior. Estirar la larva en la dirección antero-posterior y el pin de la cabeza y la cola a unaelastómero de silicona disección plato usando pasadores de insectos. Con unas tijeras de disección finas para cortar a lo largo de la línea media ventral, comenzando en un extremo y progresando hacia el otro.
   NOTA: Esta orientación conserva el clúster dorsal comúnmente estudiada de las neuronas DA.
3. Después de la larva se corta abierta, fijar las cuatro esquinas del plato a la disección como si la apertura de un libro. El uso de fórceps para agarrar y extraer los órganos internos, incluyendo el sistema nervioso central, intestino, y la tráquea. Ajuste pasadores de insectos de manera que el filete es tensa pero no estirada al máximo.
   NOTA: Los músculos están ancladas a la pared del cuerpo en los límites segmentarias. Aunque los músculos cubren la mayor parte de la pared del cuerpo, que están ausentes en una zona estrecha cerca de la línea media dorsal.

La eliminación 2. Músculo

1. Busque la línea media dorsal de la larva, donde el tejido muscular está ausente. Coloque un solo diente fórceps de tal manera que se puede insertar debajo del tejido muscular en la orientación más plana posible.
2. A partir dela línea media dorsal, cerca del límite anterior del segmento, deslice cuidadosamente el diente fórceps entre el músculo y la epidermis, teniendo cuidado para minimizar el contacto entre la pinza y la epidermis.
3. Tire de la pinza hacia arriba para romper la unión del músculo para la pared del cuerpo en un punto de anclaje. Repita este proceso para el hemi-segmento (s) restante de interés.
   NOTA: Este protocolo optimiza la preservación de la parte posterior de cada campo de dendritas de las neuronas DA. Para preservar la parte anterior del campo de dendritas, lo mejor es insertar la clavija de fórceps en el extremo posterior de cada segmento.
4. Reajustar pasadores de insectos tales que el filete de larvas se estira al máximo en todas las direcciones.
5. Fijar el filete mientras que todavía se fija en el plato de disección usando, recién preparada formaldehído frío 4% en PBS durante 25 min.
6. Enjuagar 5 veces en PBS.
7. El uso de fórceps para extraer con cuidado el tejido muscular de los restantes puntos de anclaje, teniendo cuidado para minimizar contact con la epidermis.
8. Desanclar y quitar el filete del plato de la disección a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Llevar a cabo todas lavado, bloqueo, y los pasos de tinción de inmunofluorescencia posteriores, como se describió anteriormente ^11.

3. Monte el filete de larvas

1. Saca primero la cabeza y la cola con unas tijeras de disección finas con el fin de hacer la muestra lo más plana posible. Montar el filete en un cubreobjetos en medio de montaje antifade con la superficie interior del filete frente al cubreobjetos.
2. Colocar un portaobjetos de microscopio en el cubreobjetos y presionar suavemente para dispersar el medio de montaje. Da la vuelta al portaobjetos de microscopio una y sellar el cubreobjetos sobre el portaobjetos usando esmalte de uñas. Las diapositivas se pueden almacenar a -20 ° C durante al menos un mes.

Resultados

Se demuestra la utilidad del procedimiento de extracción muscular para mejorar la relación señal a ruido en los experimentos de inmunofluorescencia para co-visualizar las proteínas de unión tabicado Coracle (Cora) y discos de gran (DLG), junto con la clase IV neuronas DA, marcadas con el marcador de membrana CD4 tdTomato.

Cora se ha utilizado anteriormente para identificar áreas de muestreo donde da las dendritas de las neuronas están rodeados por cél...

Discusión

Aquí un protocolo se describe para la extracción manual de tejido muscular de Drosophila filetes de larvas. Este protocolo descrito previamente modifica la técnica de disección de las larvas ^10,11. Después de la larva se diseca en una placa de elastómero de silicona, la línea media dorsal se encuentra. Una sola pinzas de punta, en su orientación más plana posible, se inserta cuidadosamente entre el tejido muscular y la epidermis, cerca de la línea media dorsal. El fórceps se tira suavement...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dumont #5 tweezers	Electron Microscopy Sciences	72701-D
Micro Scissors, 8 cm, straight, 5 mm blades, 0.1 mm tips	World Precision Instruments	14003
Sylgard 184 silicone elastomer kit	Dow Corning	3097358-1004	for dissecting plates
Austerlitz insect pins, 0.1 mm	Fine Science Tools	26002-10
Fostec 8375 light source	Artisan Technology Group	62792-4
Zeiss Stemi 2000	Carl Zeiss Microscopy
Vectashield antifade mounting medium	Vector Laboratories	H-1000	for confocal microscopy
Prolong Diamond antifade mountant	Life Technologies	P36970	for structured illumination microscopy
Micro cover glass, 22 x 22 mm, No. 1.5	VWR	48366-227
Superfrost Plus microscope slides, 25 x 75 x 1.0 mm	Fisherbrand	12-550-15
Mouse anti-Coracle antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	C615.16	supernatant, dilute 1:50
Mouse anti-Discs large antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	4F3	supernatant, dilute 1:50
Rabbit anti-dsRed antibody	Clontech	632496	dilute 1:1,000
Goat anti-rabbit antibody, Alexa Fluor 568 conjugated	ThermoFisher Scientific	A-11011	dilute 1:1,000
Goat anti-mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated	ThermoFisher Scientific	A-11001	dilute 1:500