Análisis de los vasos coronarios en los corazones embrionarias aclarados

Resumen

Se presenta un protocolo para el análisis de los vasos coronarios en los corazones enteros murinas embrionarias hasta E15.5, utilizando métodos de tinción inmunológicos estándar seguido por la separación óptica y microscopía confocal. Esta técnica permite la visualización de los vasos sanguíneos en todo el corazón sin la necesidad de análisis que consume tiempo de secciones en serie.

Resumen

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard microscopy techniques, due to the scattering of imaging light by the thick heart tissue, as these vessels are localized deep within the walls of the developing heart. As optical clearing of tissues using organic solvents such as BABB (1 part benzyl alcohol to 2 parts benzyl benzoate) has been shown to greatly improve the optical penetration depth that can be achieved, we combined clearance of whole, PECAM1-immunostained hearts, with laser-scanning confocal microscopy, in order to obtain high-resolution images of vessels throughout the entire heart. BABB clearance of embryonic hearts takes place rapidly and also acts to preserve the fluorescent signal for several weeks; in addition, samples can be imaged multiple times without loss of signal. This straightforward method is also applicable to imaging other types of blood vessels in whole embryos.

Introducción

El establecimiento de una red coronaria funcionamiento es crucial para la función cardíaca y el desarrollo embrionario, y el análisis de ratones mutantes genéticos pueden proporcionar información valiosa sobre las señales moleculares que subyacen a este proceso de desarrollo. La capacidad de visualizar el plexo coronarias embrionarias en su conjunto, en lugar de presentarse en una serie de secciones histológicas, es esencial para facilitar el análisis de los patrones buque en mutantes genéticos, y evita la pérdida potencial de la información que puede ocurrir como resultado de la mecánica el corte de tejido. Vasos destinado a formar arterias y capilares se localizan en lo profundo de las paredes de ambos los ventrículos y la aorta ^1-3. Sin embargo, mientras que el marcaje fluorescente de células combinadas con láser microscopía confocal de barrido puede proporcionar imágenes de alta resolución de los vasos venosos superficiales-wholemount marcado / linfáticos ^4,5, la profundidad de formación de imágenes está limitado por penetración óptica. -Alta resolución de imagen de la tapaillaries y arterias largo de toda la profundidad del corazón, por tanto, no es posible sin alguna forma de compensación del tejido.

Poor penetración óptica es causado por el alto índice de refracción de la múltiple celulares y extracelulares de los tejidos componentes gruesos (por ejemplo, el colágeno y las fibras elásticas). Esto dispersa la luz de imagen, causando distorsión y la disminución de contraste. agentes de aduanas por lo general coincide con el alto índice de refracción de estos tejidos, lo que significa que la luz puede viajar a través de la muestra sin obstáculos y penetrar más profundamente en el tejido. Antes de borrar, los tejidos son generalmente deshidratada ya que el agua tiene un índice de refracción relativamente bajo. Una plétora de nuevos métodos de compensación se han desarrollado recientemente, sin embargo dependiendo de la técnica utilizada, el proceso de compensación puede tomar días o semanas y puede requerir reactivos costosos ^6-9. Babb (una mezcla 1: 2 de alcohol bencílico y benzoato de bencilo) es un agente de eliminación de bajo costo, de uso común, que tiene laventaja de preparar las muestras de forma extremadamente rápida. Técnicas de compensación y de formación de imágenes a base de Babb se han descrito anteriormente para las muestras neurológicas y diversos órganos ^10-13. Aquí se describe una técnica robusta y sencilla para el despacho de las muestras Babb inmuno seguido por microscopía confocal, con referencia específica al examen de los vasos sanguíneos en los corazones murinos de E (día embrionario) 11.5 - 15.5. Sin embargo, como también se ha demostrado, la técnica puede igualmente bien aplicarse a análisis de embriones enteros, así como otros tipos de células, siempre y anticuerpos como de alta calidad a los marcadores de interés están disponibles.

Protocolo

Toda la investigación con animales se llevó a cabo de acuerdo con las directrices institucionales bajo licencia del Ministerio del Interior del Reino Unido.

1. La disección y la fijación de los corazones embrionarias

1. La eutanasia a un ratón temporizado-embarazada en el día requerido utilizando una técnica de sacrificio éticamente aprobadas, por ejemplo, CO ₂ narcosis seguido por dislocación cervical, y retirar los sacos embrionarios ^14, colocándolos en una placa de 10 cm Petri llena de salina tamponada con fosfato (PBS) .
2. El uso de un microscopio de disección y pinzas, abrir cuidadosamente hasta los sacos uterinos y quitar cada embrión, cortar el cordón umbilical y la eliminación de la bolsa de la yema.
3. Para los propósitos de genotipado, quitar la cola del embrión y colocar en un tubo de 1.5 ml para la extracción de lisis / ADN después.
4. Con el fin de eliminar el corazón, PIN cada embrión a cabo en su parte posterior en un 35 mm placa de Petri de elastómero recubierto de silicona rellena-PBS, usando pasadores minutien de acero inoxidable. Con unas pinzas finas, CArefully abrir el pecho y cortar los grandes vasos, anterior al corazón. Luego de llegar detrás del corazón con las pinzas, agarre detrás de los vasos del corazón y tirar suavemente para quitar el corazón; los pulmones también pueden venir lejos al mismo tiempo.
5. Transferir el corazón a un nuevo máximo 35 mm placa de Petri que contiene PBS y el uso de unas pinzas finas para recortar el tejido pulmonar, si es necesario. A continuación, transferir el corazón a un pocillo de una placa de 48 pocillos lleno de PBS frío.
6. Después de recoger todos los corazones en la placa de 48 pocillos, aspirar el PBS con una pipeta Pasteur de plástico de punta fina y reemplazar con 0,5 ml de paraformaldehído al 4% (PFA).
   PRECAUCIÓN: PFA es una alergenicidad conocida, carcinogénico y toxicidad.
   1. Fix E11.5 - 12,5 corazones durante 15 minutos, corazones E13.5 durante 20 minutos y E14.5 - 15.5 corazones durante 30 minutos, en PFA al 4% a temperatura ambiente.
7. Aspirar el PFA con una pipeta Pasteur de plástico de punta fina y enjuagar los corazones 2x en PBS frío.
   CAUTION: PFA es peligroso y debe eliminarse de acuerdo con las normas institucionales.
8. Si no se utiliza inmediatamente para toda la inmunotinción de montaje (véase la sección 2), se deshidratan los corazones mediante la realización de sucesivos lavados de 5 min en las siguientes soluciones: metanol al 25% / 75% de PBS, el 50% de metanol / 50% de PBS, el 75% de metanol / 25 % PBS.
   PRECAUCIÓN: El metanol es tóxico, use guantes. Almacenar los corazones a -20 ° C en metanol al 100%.

2. Todo el montaje inmunotinción de los corazones embrionarias con anticuerpos anti-PECAM1

NOTA: Los anticuerpos anti-PECAM1 funcionan bien para la tinción de los vasos coronarios (véase el paso 2.4), pero cualquier marcador pan-endotelial que proporciona una señal robusta sería adecuado.

1. Si el uso de los corazones que han sido almacenados en 100% de metanol, transferir a tubos de 1,5 ml de microcentrífuga y rehidratar mediante la realización de sucesivas lavados 5 min en las siguientes soluciones: 75% de metanol / 25% de PBS, 50% de metanol / 50% de PBS y 25% metanol / 75% de PBS.
2. Permeabilizar los corazones mediante la realización de 3 x 10 min lavados en 0,5 a 1,0 ml de PBST (PBS / 0,1% Tween-20), que gira a la temperatura ambiente.
3. Bloquear los corazones mediante la rotación durante 1 hora a temperatura ambiente en 1,0 ml 10% de suero de cabra en PBST.
4. Eliminar el tampón de bloqueo con un plástico pipeta Pasteur de punta fina o la punta de la pipeta 1.000 l y reemplazar con 400 - 500 l nuevo bloque que contiene el anticuerpo primario anti-PECAM1 diluido 1:50. Rotar los tubos durante la noche a 4 ° C.
5. Al día siguiente, aspirar el anticuerpo bloque / primaria con una pipeta Pasteur de plástico de punta fina o la punta de la pipeta 1.000 l y llevar a cabo al menos 6 x 1 hr lavados en 1,0 ml de PBST, la rotación de los tubos a temperatura ambiente.
6. Reemplazar el último lavado con tampón de bloqueo fresco que contenía el anticuerpo secundario fluoróforo conjugado diluido 1: 500, y se incuba durante la noche a 4 ° C, con la rotación. Proteger de la luz envolviendo los tubos en papel de aluminio.
7. Al día siguiente, aspirar el bloque / seganticuerpo secun- con una pipeta Pasteur de plástico de punta fina y llevar a cabo al menos 6 x 1 hr lavados en 1,0 ml de PBST, la rotación de los tubos a temperatura ambiente.
8. Almacenar los corazones a 4 ° C (protegido de la luz) hasta que se necesite.

3. Preparación de las soluciones de compensación y platos Microscopía

NOTA: Cuando la formación de imágenes en corazones Babb es vital que ninguno de la solución Babb entra en contacto con los componentes del microscopio. Para ello, el siguiente protocolo contiene instrucciones para la preparación de platos de elastómero de sellado de silicona adecuados para microscopía de fluorescencia, que se pueden preparar con mucha antelación. El elastómero de silicona proporciona una barrera para contener el Babb y evitar que potencialmente se filtre entre la parte inferior y los lados de vidrio de policarbonato del plato.

1. Para preparar los platos impregnados de elastómero de silicona, tomar placas de cultivo con fondo de vidrio óptico y colocar una tapa de un vial de 4 ml tornillo superior (aproximadamente 1,5 cm de diámetro) En el centro de cada plato.
   Nota: Esto formar un pozo para la muestra cuando el elastómero se aplica al plato.
2. Llenar los platos con elastómero de silicona hasta una profundidad de aproximadamente 0,5 cm, usando un cartucho aplicador para mezclar los dos componentes ya que se aplican, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Deje secar durante al menos 24 horas, asegurándose de que la tapa del frasco permanece en el centro de cada plato.
   NOTA: Utilice gafas de seguridad para evitar el contacto accidental del elastómero de silicona con los ojos.
3. Después de curar el elastómero, quitar el tapón del vial de cada plato, Esto dejará un pozo central, donde la muestra para formar una imagen puede ser colocado en contacto directo con el fondo de cristal del plato.
   NOTA: una vez curado el elastómero debe ser firme y seco al tacto.
4. Preparar la solución de Babb (alcohol bencílico 1 parte por 2 partes de benzoato de bencilo). Esto se debe almacenar en una botella de vidrio y protegido de la luz.
   PRECAUCIÓN: BABB es una solución tóxico, corrosivo. Manipular de una campana de humos, mientras que el uso de ropa protectora adecuada.
5. Mix Babb y metanol para hacer una solución 50:50 (1 - 5 ml) en un vial de vidrio. Proteger de la luz, por ejemplo, envolviendo el vial en papel de aluminio.

4. La deshidratación, Compensación y montaje de los corazones por microscopía confocal

NOTA: Larger muestras se pueden borrar en 4 viales de vidrio ml, sin embargo, para muestras pequeñas (por ejemplo, corazones hasta E13.5) es mejor para llevar a cabo el proceso de compensación directamente en el plato de la microscopía. Esto ayuda a evitar "perder" las muestras como los corazones se vuelven muy transparente, una vez aclarado. Por estas pequeñas muestras de compensación es muy rápida, que se producen a los pocos minutos.
NOTA: Proteja las muestras de la luz durante todos los pasos siguientes de envolver / cubrir tubos y las placas con papel de aluminio.

1. Antes de borrar, deshidratar los corazones inmuno-a través de una serie de metanol mediante la rotación de los corazones en la sala de temperatura en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml en cambios sucesivos de las siguientes soluciones: 25% de metanol / 75% de PBS, 50% de metanol / 50% de PBS y 75% de metanol / 25% de PBS (5 min en cada uno). Finalmente, gire durante 3 x 5 min en metanol al 100%.
2. Para los corazones hasta E13.5, lugar en el centro del plato de microscopía; bajo el microscopio asegurar el corazón está orientada con su lado dorsal superior. Eliminar cualquier metanol de todo el corazón con una pipeta de plástico Pasteur de punta fina.
3. El uso de un plástico Pasteur pipeta limpia de punta fina, añadir de Babb: metanol 50:50 solución en un volumen suficiente para sumergir el corazón (aproximadamente 300 a 400 l). Como el corazón a veces puede dar la vuelta otra vez en la solución, compruebe la orientación de nuevo, mientras que los corazones están siendo opaca. Deja en la solución durante 5 min.
4. Eliminar la solución de 50:50 a una botella de residuos de vidrio en la campana de humos y reemplazar con Babb, otra vez usando una pipeta de plástico Pasteur de punta fina.
   NOTA: No se requiere un gran volumen; añadir sufciente para que el corazón se encuentra dentro de una gota de solución. El corazón debe desaparecer dentro de 5 minutos.
5. Para los corazones más grandes, desactive las muestras en viales de vidrio.
   NOTA: Un corazón E15.5 debe desaparecer dentro de 30 min-1 hr, pero puede calentarse durante la noche si es necesario.
6. Después de que la muestra es clara, se retira la solución y reemplazar con un volumen mínimo de Babb. Opcionalmente, cubrir la muestra con una hoja de cubierta, para ayudar a mantenerlo en su lugar, sin embargo, esto no es absolutamente necesario. Utilice el corazón para la imagen.

5. Borrado de imagen Corazones por microscopía confocal

NOTA: Las imágenes fueron capturadas en un microscopio confocal invertido usando 10X o 20X objetivos secos. Aunque es posible utilizar los platos en un confocal en posición vertical, un cuidado especial se debe tomar para evitar el contacto del objetivo con la solución de Babb.

1. Se recoge una z-scan del corazón ^15. Dependiendo del tamaño del corazón, una exploración azulejo puede ser requerido para imagen todo el corazón ^16.
   PRECAUCIÓN: Babb es una solución corrosiva, use guantes limpios y asegurar la parte exterior del plato de microscopía es libre de Babb. Manejar el plato con cuidado y mantener la tapa sobre el plato para minimizar el riesgo de derrame accidental sobre el microscopio.
2. Si la distancia de trabajo objetivo permite, use un aumento mayor para lograr imágenes de alta resolución de las regiones de interés.

6. Análisis de Datos El uso de Fiji Software

1. Abra la pila z de imágenes en Fiji ^17.
2. Para realizar la proyección z de toda la pila o parte de ella, haga clic en la imagen y seleccionar la pila, seguido por el proyecto Z. Introduzca el inicio y detención de números de sector, y seleccione el tipo de proyección z, por ejemplo, intensidad media, la intensidad máx.
3. Para resaltar los vasos individuales dentro de una pila de cortes de imagen utilizan la herramienta de Blow (en el menú de selección de plugins de segmentación, y luego Blow / herramienta Lazo) y hacer clic en las áreas de la imagen para ser llenado en earebanada ch. Utilice el comando Fill (haga clic en Editar, a continuación, seleccione Fill) para rellenar las zonas seleccionadas con el color de primer plano de elección (haga clic en Editar, a continuación, seleccione Opciones, seguido de Colores y primer plano).
4. proyecto de Z la imagen de pila como antes.

7. Representación 3D de la superficie del volumen de las arterias coronarias generada usando Imaris

1. Haga clic en el icono Superar la vista en la parte superior de la pantalla y arrastrar y soltar el archivo de imagen en la ventana de datos. Haga clic en el icono de Vista 3D en la parte superior de la pantalla.
2. Seleccione el icono de superficies (icono azul) y, a continuación, haga clic en la pestaña Crear. Haga clic en el cuadro de diálogo 'Skip creación automática, edite manualmente "y haga clic en el icono Dibujar (icono de lápiz fino).
3. Seleccione la pestaña de contorno, y luego en la ficha Modo. En el modo, haga clic en la varita mágica o iconos de isolíneas. Elija el modo de puntero en la selección del puntero en la parte derecha de la pantalla haciendo clic junto a "Seleccionar", y luego haga clic en el 'Draw9; cuadro (en la esquina inferior izquierda de la pantalla).
4. Utilice la isolínea o herramienta Varita mágica para seleccionar los contornos de las arterias en rebanadas sucesivas. Desplazarse de una rebanada de cortar con el control deslizante Posición de la rebanada.
5. Cuando todos los contornos se han seleccionado, haga clic en el cuadro Crear superficie. El volumen que rodea puede hacerse invisible, o se hace más o menos opaco usando el Modo de mezcla; haga clic en el volumen para resaltarlo y luego seleccione la ficha Configuración, seguido de la ficha Modo. Seleccione Mezcla y utilizar el control deslizante para cambiar la opacidad.
6. Capturar imágenes utilizando la función de instantáneas.

Resultados

A medida que se desarrolla el corazón, el miocardio ventricular es invadido por las células endoteliales (ECS) de varias fuentes, y se forma un plexo vascular. Los buques que se desarrollan dentro del miocardio ventricular pasarán a formar las redes capilares arteriales y la entrega de sangre oxigenada a los tejidos del corazón ^18. Al mismo tiempo (alrededor de E11.5) la coronaria tallos comenzar a desarrollar independientemente de una red capilar separado (conocido como el plexo peritruncal) que rodea el lumen de la aorta ^14,19,20. Plexo Peritruncal ECs inicialmente formar múltiples conexiones con el lumen de la aorta a nivel de los senos de la válvula, sin embargo, en última instancia un único recipiente persistirá en cada lado de la aorta, de pasar a formar las raíces de las arterias coronarias izquierda y derecha ^21. Desde alrededor de E13.5 la peritruncal y ventriculares vasos miocárdicos se unen para formar una red interconectada, permitiendo el flujo de sangre de la unaorta en los vasos coronarios ^14,22. La tinción de ECs con anti-PECAM-1 anticuerpo, en combinación con el aclaramiento de Babb de los corazones intactos, permite el análisis de las redes coronarias en desarrollo desde las etapas más tempranas posibles. En etapas posteriores del desarrollo del patrón de las arterias coronarias de maduración también puede ser examinado. Este método también se puede utilizar para teñir la vasculatura de los embriones enteros (hasta E11.5 por lo menos), y con diferentes anticuerpos, por ejemplo, anti-alfa actina de músculo liso (Sm22α) y Endomucin.

La Figura 1 muestra la concentración máxima intensidad z proyecciones de un corazón E11.5 generado utilizando el software de Fiji. La función del azulejo se utilizó para recopilar varias imágenes parciales del corazón y combinarlas para formar una imagen completa; esto es útil para dar una visión general de la tinción en todo el espécimen. En este anticuerpo etapa PECAM1 manchas principalmente el revestimiento del endocardio del corazón y flujo de salida vessels, sin embargo unos pocos ECs puede también observarse en la pared ventricular izquierda (región en caja en la Figura 1A, se muestra ampliada en 1A '). Además, el plexo peritruncal se pueden observar claramente en la pared del tracto de salida (OT) (región en caja en la Figura 1B). En este último caso, reduciendo el número de cortes en la z-pila utilizado para generar la proyección mejoró la claridad de la imagen, lo que permite las conexiones con el lumen de la aorta para ser visualizado más claramente (Figura 1B '). En la Figura 2, el aumento de la vasculatura proximal a la aorta se puede observar en un corazón E12.5. Figura 3 muestra el plexo peritruncal en un corazón E12.5. El z proyección 12 cortes en la Figura 3A muestra todo el plexo, sin embargo, como algunos vasos están localizados ventralmente a la luz de la aorta (que también está fuertemente manchado por anti-PECAM1 anticuerpo), la división de la pila Z into una serie de sub-pilas (Figura 3B-D) proporciona más información visual. Por ejemplo, la sub-pila proyectada en la Figura 3B muestra un recipiente peritruncal de conexión a la superficie ventral de la luz aórtica, que no es visible en la proyección completa. La Figura 4 muestra parte de un corazón E15.5; las arterias coronarias son claramente visibles en esta etapa (Figura 4A, la proyección 30-slice). En las proyecciones z 5-rebanada que se muestran en las figuras 4B y C de las válvulas aórtica y pulmonar también se pueden visualizar por tinción PECAM1; las ramas y las interconexiones de la red capilar coronaria son también más clara en estas proyecciones subpila más pequeños. Manual de técnicas de segmentación se han utilizado para resaltar las arterias coronarias mediante Fiji (Figura 4D) o Imaris (Figura 4D y E). La representación de volumen 3D de la superficie de las arterias coronarias / luz de la aorta u generanSing Imaris se puede ver con o sin la vasculatura circundante (Figura 4E y F).

La vasculatura de los embriones enteros también puede ser examinada usando tinción PECAM1 despacho / Babb. La figura 4A y A ', muestran proyecciones z generados a partir de sub-pilas desde el lado derecho (z rebanadas 11 - 65) y lado izquierdo (z rebanadas 66-110) del embrión respectivamente. La comparación de las dos imágenes muestra que la intensidad de la señal fluorescente no disminuyó significativamente con la penetración más profunda en el tejido. En la figura 4B, PECAM1 (señal roja) y Endomucin (señal verde) se combinaron anticuerpos para etiquetar las arterias intersomitic (NIA) y venas, respectivamente, de un embrión E11.5. La figura 4C muestra SM22α (señal roja) y la tinción PECAM1 (señal verde) de las NIA en un embrión E11.5. En la Figura 6, los embriones E11.5manchado con PECAM 1 se obtuvieron imágenes inmediatamente después del despacho Babb (Figura 4A), o después de un intervalo de aproximadamente dos meses (Figura 4B). La señal fluorescente era todavía lo suficientemente fuerte a la imagen con éxito después de un almacenamiento prolongado de la muestra en Babb.

Figura 1. La inmunotinción de un corazón E11.5 con Anti-PECAM1 de anticuerpos (detectado con anti-IgG de rata conjugado con Alexa 594). (A, B) de una imagen de 2 x 2 de baldosas se recogió utilizando el objetivo 10X de un microscopio confocal invertido. manchas de anticuerpos PECAM1 tanto endocárdicos y ECS vascular. Las proyecciones (máxima intensidad) se generaron a partir 22 (A) o 5 (B) Z rodajas de cada uno de 4 espesor m, utilizando el software de Fiji. A 'y B' son Enlargemenct de las áreas enmarcadas en A y B, respectivamente. Las flechas en A 'indican vasos sanguíneos de la pared del ventrículo; en B ', el soporte indica el plexo peritruncal. OT, tracto de salida; VI, del ventrículo izquierdo, ventrículo derecho RV. Todas las imágenes son vistas frontales. Las barras de escala en A y B = 200 micras; barras de escala en A 'y B' = 100 micras. Grupo 1B 'fue adaptado de Ivins y col., 2015 ^19. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. La inmunotinción de un corazón E12.5 con Anti-PECAM1 de anticuerpos. El panel A muestra la proyección z (intensidad máxima) de una exploración 2x2 baldosas. La región en caja en A se muestra enlarged en A '; flechas indican múltiples vasos sanguíneos proximal a la aorta (Ao). VI, del ventrículo izquierdo, ventrículo derecho RV. Todas las imágenes son vistas frontales. La barra de escala en A = 200 micras; barra de escala en A '= 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Imagen de la Peritruncal Plexus en un corazón E12.5. Las imágenes confocales de una aorta E12.5 (Ao) se tiñeron con anticuerpo anti-PECAM1 se recogieron utilizando el objetivo 10X. La proyección z (intensidad máxima) en A se genera a partir de 12 rebanadas z (4 micras de espesor); las flechas indican los vasos del plexo peritruncal. El BD 12 rebanadas z fueron divididos en tres sub-pilas como se indica y se utiliza para generar projecti separadacomplementos; puntas de flecha indican las conexiones formadas por el plexo peritruncal a la luz de la aorta. Vasos Peritruncal localizadas ventralmente a la luz de la aorta son visibles en B y C. Todas las imágenes son vistas frontales. Barra de escala = 50 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. Arterias Coronarias y los capilares del plexo en un corazón E15.5. Confocal de imágenes de un corazón E15.5 teñidas con anticuerpo anti-PECAM1 fueron obtenidos mediante el objetivo de 10X. El panel A muestra una proyección de máxima intensidad z generada a partir de 30 rebanadas z (4 micras de espesor); flechas indican las arterias coronarias izquierda y derecha (LCA y RCA) que se pueden ver la conexión con la aorta (Ao). El uso de difet 5 z rebanada sub-apila las válvulas aórtica y pulmonar (AOV y PV) pueden verse en B y C, respectivamente (soportes azules). El plexo capilar ventricular es también clara en estas proyecciones subpila más pequeños; vasos sanguíneos proximal a la válvula pulmonar (caja pequeña) se muestran ampliada en la parte inferior derecha del panel C (caja grande). Fiji se utiliza para resaltar los vasos sanguíneos individuales, por ejemplo, para el panel D del / herramienta Lazo golpe fue usado para llenar las arterias coronarias con el rojo manualmente en cada rebanada z antes de la proyección. Imaris de software se utiliza para crear imágenes en 3D de las arterias (rojo) y luz de la aorta (verde) en E y F; de nuevo esto se hacía manualmente, utilizando la herramienta varita mágica para crear contornos de objetos en cada rebanada z. La opacidad del volumen que rodea puede ser alterado en Modo de mezcla, como en E. Alternativamente, la imagen en 3D puede ser extraído, como se muestra en F . LV: ventrículo izquierdo. Todas las imágenes son vistas frontales. La barra de escala en A = 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5. Formación de imágenes de Embryonic vasculatura. Los paneles A y mostrar imágenes confocal A 'de un embrión de tipo natural E10.5 teñidas con anticuerpo anti-PECAM1, recogidos mediante el objetivo de 10X (exploración de azulejos). Intensidad media proyecciones z se generaron a partir rebanadas z 11-65 (A) y 66 a 110 (A ') de una exploración de rebanada 120 z (4 micras rodajas gruesas), mostrando sólo una ligera pérdida de intensidad de fluorescencia a través del espesor del embrión . El panel B muestra los vasos intersomitic de un embrión E11.5 teñidas con antibod IES contra PECAM1 (señal de rojo de anticuerpo secundario 594 conjugado) y Endomucin (EMCN, señal verde de anticuerpo secundario 488 conjugado), que manchan las arterias intersomitic (flecha) y venas (punta de flecha), respectivamente (proyección de intensidad media z de alicatado escanear). El panel C muestra las arterias intersomitic (NIA) de un embrión de tipo natural E11.5 teñidas con anticuerpos contra PECAM1 (señal verde de anticuerpo secundario conjugado con 488) y SM22α (señal roja del anticuerpo secundario conjugado con 594). Las imágenes confocales se recogieron usando el objetivo seco 20X y se utilizan para generar el máximo proyecciones intensidad z. Todas las imágenes son vistas sagital. Las barras de escala en A y B = 250 micras, barra de escala en C = 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6. Las muestras inmunote~nido despejado en Babb Conservar fluorescente señal durante al menos dos meses. E11.5 embriones se tiñeron con anticuerpos PECAM1 y borran con Babb; embriones del mismo lote fueron imágenes inmediatamente o después de un intervalo de dos meses. El panel A muestra las arterias intersomitic del embrión imagen formada inmediatamente y el panel B muestra el embrión fotografiada dos meses más tarde. Las imágenes confocales se recogieron usando el objetivo seco 10X y se utilizan para generar el máximo proyecciones intensidad z. dAO, aorta dorsal. Las imágenes muestran vistas sagital. Las barras de escala en A y B = 100 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

vasos coronarios en los corazones de embriones enteros fueron imágenes por inmunotinción wholemount con anticuerpo anti-PECAM1 seguido por el aclaramiento óptica y microscopía confocal. El método directo descrito aquí, para la liquidación de los corazones de embriones de ratón con Babb, aumenta la penetración óptica y permite la captura de imágenes de alta resolución de los vasos sanguíneos localizados en las paredes de la aorta y ventriculares. Basado en glicerol de reactivos de montaje tales como Vectashield (índice de refracción 1,45) también se han utilizado para obtener imágenes de la vasculatura coronaria ²² sin embargo, el más alto índice de refracción de Babb (1,56) reduce la dispersión de luz aún más, lo que permite la penetración del tejido más profundo. aclaramiento del tejido evita la necesidad de formas más complejas y costosas de la microscopía como multifotónica y microscopía de lámina de luz que puede ser menos fácilmente disponibles para los investigadores. El proceso de compensación es extremadamente rápida en comparación con otros métodos y ^6-9 para muestras pequeñas pueden ser carried a cabo usando pequeños volúmenes de reactivos directamente en el plato de la microscopía. se requiere tinción robusta de la vasculatura con el fin de lograr imágenes de alta calidad; anticuerpo anti-PECAM1 se seleccionó ya que marca todos los tipos de ECs coronaria y un número de anticuerpos comerciales fueron encontrados para dar adecuadamente altos niveles de tinción. Además, la tinción fluorescente parece ser extremadamente estable en Babb; las muestras almacenadas a temperatura ambiente en Babb (protegido de la luz) conservaron su señal fluorescente durante varios meses. El hecho de que el anticuerpo PECAM1 etiquetas de manera eficiente el endocardio coronaria, así como la vasculatura ocasionalmente fue problemático, especialmente cuando la captura de imágenes del plexo peritruncal. Más fuerte tinción de la luz aórtica en comparación con el peritruncal ECs dio como resultado un riesgo de sobre-saturación en algunas zonas de las imágenes, lo que significa que se requiere un ajuste cuidadoso de los parámetros de imagen. Idealmente, una tinción de anticuerpos solamente vascular ECs sería utilizado; en la práctica,Sin embargo, la búsqueda de anticuerpos adecuados que producen el nivel requerido de tinción wholemount puede ser difícil. Recientemente, la proteína de unión de ácidos grasos 4 (FABP4) se ha demostrado que es un marcador de la coronaria ECs vascular ²³ y por lo tanto puede representar una alternativa a PECAM1.

Con el fin de conservar la morfología 3D de las cámaras del corazón y la aorta las muestras no fueron montadas en plano, pero en cambio fueron reflejado en platos con fondo de vidrio. La profundidad de las muestras en ser fotografiado impedía el uso de objetivos de gran aumento, debido a sus cortas distancias de trabajo. Sin embargo imágenes de alta resolución fueron todavía alcanzable usando un objetivo de 10X mediante el aumento de tiempo de permanencia de píxel y utilizando un tamaño de matriz de píxeles de al menos 1024 x 1024 para la captura de imagen. Esto fue suficiente para el análisis de la estructura y distribución de los vasos coronarios, sin embargo análisis más fino de la estructura celular puede requerir de montaje plana de las muestras. La disección de las partes individuales del corazón para el montaje,por ejemplo, paredes del ventrículo, o en la aorta, también puede ser necesario. Alternativamente, puede llevarse a cabo sobre-muestreo de la imagen seguido de deconvolución con el fin de aumentar la resolución y sensibilidad; Sin embargo, esto requiere mucho más tiempo tiempo de análisis y crea extremadamente grandes archivos de imagen que requieren mucha potencia de computación para procesar.

Corazones de hasta E15.5 fueron imágenes con éxito utilizando este método, y también es posible analizar la vasculatura de los embriones enteros (hasta al menos E11.5) usando el mismo protocolo. Otros tipos de células, por ejemplo, células de músculo liso también se han reflejado en nuestro laboratorio utilizando esta técnica. Para tejidos más gruesos, por ejemplo, corazones mayores de E15.5, la penetración de anticuerpo puede ser un factor limitante; incubaciones más largas y / o el aumento de detergente pueden ser requeridos. Además, en la recogida de una gran pila de imágenes z intensidad de la señal se puede reducir como los láseres penetran en las porciones más alejadas de tejido; sin embargo, la confconfiguración vecinales se pueden ajustar para aumentar la potencia del láser al aumentar la distancia z.

Este método facilita el análisis microscópico confocal de ambas las primeras etapas de la formación de vasos coronarios y el patrón de las arterias coronarias en las etapas de desarrollo posteriores. Toda la información sobre la distribución, la ramificación y la estructura de los vasos sanguíneos puede ser adquirido en un corto período de tiempo, haciendo de esta una herramienta valiosa para el estudio de mutantes genéticos de ratones con defectos específicos en las vías de la angiogénesis.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	Life Technologies	14190-094
Forceps	FST	11251-30
10 cm Petri dishes	Falcon	351029
35 mm Petri dishes	Sigma	P5112
Stainless steel minutien pins 0.2 mm diameter	FST	26002-20
Fine tip pastettes	Alpha Laboratories	LW4061
1,000 ml pipette tips	Sorenson	34000
48-well plate	Falcon	353078
Kwik-Gard	World Precision Instrument	KWIKGARD	Silicone elastomer Sylgard184 packaged in a cartridge for mixing and dispensing
Kwik-Gard refill	World Precision Instrument	KWIKGLUE	Refill cartridges and dispensing tips
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	Make up in PBS and store at -20 °C
100% methanol	VWR	20847307
Tween®20	Sigma	P1379
Goat serum	Sigma	G9023
Anti-PECAM1 antibody, rat anti-mouse	BD Pharmingen	553370	Primary antibody, dilute 1 in 50
Anti-CD31 polyclonal, rabbit polyclonal	Abcam	ab28364	Primary antibody, dilute 1 in 50
Anti-CD31/PECAM1 clone 2H8, armenian hamster monoclonal	Thermo Fisher Scientific	MA3105	Primary antibody, dilute 1 in 400
Endomucin antibody (V.7C7), rat monoclonal	Santa Cruz Biotechnology	sc-65495	Primary antibody, dilute 1 in 50
Anti-SM22 alpha antibody, rabbit polyclonal	Abcam	ab14106	Primary antibody, dilute 1 in 250
Goat anti-rat IgG (H+L)Alexa Fluor 594	Thermo Fisher Scientific	A11007	Secondary antibody, dilute 1 in 500
Goat anti-rabbit IgG (H+L)Alexa Fluor 594	Thermo Fisher Scientific		Secondary antibody, dilute 1 in 500
Goat anti-Armenian Hamster IgG (H+L)Alexa Fluor 488	Abcam	ab173003
Goat anti-rat IgG (H+L)Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A21208	Secondary antibody, dilute 1 in 500
Phenolic screw cap	Wheaton	240408
Benzyl alcohol	Sigma	402834
Benzyl benzoate	Sigma	B6630
Imaris	Bitplane Imaging	image analysis software
ImageJ software	NIH	Freeware