Remoção de<em&gt; Drosophila</em&gt; Tecido muscular larval Filetes para Análise de imunofluorescência de neurônios sensoriais e células epidérmicas

Resumo

Estudos da morfogênese neuronal usando Drosophila arborização dendrítica larval (da) neurônios beneficiar na visualização situ de proteínas neuronais e epidérmicas por imunofluorescência. Descreve-se um processo que melhora a análise de imunofluorescência de Da neurónios e células epidérmicas vizinhas através da remoção de tecido do músculo da parede do corpo larval.

Resumo

Neurônios Drosophila larval arborização dendrítica (DA) é um modelo popular para a investigação de mecanismos de morfogênese neuronal. Da neurónios desenvolver em comunicação com as células epidérmicas que inervam e, portanto, os seus benefícios de análise de visualização em in situ de ambas as proteínas neuronalmente e epidermicamente expressas por imunofluorescência. Os métodos tradicionais de preparação de filetes de larvas para experiências de imunofluorescência deixar intacto o tecido muscular que cobre a maior parte da parede do corpo, apresentando vários desafios à imagem latente proteínas neuronais e epidérmicas. Descrevemos aqui um método para a remoção de tecido muscular de Drosophila filetes larval. Este protocolo permite imagiologia de proteínas que são de outra forma obscurecido por tecido muscular, melhora a relação sinal-ruído, e facilita o uso de microscopia de super-resolução para estudar da Desenvolvimento neurônio.

Introdução

Neurónios Drosophila larval arborização dendrítica (DA) fornecer um modelo válido para o estudo do desenvolvimento neuronal, devido à sua receptividade para a manipulação genética e a facilidade com que eles podem ser visualizados. Esses neurônios sensoriais têm sido fundamentais para a identificação de inúmeros caminhos que controlam dendrite morfogênese ^1-3.

Quatro classes de da neurônios (Classe I - IV) inervam a epiderme larval. Estes neurônios situar-se entre a membrana basal da epiderme e, com as suas dendrites formando matrizes bidimensionais largamente ^4,5. Das quatro classes, classe IV da neurônios têm os mandris mais altamente ramificada e, como neurônios sensoriais dos outros animais, a elaboração desses mandris exige fatores intrínsecos, bem como sugestões de tecidos vizinhos, em particular a epiderme, para o seu desenvolvimento ^6-9 .

Estudos para determinar como tal neuronal e fato extra-neuronalRUP controlar benefício morfogénese dendrite de a capacidade de detectar a expressão de proteínas in situ por imunofluorescência. A cutícula externa da larva é impenetrável para os anticorpos, mas este impedimento é facilmente superada pela preparação de filetes de larvas através de métodos bem estabelecidos de dissecação ^10,11. No entanto, o tecido do músculo da parede do corpo que se encontra logo interior para a membrana basal apresenta vários desafios para visualização dos neurónios de da e as células epidérmicas. Primeiro, o tecido muscular, que a maioria das linhas de parede do corpo, obscurece grandemente sinais fluorescentes que emanam a partir de tecido neuronal ou epidérmica. Isto reduz substancialmente a relação sinal-ruído na amostra. Em segundo lugar, muitas proteínas relevantes pode ser expresso em tecido muscular, assim como nos neurónios ou epiderme. Este sinal de fluorescência derivadas de músculo é provável que mais obscura a detecção de um sinal de fluorescência a partir do neurónio ou epiderme. Finalmente, os avanços nas tecnologias de microscopia semw autorização de imagem de amostras com resolução sub-difração e pode ser especialmente útil para discernir a localização de proteínas que são expressas em neurônios e em torno de células epidérmicas ^12,13. No entanto, a imagem latente através de benefícios de microscopia de super-resolução de uma forte relação sinal-ruído e proximidade da amostra com a lamela. Além de reduzir a relação sinal-ruído, as distâncias da parede do corpo do músculo larval da neurônios da lamela, limitando assim a resolução da imagem melhorada que pode ser conseguida com métodos de microscopia de super-resolução. Além desafios para análise de imunofluorescência, tecido muscular apresenta uma barreira para gravação electrofisiológico de neurónios sensoriais na parede do corpo larval. Portanto, a sua remoção beneficia manipulação neurofisiológica de neurônios sensoriais ^14.

Aqui, um método para a remoção manual de Drosophila tecido muscular larval é descrito. Nós demonstramos que nosso protocolo pErmits imagem imunofluorescência de proteínas que são de outra forma obscurecido por tecido muscular, melhora a relação sinal-ruído para a visualização de classe IV da neurônios, e permite o uso de microscopia de super-resolução para melhor discriminar relações espaciais de proteínas e estruturas celulares no da neurônios e a epiderme.

Protocolo

Nota: O procedimento para a remoção muscular (Figura 1) é uma modificação dos métodos anteriormente descritos para a preparação de filetes de larvas. As etapas que precedem e seguem a remoção do músculo são descritas de forma breve e o leitor é remetido ao trabalho anterior ^{10, 11} para descrições mais detalhadas.

1. Dissecar Larva em Saline Fria

1. Prepare uma diluição de trabalho de frio solução salina HL3.1 ¹⁵ ou Ca ^{2 +} livre frio HL3.1 salina ¹¹ (Tabela 1). Coloque a larva em um prato de elastómero de silicone com uma solução salina fria apenas o suficiente para cobrir a parte inferior do prato.
   NOTA: Ver discussão sobre a escolha de uma solução salina.

1x HL3.1 salina (pH 7,2)

5 mM de HEPES

NaCl 70 mM

5 mM de KCl

1,5 mM de CaCl2 (omitir de Ca2 + salina -livre)

4 mM de MgCl2

10 mM de NaHCO3

5 mM de trealose

sacarose 115 mM

Filtro de esterilizar e armazenar a 4 ° C

imita Composição de insetos hemolinfa: Nota

Tabela 1. Composição de Cold Saline.

2. Posicionar a larva com o lado ventral para cima. A superfície ventral da larva pode ser identificada pelos cintos abdominais e dentical lado dorsal por os tubos traqueais larvais primárias que funcionam no sentido antero-posterior. Estique a larva no sentido ântero-posterior e fixar a cabeça ea cauda a umelastômero de silicone dissecar prato utilizando os pinos de insetos. Use tesouras de dissecação fino para cortar ao longo da linha média ventral, começando numa extremidade e progredindo no sentido da outra.
   NOTA: Esta orientação preserva o cluster dorsal comumente estudada da neurônios.
3. Após a larva é cortado, fixar os quatro cantos para o prato de dissecação como se abrir um livro. Use uma pinça para agarrar e remover os órgãos internos incluindo o sistema nervoso central, do intestino, traqueia e. Ajuste os pinos de insetos para que o filé é tensa, mas não maximamente esticado.
   NOTA: Os músculos são ancoradas à parede do corpo em limites segmentares. Embora músculos cobrir a maior parte da parede do corpo, que estão ausentes numa região estreita perto da linha média dorsal.

Remoção 2. Muscle

1. Localizar a linha média dorsal da larva, onde o tecido muscular está ausente. A posição de uma única pinça pino de tal forma que ele pode ser inserido por baixo do tecido muscular na orientação mais plana possível.
2. Começando àsa linha média dorsal, perto do limite anterior do segmento, deslize cuidadosamente o pino de uma pinça entre o músculo e da epiderme, tendo o cuidado para minimizar o contacto entre a pinça e epiderme.
3. Puxar as pinças para cima para quebrar a fixação do músculo da parede do corpo em um ponto de ancoragem. Repetir este processo para o hemi-segmento (s) restante de interesse.
   NOTA: Este protocolo otimiza preservação da posterior de cada campo dendrite da neurônio. Para preservar a parte anterior do campo dendrítico, que é melhor para inserir o pino de uma pinça na extremidade posterior de cada segmento.
4. Reajustar os pinos de insetos de modo a que o filé larval é maximamente se estendiam em todas as direções.
5. Corrigir o filé enquanto ele ainda está preso ao prato de dissecação usando frio, preparados na hora formaldeído 4% em PBS durante 25 min.
6. Lavar 5 vezes em PBS.
7. Use uma pinça para retirar cuidadosamente o tecido muscular dos restantes pontos de ancoragem, tendo o cuidado para minimizar Contact com a epiderme.
8. Soltar e remover o filete do prato de dissecação para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Executar todas as lavar, bloqueio e passos imunofluorescência posteriores, como descrito anteriormente ^11.

3. Monte o larval Fillet

1. Primeiro retire a cabeça ea cauda usando tesouras de dissecação finas, a fim de fazer a amostra o mais plano possível. Montar o filete sobre uma lamela em antifade montagem com a superfície interior do filete de frente para a lamela.
2. Coloque uma lâmina de microscópio sobre a lamela e pressione suavemente para dispersar o meio de montagem. Virar a lâmina de microscópio mais e selar a lamela na lâmina usando unha polonês. As lâminas podem ser armazenadas a -20 ° C durante pelo menos um mês.

Resultados

Nós demonstrar a utilidade do procedimento de remoção do músculo para melhorar a relação sinal-ruído em experiências de imunofluorescência para co-visualizar as proteínas de junções septadas Coracle (Cora) e discos de grande (GMD) em conjunto com classe IV da neurônios marcados com o marcador de membrana CD4- tdTomato.

Cora foi previamente usada para identificar trechos onde a Dinamarca dendrites neuronais são delimitados por células epidérmic...

Discussão

Aqui é descrito um protocolo para a remoção manual de tecido muscular de Drosophila filetes larval. Este protocolo modifica previamente descrito técnicas de dissecação larvais ^10,11. Depois que a larva é dissecado em um prato de elastómero de silicone, a linha média dorsal está localizado. Um único pino de pinça, na sua orientação mais plana possível, é cuidadosamente inserida entre o tecido muscular e da epiderme, perto da linha média dorsal. As pinças são delicadamente puxado par...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dumont #5 tweezers	Electron Microscopy Sciences	72701-D
Micro Scissors, 8 cm, straight, 5 mm blades, 0.1 mm tips	World Precision Instruments	14003
Sylgard 184 silicone elastomer kit	Dow Corning	3097358-1004	for dissecting plates
Austerlitz insect pins, 0.1 mm	Fine Science Tools	26002-10
Fostec 8375 light source	Artisan Technology Group	62792-4
Zeiss Stemi 2000	Carl Zeiss Microscopy
Vectashield antifade mounting medium	Vector Laboratories	H-1000	for confocal microscopy
Prolong Diamond antifade mountant	Life Technologies	P36970	for structured illumination microscopy
Micro cover glass, 22 x 22 mm, No. 1.5	VWR	48366-227
Superfrost Plus microscope slides, 25 x 75 x 1.0 mm	Fisherbrand	12-550-15
Mouse anti-Coracle antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	C615.16	supernatant, dilute 1:50
Mouse anti-Discs large antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	4F3	supernatant, dilute 1:50
Rabbit anti-dsRed antibody	Clontech	632496	dilute 1:1,000
Goat anti-rabbit antibody, Alexa Fluor 568 conjugated	ThermoFisher Scientific	A-11011	dilute 1:1,000
Goat anti-mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated	ThermoFisher Scientific	A-11001	dilute 1:500