El uso de la manipulación farmacológica y de alta precisión de radio telemetría para estudiar la cognición espacial en animales criados en libertad

Resumen

En este trabajo se describe un nuevo protocolo que combina la manipulación farmacológica de la memoria y de radio telemetría para documentar y cuantificar el papel de la cognición en la navegación.

Resumen

la capacidad del animal para percibir y aprender sobre su medio ambiente juega un papel clave en muchos procesos de comportamiento, incluyendo la navegación, la migración, la dispersión y la búsqueda de alimento. Sin embargo, la comprensión del papel de la cognición en el desarrollo de estrategias de navegación y los mecanismos subyacentes a estas estrategias está limitada por las dificultades metodológicas implicadas en la supervisión, la manipulación de la cognición de, y el seguimiento de los animales salvajes. Este estudio describe un protocolo para abordar el papel de la cognición en la navegación que combina la manipulación farmacológica de la conducta con alta precisión de radio telemetría. El enfoque utiliza la escopolamina, un antagonista del receptor muscarínico de acetilcolina, para manipular las habilidades espaciales cognitivos. Los animales tratados permanecen bajo observación con alta frecuencia y alta resolución espacial a través de la triangulación a distancia. Este protocolo se aplicó dentro de una población de tortugas oriental pintado (Chrysemys picta) que ha habitadoestacionalmente fuentes de agua para efímeras ~ 100 años, que se mueven entre las fuentes lejanas utilizando preciso (± 3,5 m), complejo (es decir, no lineal con alta tortuosidad que atraviesan múltiples hábitats), y las rutas predecibles aprendido antes de los 4 años de edad. Este estudio mostró que los procesos utilizados por estas tortugas son consistentes con la formación de la memoria espacial y la memoria. En conjunto, estos resultados son consistentes con un papel de la cognición espacial en la navegación complejo y ponen de manifiesto la integración de técnicas ecológicas y farmacológicas en el estudio de la cognición y la navegación.

Introducción

Cognición (en adelante definido como "todos los procesos relacionados con la adquisición, almacenamiento y uso de la información del ambiente" ¹⁾ es central para una variedad de tareas complejas de navegación ^2. Por ejemplo, las grúas de Sandhill (Grus canadensis) muestran una notable mejora en la precisión con la experiencia migratoria ^3, y las especies de tortugas marinas impronta en sus playas natales como crías y regresan como adultos ^4-6. Del mismo modo, la migración exitosa, la dispersión, y la bisagra de forrajeo en la capacidad del animal para recopilar información acerca de su entorno espacial ^7,8. Algunos animales parecen aprender rutas de navegación en relación con las características del paisaje específicas ⁹ y pueden utilizar la cognición espacial cuando se mueve entre la anidación y las zonas de alimentación ^10. Un trabajo reciente sobre tortugas pintada del este (Chrysemys picta) sugiere un período crítico en la navegación, donde la navegación exitosa de hábitat de tierras altas que los adultos depende de la juvenilo experiencia dentro de un estrecho rango de edad (<4 años de edad ^11-13). Aunque en conjunto, estos estudios demuestran el progreso que se ha hecho en la comprensión del papel de la educación en la navegación ^{4-6, 14-16,} los mecanismos que subyacen a este tipo de comportamientos y la función completa de la cognición en la navegación siguen siendo enigmática, sobre todo en los vertebrados ^{8, 17 , 18.}

Las investigaciones de campo sobre el papel de la cognición en la navegación son raras ^{2, 8, 18,} debido en gran parte a las dificultades metodológicas implicadas en el control, la manipulación y el seguimiento de los animales salvajes. Por ejemplo, las grandes escalas espaciales y temporales en los que muchos animales navegan a menudo impiden la investigación de ambos tipos de información que esos animales potencialmente aprenden y cómo se adquiere la información. Los experimentadores menudo se enfrentan a las dificultades logísticas de detección y localización de los animales cuando se monitorea el comportamiento sobre superficies tan grandes y marcos de tiempo, lo que limita el tipode los datos que pueden ser recogidos y las conclusiones que se pueden extraer. Aunque el uso de sistema de posicionamiento global montado animal (GPS) grabadoras puede mejorar la probabilidad de detección de los animales que van ampliamente, los datos espaciales recogidos por estos medios son generalmente de resolución muy gruesa y carecen de un componente de comportamiento detallada. En consecuencia, los datos que se pueden recoger en estas circunstancias tienen un valor limitado para el examen de sutil variación en el comportamiento entre los diferentes grupos o tratamientos experimentales. Del mismo modo, la manipulación directa y controlada de las conductas objetivo es a menudo prohibido por las escalas espaciales y temporales típicos de los comportamientos de navegación, así como por las limitaciones logísticas inherentes de los estudios de campo. Encontrando los animales en su hábitat natural, la captura y la manipulación de ellos, y luego recoger datos de comportamiento sin producir inadvertidamente comportamientos no esencial se principales retos de trabajar con los animales en el campo. Por lo tanto, el diseño de experimentos en free-van animales es a menudo limitado y la capacidad para llevar a cabo rigurosos, experimentos de campo controlados sobre el papel de la cognición en la navegación es limitado.

El presente estudio evita muchas de las dificultades anteriores de la investigación de la relación entre la cognición y la navegación en el campo mediante el uso de una combinación nueva de la manipulación farmacológica y seguimiento de alta resolución de los animales libremente naveguen en condiciones de campo. La escopolamina, un antagonista de los receptores muscarínicos de acetilcolina (mAChR), se ha demostrado que bloquear la formación de la memoria espacial y la memoria mediante el bloqueo de la actividad colinérgica en el cerebro de una variedad de taxones de vertebrados ^18-24. La escopolamina puede ser utilizado con eficacia en animales criados en libertad en condiciones de campo ^{11, 18} y tiene un efecto marcado pero temporal (por ejemplo, 6 - 8 horas en los reptiles). Metilescopolamina, un antagonista de mAChR que no cruza la barrera sangre-cerebro-barrera ^{19 a 21,} se puede utilizar para el control delos posibles efectos periféricos de escopolamina y para los aspectos no cognitivos de la conducta ^11. Farmacología permite la manipulación precisa de la cognición por los receptores que afectan directamente, y de telemetría de radio de alta precisión permite la observación de los efectos resultantes sobre el comportamiento. Las mediciones realizadas a través de la triangulación a distancia tanto con alta resolución espacial (± 2,5 m) y la resolución temporal (15 min) permiten la documentación precisa y cuantificación del comportamiento animal en relación con la manipulación experimental de la cognición.

Este estudio se llevó a cabo ¹¹ entre mayo y agosto de 2013 y de 2014 a Chesapeake Farms, un área de investigación manejo de vida silvestre 3.300 acres y la agricultura en Kent Co., MD, EE.UU. (39.194 ° N, 76.187 ° W). El protocolo consta de cinco pasos principales: (1) la captura y manejo de animales (2) la colocación de transmisores de radio (3) la preparación de los agentes farmacológicos (4) el seguimiento y la manipulación de los movimientos de animales, y (5) analizarla, los datos espaciales. El estudio descrito en este documento se centró en el oriente tortuga pintada (Chrysemys picta). Tortugas en la población focal se involucran en movimientos terrestres anuales en los que dejan sus estanques de inicio y desplácese a los hábitats acuáticos alternativos utilizando uno de los cuatro muy preciso (± 3,5 m), complejas y altamente predecibles rutas ^{11, 12.} La manipulación farmacológica de los animales en este sistema se combina con alta resolución de radio telemetría arroja luz sobre el papel de la cognición en la navegación libremente animales salvajes.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran sujetos animales fueron aprobados por los Comités de Cuidado y Uso de Animales institucional de Franklin y Marshall y Washington Facultades y cumplen todas las normativas locales, estatales y federales.

1. Captura y manipulación

1. Colocar trampas de aro en el cuerpo blanco de agua que se sabe que contienen las tortugas. Identificar la profundidad del agua asegurando que 4 - 5 pulgadas de la trampa se mantiene por encima del agua para permitir que las tortugas atrapadas a la superficie y respirar. Asegúrese de ampliar y velar por las trampas de aro a su longitud máxima, con las vigas transversales para evitar el colapso trampa. trampas estaca en el lecho del cuerpo de agua para prevenir la deriva.
2. Trampas de cebo de pescado con varios muertos, hígados de pollo, o los cuellos de pollo, una lata de comida para gatos, y / o una lata de verduras ^25.
3. Revise las trampas dos veces al día y quitar las tortugas. Al retirar las tortugas de las trampas, mantenga los animales por un lado y tenga cuidado para evitar daños por garras o pico.
   1. Lanzamiento de la captura incidental. Reponer trampas si se desea continuar la captura. Evaluar el estado del cebo. Si el cebo se había consumido, añadir más. Tire de trampas para apuntalar si no se desea captura adicional.
4. Determinar el sexo y la edad de las tortugas si se desea ^{26, 27.}
5. Coloque tortuga en una bolsa de retención y medir la masa corporal con una balanza de resorte a la g.
6. tortugas de transporte al laboratorio en cajas de transporte de clima controlado con una pequeña cantidad de agua. alojamiento de los animales individualmente en acuarios con agua del estanque sin tratar a cabo en aproximadamente 25 ° C y la profundidad suficiente para cubrir sólo la cabeza.

2. Colocación del transmisor de radio

1. Para maximizar la vida transmisor y de salida, elegir la más grande posible transmisor de radio que no exceda de 5% de la masa corporal del animal ^28.
2. Identificar la ubicación de la colocación del transmisor en el caparazón aproximadamente a medio camino entre la línea media y borde lateral del caparazón aproximadamente un tercio de la length arriba desde el borde posterior del caparazón.
3. Prepare el área mediante la eliminación de lodo, escombros, y el crecimiento de algas con un paño seco. área de hisopo con un 70% de isopropanol.
4. Adjuntar transmisor con una pequeña cantidad de 5 min epoxi. Oriente el transmisor para maximizar el contacto con la superficie del caparazón. Coloque la antena de manera que va a la zaga del animal paralelo al eje largo del cuerpo.
5. Una vez adecuadamente colocado, cubrir todo el transmisor y aproximadamente 1 cm de la superficie del caparazón circundante con 5 min epoxi.
6. Volver a la tortuga al acuario y permita que el epoxi cure durante la noche.

3. Preparación farmacológico

Precaución: bromhidrato de escopolamina y metilbromuro de escopolamina son antagonistas potentes de acetilcolina. Cuando se trabaja con estos medicamentos, consulte la Hoja de Datos de Seguridad, usar equipo de protección personal adecuado (por ejemplo, guantes, campana de extracción), y seguir los protocolos de seguridad de laboratorio para evitar accidenTal contacto.

1. El uso de consumibles estériles y antipyrogenic, compuesto de una solución madre de bromhidrato de escopolamina. Pesar la cantidad deseada del fármaco en una balanza analítica. Mezclar la escopolamina con solución salina de inyección en un tubo cónico a la concentración de 1 mg / ml. solución Vortex hasta que se disuelva. Asegúrese de que la pureza química de los productos químicos de base cumple o excede United States Pharmacopeia (USP) formulación cuando sea posible ^11.
2. Repita el paso 3.1 con bromuro de metilo escopolamina.
3. solución de proceso a través de un nylon de poro 0,22 micras o ésteres de celulosa mixtos jeringa filtro en un vial de suero de sellado estéril.
4. Almacenar a temperatura ambiente. Usar dentro de las 24 horas.

4. Los movimientos de la tortuga de pista con radio telemetría ^{11, 12}

1. Mover a la ubicación general de los animales seleccionados, permaneciendo al menos 25 m del animal. El uso de una antena Yagi direccional y ajuste de la ganancia del receptor en el medio, escanear el horizen determinar la dirección en bruto y la ubicación del animal. Al recibir interferencia o una señal débil, encontrar una nueva posición. Aumentar o mantener la elevación Yagi en alto siempre que sea posible para mejorar la señal.
2. Una vez que se encuentre una ubicación adecuada para tomar un cojinete, grabar su posición con un GPS.
3. Utilizando el método de nulo / pico ^28, determinar los cojinetes de los nulos izquierdo y derecho.
   1. Identificar la dirección de la señal más fuerte. Girar la ganancia hacia abajo tanto como sea posible mientras sigue recibiendo una señal detectable. Utilice el interruptor del atenuador del receptor si así está equipado. Mueva la antena a la izquierda y registrar el rumbo de la brújula en la que se pierde la señal.
   2. Repita el paso anterior para el cojinete derecho.
4. Repita el paso 4.3 de al menos dos lugares adicionales para el mismo animal.
   NOTA: Estos puntos adicionales se deben tomar de una manera tal como para rodear el animal.
   1. Cuando un conjunto de cojinetes se toma de una grat la distancia o con la interferencia inevitable, toman al menos dos cojinetes adicionales para aumentar la precisión. Reunir conjuntos de rodamientos utilizados para estimar un solo lugar lo más rápidamente posible, sobre todo si el animal está en movimiento.
      NOTA: Como alternativa, pueden coordinar múltiples personal para tomar múltiples cojinetes independientes en el mismo animal al mismo tiempo.
5. ubicaciones de registro de animales digital o en la mano cada 10 - 15 min utilizando pasos anteriores.
6. La manipulación de procesamiento cognitivo
   1. Una vez que el camino del animal no manipulado se documenta (un control dentro de los sujetos), proporcionar una dosis de escopolamina o metilescopolamina. Uso de la masa recogida en el paso 1.5, calcular la cantidad de fármaco que ha de darse a los animales para alcanzar una dosis final-reptil específica de 6,4 mg / kg de escopolamina o 6,8 mg / kg de metilescopolamina ^{19, 20.}
   2. Administrar el fármaco directamente en el peritoneo a través del seno peritoneal caudal utilizando un 1,0 ml jeringa con una aguja de calibre 22. Asegúrese de que el volumen total entregado no exceda de 1 ml.
   3. Liberar animales tan pronto como sea posible en su lugar de captura.
   4. Continuar el seguimiento de movimiento del animal cada 10 - 15 min hasta que llega a su destino proyectado.

5. Análisis Espacial

1. Calcular las estimaciones de localización de los animales.
   1. Para cada conjunto de cojinetes nulos, la bisectriz del ángulo (a mano o mediante software) para encontrar el cojinete transmisor resultante. Repita este procedimiento para todos los cojinetes en un punto de tiempo dado.
   2. El uso de software de triangulación según el protocolo del fabricante, estimar la posición del animal y el error asociado con las múltiples cojinetes del transmisor. Convertir estimaciones de la posición de coordenadas x / y si el software proporciona una salida diferente.
2. Repita los pasos 5.1 para todos los juegos de cojinetes.
3. Calcular la precisión espacial de movimiento.
   1. Calcula elmedia geométrica acumulativa (es decir, la trayectoria media) de los animales no manipulados (control negativo) a medida que avanzan hacia su objetivo ^12.
   2. Para cada individuo en los grupos de tratamiento y de control positivo, calcular el número acumulado de puntos que se superponen sucesivamente más grandes franjas de la línea media geométrica en intervalos de 5 m hasta el 100% de todos los puntos se han incluido ^{11, 12.}
   3. Calcular la media y el error estándar en cada distancia franja para todos los individuos en cada grupo.
   4. Estadísticamente analizar los datos, comparando entre los grupos de tratamiento, ya sea para el intervalo para dar cabida a 100% de los puntos o los puntos de solapamiento en un intervalo dado, dependiendo de la pregunta.

Resultados

Utilizando el protocolo anterior, el papel de la cognición en la navegación se evaluó en una población de tortugas pintadas del Este (Chrysemys picta) que ha experimentado fuentes de agua intermitentes de temporada para ~ 100 años. Esta población habita en una mezcla de efímera (drenado anualmente y rápidamente - en varios hr) y hábitats acuáticos permanentes (Figura 1). Estudios previos sugieren que después se drenan sus estanques, tortugas residente...

Discusión

El protocolo que aquí se presenta permite al experimentador para documentar y cuantificar el papel de la cognición en la navegación. La manipulación de la cognición en el campo ha demostrado ser difícil, ya que la mayoría de los enfoques dejan experimentadores no pueden saber qué aspectos específicos del comportamiento del animal están siendo manipulados. Sin embargo, el protocolo presentado aquí permite al experimentador para manipular con precisión y evaluar el papel de la cognición en la navegación de e...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Scopolamine bromide	Sigma	S0929	USP
Scopolamine methylbromide	Sigma	S8502, 1421009	USP and non USP versions
Saline	Hanna Pharmaceutical Supply Co., Inc.	409488850	USP, formulated as an injectable
Syringe filter	Fisher	09-720-004
Syringe	Fisher	14-823-30
Hypodermic needle	Fisher	14-823-13
Antenna	Wildlife Materials	3 Element Folding Yagi	Antennae with additional elements are available, but can be cumbersome in the field.
Radio Receiver	Wildlife Materials	TRX-2000S	Water resistant models are also available.
Compass	Brunton	Truarc 15
Radio transmitters	Holohil Inc.	BD-2, PD-2, RI-2B	Transmitter models vary in lifespan and signal output as a function of battery size and pulse rate settings, which can be customized based on the study question and organism.
GPS	Garmin	eTrex Venture
Coaxial cable	newegg.com	C2G 40026	BNC connections are necessary.
Hoop net	Memphis Net and Twine	TN325	Net mesh size should be chosen based on the minimum size of the target animal.