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Resumen

Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.

Resumen

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.

Introducción

Estudio longitudinal del corazón en animales pequeños contribuye a la comprensión de una variedad de enfermedades cardiovasculares relacionadas humanos, tales como defectos cardíacos congénitos relacionados con el gen 1,2. En las últimas décadas, diversos modelos animales, tales como 3,4 ratón, Xenopus 5,6, 7,8 pez cebra, aviar 9, y Drosophila 10-16, se han utilizado para llevar a cabo el corazón-desarrollo humano investigación relacionada. El modelo de ratón se ha utilizado ampliamente para estudiar el desarrollo cardíaco normal y anormal y fenotipos defecto cardíaco debido a sus similitudes con el 3,4 corazón humano. El embrión de Xenopus es especialmente útil en el estudio del desarrollo del corazón debido a su fácil manejo y 5,6 transparencia parcial. La transparencia del embrión y la larva temprana del modelo de pez cebra permite la observación óptica fáciles de 7,8 desarrollo cardíaco. El modelo aviar es un tema común de los estudios del desarrollo del corazón because el corazón se puede acceder fácilmente después de la eliminación de las cáscaras de huevo y la similitud morfológica de los corazones de aves a los seres humanos 9. El modelo de Drosophila tiene algunas características únicas que la hacen ideal para la realización de estudios longitudinales del corazón. En primer lugar, el tubo de corazón de Drosophila es de ~ 200 micras debajo de la superficie dorsal, que proporciona la conveniencia para el acceso óptico y la observación del corazón. Además, muchos mecanismos moleculares y las vías genéticas se conservan entre Drosophila y vertebrados. Los ortólogos de más del 75% de los genes de enfermedades humanas fueron encontradas en Drosophila, que han hecho que sea ampliamente utilizado en estudios transgénicos 11,13. Además, tiene un ciclo de vida corto y bajos costes de mantenimiento, y se ha utilizado comúnmente como un modelo ejemplar para la investigación de la biología del desarrollo 14-16.

En informes anteriores se describen los protocolos para el control de las funciones cardíacas Drosophila como la queArtbeat. Sin embargo, se requieren procedimientos de disección 17,18. de formación de imágenes óptico proporciona una forma eficaz de visualizar el desarrollo cardiaco en animales debido a su naturaleza no invasiva. Las diferentes modalidades de imágenes ópticas se han aplicado en la realización del estudio cardiaco de animales, tales como la microscopía de dos fotones 19, microscopía confocal 20,21, microscopía de luz de hoja 22, y la tomografía de coherencia óptica (OCT) 16,23-26. Comparativamente, la OCT es capaz de proporcionar una gran profundidad de imagen en pequeños corazones de animales sin el uso de agentes de contraste, mientras se mantiene una velocidad de filmación de una ultra alta resolución y, que son importantes para los animales vivos de imagen. Además, el bajo costo de desarrollar un sistema de La OCT ha popularizado esta técnica para la formación de imágenes ópticas de las muestras. Octubre ha sido utilizado con éxito para el estudio longitudinal de Drosophila. OCT, imágenes morfológicas y funcionales cardiaca se ha realizado el estudio de las estructuras del corazón, la funcpapeles cionales de genes, y los mecanismos de defectos cardiovasculares en los modelos de mutantes durante el desarrollo cardiaco. Por ejemplo, disminución de la función cardiaca dependiente de la edad se confirmó con genes regulados hacia abajo-convertidora de angiotensina relacionados con enzimas (ACER) en Drosophila mediante OCT de 27. Fenotipificación de miocardiopatía relacionado con el gen se demostró en Drosophila en OCT 28-33. Investigación en OCT también reveló el papel funcional del gen SOX5 humana en el corazón de Drosophila 34. En comparación con los PTU, OCM utiliza un objetivo con una apertura numérica más alta para proporcionar una mejor resolución transversal. En el pasado, la disfunción del corazón causada por el silenciamiento de genes circadianos un ortólogo humano dCry / dCLOCK se ha estudiado el uso de un sistema OCM personalizada 15,16, así como el efecto de alto contenido de grasa en la dieta-miocardiopatías en Drosophila para entender la obesidad inducida por el hombre enfermedades cardíacas. 15

Aquí, THe protocolo experimental se resume para el estudio longitudinal de los cambios morfológicos y funcionales cardíacos en Drosophila en segundo instar (L2), tercer estadio (L3), pupa día 1 (PD1), pupa día 2 (PD2), pupa día 3 (PD3) , pupa día 4 (PD4), el día 5 de pupa (PD5) y adulto (figura 1) el uso de OCM para facilitar el estudio de las enfermedades cardiacas congénitas relacionadas con el hombre. parámetros funcionales cardíacos, tales como recursos humanos y CAP se analizaron cuantitativamente en diferentes etapas de desarrollo para revelar las características de desarrollo cardiacos.

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Protocolo

1. Preparación del sistema OCM de Imagen Óptico de Drosophila 16

  1. Seleccionar un espectrómetro y una cámara de exploración de líneas de alta velocidad que proporciona una velocidad de al menos 80 cuadros / seg por lo que el sistema OCM será capaz de resolver el latido del corazón de Drosophila.
  2. Utilice una fuente de luz de banda ancha para garantizar una resolución axial de 2 micras para identificar la estructura del corazón de Drosophila.
  3. Utilice un objetivo de 10X para obtener una alta resolución transversal.
  4. Use un espejo de 45 ° varilla para reflejar el haz de luz del brazo de referencia y para generar un haz de luz anular brazo de muestra para extender la profundidad de foco en las muestras.
  5. Desarrollar un programa informático personalizado para controlar el sistema OCM y realizar mediciones.

2. Cultura Drosophila

  1. Estándar Fly Preparación de Alimentos
    1. Ponga ~ 5 ml instantánea fórmula Drosophila en un vial de poliestirenotubo con la ayuda de una bandeja de entrada.
    2. Verter ~ 8 ml de agua en la fórmula para saturar adecuadamente la comida.
    3. Añadir diferentes suplementos para la comida mosca estándar para diferentes experimentos. Cuando se prepara para todos- (ATR) de alimentos trans retinal para la estimulación optogenética experimento 35, utilizar una pipeta para extraer mM ATR 100 y disolverse en ~ 8 ml de agua para obtener la concentración de 1 mM ATR en los alimentos. Después de mezclar la solución de manera uniforme, verter la solución en la fórmula y se remueve suficientemente.
    4. Para preparar un alto contenido de grasa-dieta para el estudio de las disfunciones cardíacas relacionadas con la obesidad en Drosophila, 10,15 mezcla ~ 10 ml fórmula con 15 ml de agua en una taza y el calor durante 30 segundos en un horno de microondas. Ponga un poco de aceite de coco virgen extra ecológico en otra taza y se calienta durante 90 segundos en el microondas.
    5. Extraer 7,5 ml de aceite de coco y mezclar con la fórmula preparada lo suficiente como para hacer que la relación peso / volumen de aceite de coco a la alimentación ~ 30/100, y THen extracto de ~ 2 ml mezclados alimentos y ponerlo a la parte inferior de un tubo.
    6. Esperar durante 1 minuto hasta que el medio está completamente saturado. Compactar la comida cuidadosamente con una superficie plana para optimizar las condiciones de vida de la Drosophila. Añadir 6 - 8 granos de levadura a la fórmula preparada, y enchufe el tubo con un grupo de algodón.
  2. Mosca de la fruta Cruces y Cultura
    1. Tomar un tubo con comida mosca preinstalado de serie, y retirar el algodón enchufado. Transferir cuidadosamente las moscas adultas (masculino y femenino) en el tubo, y conecte el tubo con algodón inmediatamente. Compruebe el algodón para asegurarse de que no hay diferencia entre el algodón y la pared del tubo para evitar que las moscas se escape del tubo.
    2. Mantenga las moscas de la fruta en la incubadora a 25 ° C para la hibridación. La mayoría de los genes son activos y las proteínas celulares se sintetizan a 25 ° C 36-39.
    3. Tome el tubo de salida de la incubadora después de las 8 de transferencia de la mano de la unadult vuela fuera del tubo para obtener los huevos en edad similar para el control experimental.
    4. Continuar el cultivo de los huevos en la incubadora a 25 ° C, que es la temperatura estándar para el desarrollo de Drosophila con el período de desarrollo de 8,5 días 40,41.
      NOTA: La temperatura influye en el período de desarrollo (huevo a adulto) y el nivel de expresión de diversos genes.

3. Realización de imagen óptico con la OCM

  1. Monte larva de la mosca de imágenes ópticas
    NOTA: El huevo de las escotillas de Drosophila en 22 - 24 horas a 25 ° C para el primer estadio larvario (L1). El segundo estadio larvario surge tras otras 24 horas. La forma larvaria más grande es el tercer estadio larvario, que muda después de aproximadamente 24 horas. Características estructurales en larva se pueden utilizar para distinguir sus diferentes etapas de desarrollo. El tamaño de las partes de la boca entre el primero y el segundo instar instar es diferente. La bocaganchos del primer estadio larvario son muy pequeñas y se ven como dos pares de puntos negros diminutos, mientras que los ganchos de la boca del segundo estadio larvario son más grandes y la estructura es más clara. Los espiráculos se utilizan generalmente para identificar el segundo instar y el tercer instar. El segundo estadio larvario ha golpeado espiráculos anteriores, mientras que, para el tercer estadio, los espiráculos anteriores son ramificados. Un anillo de color naranja oscuro comenzará a aparecer en la punta de los espiráculos posteriores en el tercer estadio larvario.
    1. Aplicar un trozo de cinta de doble cara a un portaobjetos de vidrio de microscopio limpio. Expulsar las burbujas de aire debajo de la cinta para evitar los reflejos causados ​​por burbujas de aire durante la exploración.
    2. Tome uno de los tubos con las moscas cultivadas fuera de la incubadora en la etapa larval.
    3. Identificar la larva en los medios de comunicación, eliminarlo de los medios de comunicación con un cepillo suave y colocar en una toalla de papel limpia. Retire cualquier alimento pegado a la larva con un cepillo suave húmedo y secarlo sobre el tejido.
    4. Mueva el cleaned volar a un tejido debajo de la lente objetivo de un microscopio de campo amplio.
    5. Ajuste el enfoque del microscopio para encontrar una visión clara de la marcha. Identificar la etapa de desarrollo de la larva derecho por sus características estructurales con el microscopio.
    6. Posicionar al vuelo usando el cepillo suave. Asegúrese de que el cuerpo es recto con el lado dorsal hacia arriba para preparar para el montaje sobre el portaobjetos de vidrio por el lado dorsal. Realice este paso bajo el microscopio.
    7. Asegúrese de que la larva está completamente seca antes de montar en la cinta. De lo contrario, la larva no se adhiere a la cinta.
    8. Se adhieren el lado dorsal de la mosca de posicionado para la cinta de doble cara en el portaobjetos de vidrio con una presión moderada. Tenga en cuenta que el exceso de presión puede matar a la mosca y muy poca fuerza conducirá a volar movimiento durante la exploración.
  2. Imágenes ópticas de Drosophila en estadios larvales (L2 y L3) con OCM
    NOTA: Una amplia lumen del tubo de corazón puede ser found situada en los segmentos entre A5 a A8 en los estadios larvarios (Figura 1). Las imágenes OCM en modo M transversales (2D + tiempo) fueron adquiridas en el segmento del tubo A7 corazón por cada larva para facilitar la presión sistólica y diastólica análisis.
    1. Coloque la larva montado en la etapa de muestra ajustable del sistema OCM largo de la dirección transversal y-con el lado dorsal hacia arriba por debajo de la lente de objetivo. Un pequeño agujero en la etapa de la muestra es necesario para la colocación de la larva para evitar su contacto con el plano etapa.
    2. Ajuste la etapa de la muestra para mover el tubo de corazón de la mosca de la fruta con el plano focal del haz de formación de imágenes. Para encontrar fácilmente el segmento A7, encontrar la región posterior del tubo de corazón con la cruz en tiempo real imágenes OCM seccionales en el software de adquisición de imágenes. A continuación, pasar la etapa hacia adelante hasta que el segmento A7 es visible.
    3. Ajustar los parámetros del software de adquisición de imágenes a 100 A-scan por B-scan (marco), 100 B-scan y la scannetensión de r para cubrir ~ 0,28 mm en la dirección-x, transversal y 0 V en la dirección y-transversal. Haga clic en el botón "Inicio" en el software para adquirir los datos de ruido de fondo para la sustracción del fondo mediante el bloqueo de la trayectoria del haz de muestra con un paño oscuro.
      NOTA: 3 de los 100 marcos se pueden utilizar para la sustracción de fondo.
    4. Ajustar los parámetros del software de adquisición de datos de hasta 128 A-scan por B-scan, B-scan 4096, y la tensión de escáner para cubrir ~ 0,28 mm en la dirección transversal-x, y 0 V en la dirección y-transversal. Haga clic en el botón "Inicio" en el software para adquirir las imágenes transversales de modo M en todo el segmento del tubo A7 corazón de exclusión aérea sobre una región que cubre 0,28 x 0,57 mm 2 durante unos 30 segundos.
    5. Bloquear el haz de formación de imágenes usando un paño oscuro durante el proceso de almacenamiento de datos para evitar la exposición prolongada del corazón de la mosca de la luz de imagen.
    6. Repita la medición para 5 veces para obtener una medición fiable de la diversión del corazóncción.
    7. Ajustar los parámetros del software de adquisición de imágenes a 400 A-scan por B-scan, 800 B-scan, y el voltaje del escáner para cubrir ~ 1,7 mm en la dirección transversal-x, y ~ 4 mm en la dirección y-transversal. Mover la etapa en ambas direcciones para asegurar la totalidad de la mosca de la fruta se pueden obtener imágenes. Haga clic en el botón "Inicio" en el software de adquirir un conjunto de datos para obtener imágenes de la mosca de la fruta en 3 dimensiones. Nota: La estructura de la mosca 3D se puede representar usando el software Amira 3D
    8. Use un cepillo suave húmedo para humedecer la mosca medido y suavemente sacarlo de la placa de vidrio. Moverlo a un tubo separado para el desarrollo continuo. Etiquetar el tubo para el estudio longitudinal a través de las siguientes etapas de desarrollo.
  3. Imagen de Drosophila en pupa
    NOTA: Todas las moscas de la fruta fueron llevados a cabo para obtener imágenes de PD1 a PD5. Como se muestra en el esquema larva en la Figura 1b, una amplia lumen permanece en A5 a segmentos A8 de THtubo cardíaco e hasta que PD1. De PD2, una cámara cónica comienza a desarrollarse entre A1 a A4 segmentos. Para obtener imágenes coherentes y facilitar el análisis del corazón, imágenes en modo M transversales se obtuvieron del segmento A7 en PD1, y desde el segmento A1 después de PD2, como está marcado en la figura 1b.
    1. Imagen de Drosophila en PD1
      NOTA: Drosophila tendrá un pupario blanco para una ventana de tiempo corto (por 0 - 1 hr) durante PD1. Esta ventana de tiempo es ideal para la realización de imágenes ópticas de pupa antes de tiempo porque la alta transparencia conduce a una mayor penetración de la luz para la formación de imágenes OCM.
      1. A medida que las moscas de la fruta se encuentran en la pared del tubo cuando se convierten en pupa, retire la pupa de tubos individuales para la formación de imágenes en PD1 con un cepillo suave húmedo y limpiar la pupa con el cepillo si hay comida pegados al cuerpo.
      2. Montar la mosca de la fruta en una pequeña placa de vidrio directamente con el pincel mojado y mantener el lado dorsal hacia arriba (Figura 1a ). Asegúrese de que la placa de vidrio es lo suficientemente pequeño como para caber en el tubo de imagen una vez que en esta etapa se ha completado.
      3. Eliminar el exceso de agua desde el lado del cuerpo de la mosca.
      4. Ponga la placa de vidrio en la etapa de la muestra del sistema OCM, manteniendo la mosca de la fruta en la parte superior. Encuentra imagen clara en tiempo real del segmento A7 del corazón mosca utilizando la misma estrategia descrita en la medición larva.
      5. Establecer los mismos parámetros del software de adquisición de datos como en la sección 3.2, y la imagen de los latidos del corazón en el segmento A7 para adquirir modo M transversal y las imágenes en 3D.
      6. Después de la impresión, utilice una pinza para colocar el portaobjetos de vidrio con pupa en el tubo de cultivo continuo.
    2. Imagen de Drosophila en PD2 a las etapas PD5
      NOTA: Como la muestra se vuelve más y más opaca durante las etapas de pupa, se reducirá la profundidad de penetración del sistema de imagen.
      1. Utilice unas pinzas para retirar con cuidado el vaso slide montado con la mosca en PD2 desde el tubo para la imagen. En PD2, la cáscara espécimen vuelve amarillenta y el cuerpo se vuelve menos transparente en comparación con PD1 (Figura 1).
      2. Ponga el cursor en la etapa de la muestra del sistema OCM.
      3. Ajuste la etapa de la muestra para mover la mosca en el plano focal del haz de formación de imágenes del sistema OCM. Encuentra el extremo anterior del tubo cardíaco imagen OCM de la sección transversal en tiempo real con. Mueva ~ 50 micras en la dirección posterior para encontrar el segmento A1 del tubo del corazón.
        NOTA: En este punto del desarrollo del corazón (PD2), la cámara cónica será muy pequeña y no se puede vencer.
      4. Recoger transversales modo M conjuntos de datos del segmento A1, así como datos en 3D utilizando el mismo método que las etapas de desarrollo anteriores.
      5. Ponga la corredera hacia atrás en el tubo cuidadosamente para cultivo continuo.
        NOTA: En PD3, el color de la muestra en la cáscara es más oscuro que en la etapa PD2. En la etapa PD4, rayas negras can ser observado dentro de la cáscara de los especímenes. Algunas moscas se convertirán en adultos a partir de esta etapa del día siguiente, mientras que otros van a evolucionar en PD5. En la etapa PD5, rayas negras son aún ven más claramente en las moscas de la fruta. Estas moscas se convertirán en adultos en el día siguiente.
  4. Imagen de Drosophila en la etapa adulta
    NOTA: En la etapa adulta, las moscas hembras y machos se distinguen por el tamaño del cuerpo y el color de la parte inferior del abdomen. Las hembras adultas tienen un mayor tamaño, mientras que los machos son más pequeños y en la parte inferior del abdomen de color oscuro.
    1. Tome el tubo de salida de la incubadora cuando la mosca de la fruta se convierte en un adulto, y transferir la mosca adulta a un ~ 45 ml vial vacío.
    2. Sumerja el extremo absorbente (~ 1 cm de longitud, ~ 3 mm de diámetro) de una varita en la anestesia, poner la varita en el vial, y conecte el tubo con un racimo de algodón para mantener el extremo anestésico justo por debajo del algodón enchufado ya Anesthetize la marcha durante 3 minutos. La duración de la anestesia depende del tamaño de la marcha, y puede variar entre 2.5 hasta 3.5 min (por ejemplo: hombre de 2,5 min, hembra de 3 o 3,5 min).
    3. Preparar un portaobjetos de vidrio con un trozo de cinta de doble cara.
    4. Mover la mosca anestesiadas en el portaobjetos de vidrio con el lado dorsal hacia arriba usando el cepillo suave.
    5. Se separan las alas utilizando unas pinzas y se adhieren las alas de la cinta bajo un microscopio para fijar la marcha y exponer la región del corazón para la imagen.
    6. La imagen de la mosca del segmento A1 de la mosca del corazón (Figura 1). Al final del experimento, la marcha puede ser sacrificado.

4. Análisis de imágenes 16

  1. Desarrollar programas de Matlab para convertir los archivos binarios en 2D y 3D recogidos con el software de adquisición de imágenes en archivos de imagen.
  2. ImageJ utilizar para identificar la región del tubo del corazón en las imágenes transversales de modo M y un algoritmo de varita mágica para conformarea máscara de la región del corazón de cada imagen en modo M transversal para. Segmento de la región enmascarada y utilizar un algoritmo de pico de investigación para identificar las ubicaciones sistólica y diastólica. Calcular los cambios de diámetro corazón dependientes del tiempo a partir de las imágenes transversales de modo M.
  3. Sobre la base de los diámetros del corazón dependientes del tiempo adquirido, el cálculo de los parámetros cardíacos tales como recursos humanos, período de actividad cardíaca (PAC), extremo de diámetro diástole (EDD), el diámetro final de sístole (ESD), extremo área de la diástole (EDA), y terminar área sístole ( ESA). Calcular la fracción de acortamiento (FS) con figure-protocol-16748
  4. ImageJ utilizar para analizar las imágenes 3D OCM para visualizar el desarrollo estructural del corazón mosca.

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Resultados

La imagen cardiaca longitudinal se llevó a cabo utilizando las moscas de la fruta con el 24B-GAL4 + cepa / a temperatura ambiente con OCM. Las mediciones se realizaron a L2, L3, y cada 8 hr de PD1 a PD4, y de día para adultos 1 (AD1) para realizar un seguimiento del proceso de la metamorfosis (Tabla 1). Larva, pupa temprana, pupa y adulto finales de moscas fueron montados en las placas de vidrio como se ve en la figura 1A. Las características del segmento del corazón para las moscas...

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Discusión

El rápido latido del corazón de Drosophila, con una frecuencia cardíaca máxima alrededor de 400 latidos por minuto en las etapas de larvas y adultos, requiere una alta velocidad de imágenes para resolver los diástole del corazón y sístole (no menos de 80 cuadros / seg sobre la base de experiencias). Debido al pequeño tamaño de la cámara del corazón y micras espesor de la incrustación pared del corazón (5-10 micras), una alta resolución espacial (mejor que 2 micras) se requiere para la resolución...

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Divulgaciones

The authors declare no conflicts of interests related to the current study.

Agradecimientos

This work was supported by the Lehigh University Start-Up Fund, the NIH (R00EB010071 to C.Z., R15EB019704 to C.Z. and A.L., R03AR063271 to A.L., and R01AG014713 and R01MH060009 to R.E.T.), the NSF (1455613 to C.Z. and A.L.), the Cure Alzheimer's Fund (to R.E.T.), and the Massachusetts General Hospital (Executive Committee on Research Award to A.L.). M.C. and Y.M. was supported by the National Key Basic Research Program of China (973 Program) under Grant No. 2014CB340404.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Custom OCM imaging systemDeveloped in our lab
my Temp Mini Digital IncubatorBenchmarkH2200-HC
Cover glassAmScope200PCS
Cotton BallRITE AID
Instant Drosophila FormulaCAROLINAformula 4-24
YeastActiveDry
MicroscopeSONYWILD M420
BrushLoew-Cornell245Bbeing used to move specimens
Labview softwareNational Instruments
ImageJNational Institutes of Health
MatlabMathworks
TweezerWihaAA SAto fix the fruit fly wings
FlyNapCarolina Biological Supply Company4,224,898
Scotch Permanent Double Sided Tape, 3 MScotch
PipetteFisherbrandMU18837
Organic Extra Coconut OilSpring Valley13183
Microscope SlideCapitolBrandM3504-E
Drosophila VialsSEOH8401SS
All-trans-retinalSigma-Aldrich Co.R2500

Referencias

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