Aislamiento y Análisis de citometría de flujo, de Human endocervical Gamma Delta T Cells

Resumen

We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.

Resumen

El tracto reproductivo (FRT) del sistema inmune de la mucosa femenina sirve como la primera línea de defensa. Un mejor conocimiento de la mucosa genital tanto, es esencial para la comprensión de la patogenicidad de diferentes patógenos, incluyendo el VIH. Gamma delta células (GD) T son el prototipo de células T "no convencionales" y representan un grupo relativamente pequeño subconjunto de células T definidas por su expresión de receptores de células T (TCR) heterodiméricas compuestas de cadenas gamma y delta. Esto los diferencia de las células T clásicos y mucho mejor conocidos CD4 ⁺ helper y células T citotóxicas CD8 ⁺ que están definidas por los TCR alfa-beta. GD células T a menudo muestran la localización específica de tejido y se enriquecen en el epitelio. células T GD orquestan la respuesta inmune en la inflamación, la vigilancia de tumores, enfermedades infecciosas, y la autoinmunidad.

A continuación, presentamos un método para aislar y analizar los linfocitos intraepiteliales endocervicales humanos GD T reproducible. nos hacinco muestras endocervicales cytobrush utilizados de mujeres que participan en el Estudio de la Infección por VIH Interinstitucional de la Mujer (WIHS). El conocimiento acerca de GD células T interacciones durante las condiciones en las que hay un insulto a la mucosa vaginal se podría aplicar a cualquier estudio clínico en el que se dirige la vulnerabilidad de la mucosa, incluyendo el desarrollo de la adición microbicides.In vaginal, el conocimiento de las respuestas de células de la mucosa GD T tiene potencial para la aplicación de la terapia inmune basada en células T GD en el tratamiento de enfermedades infecciosas.

Introducción

Desarrollamos metodología de la utilización de muestras de cepillo endocervical para evaluar las células T intraepiteliales GD. El canal cervical está recubierto por una sola capa de epitelio columnar. Linfocitos intraepiteliales representan linfocitos de primera línea que residen dentro de la capa epitelial que rápidamente pueden iniciar la respuesta inmune al encontrarse con microbios patógenos ^{7, 8.} La comprensión de los eventos inmunológicos del compartimiento intraepitelial endocervical es importante para el diseño de estrategias eficaces para prevenir las infecciones, incluido el VIH.

Nuestro método se puede aplicar para muestras endocervicales humanas recién recogidos, así como células endocervicales congelados para explorar aún más el papel de las células T GD intraepiteliales en mujeres con infección por VIH o en riesgo de infección por el VIH. El principal objetivo de este protocolo es descubrir nuevos eventos inmunológicos en el compartimiento intraepitelial endocervical y para evaluatlas respuestas de células T e GD como un marcador de la vulnerabilidad de la mucosa en mujeres con infección por VIH.

Las lagunas en el conocimiento en torno a la inmunidad FGT se deben en parte a la dificultad en la recolección y procesamiento de muestras de mucosa con éxito. Por otra parte, el complejo de la heterogeneidad de las células inmunológicas de las mucosas, y su interconexión con otros, son los principales retos para la identificación de medidas clínicamente relevantes que reflejan el estado y la capacidad del sistema inmunológico. Hemos desarrollado un método para obtener células T intraepiteliales GD altamente purificadas que pueden ser analizados utilizando tecnologías altamente multiplexados, unicelulares que pueden ser críticos para la identificación de los mecanismos subyacentes de la inmunidad FRT más.

Protocolo

Las actividades de estudio se llevaron a cabo en la Universidad de la Unidad de Investigación del VIH de Miami, en colaboración con Estudio de Mujeres Miami VIH Interagencial (WIHS) y el Centro de Miami para la Investigación del SIDA (CFAR) .Institutional Junta de Revisión (Universidad de Miami Miller School of Medicine) se obtuvo la aprobación previa a la contratación y los procedimientos de evaluación o estudio relacionado.

1. Recogida de muestras endocervicales Cepillo

NOTA: Los participantes se sometieron a un examen vaginal realizado por MD entrenado o ginecólogo y colección de los linfocitos intraepiteliales fueron realizadas bajo examen con espéculo mediante la inserción de citocepillo.

1. características de los participantes
   1. Reclutar mujeres participantes que tienen edades comprendidas de 18 a 45 años de edad, sexualmente activas, no embarazadas y no en medicamentos anticonceptivos o con un dispositivo intrauterino.
   2. Antes de la exploración vaginal, pida a los participantes se someten a un retiro de 10 ml de sangre en verdetop tubos al vacío de heparina para el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (CMSP). para servir como control para el análisis intraepitelial endocervical ^9.
2. Recolección de las muestras endocervicales
   1. Insertar un espéculo estéril del tamaño adecuado en la vagina sin lubricación. Use un agua caliente para facilitar la inserción del espéculo y gasa estéril para limpiar el moco. La posición del espéculo permite la visualización completa del sistema operativo y el exocérvix.
   2. Inserte cepillo endocervical en el conducto cervical hasta que sólo las cerdas más cercanos a la mano son visibles. Girar el cepillo de las agujas del reloj para 360 °. Transferir el cepillo en un tubo de 15 ml que contenía 5 ml de medio IMDM.
   3. Inmediatamente después de la recolección, se coloca el tubo que contiene citocepillo en hielo. Para obtener una alta viabilidad de las células intraepiteliales recogidos, entregar el citocepillo al laboratorio y proceso dentro de 1 h.

2. Endocervical Procesamiento de Muestras citocepillo

1. tubo de vórtice que contiene citocepillo endocervical la aplicación de 4 tiempos (10 seg) cortos.
2. Centrifugar el tubo, que contiene cytobrush, durante 10 minutos a 250 x g.
3. Retire cuidadosamente la cytobrush desde el tubo (no molestar el sedimento en el fondo del tubo) y se añade 1 ml de medio IMDM y colocar el tubo en hielo.
4. Coloque el cytobrush en el filtro de células 100 mm en la parte superior del tubo 50 ml.
5. Lavar el citocepillo con 20 ml de IMDM.
6. Tubo de centrífuga durante 10 min a 250 x g.
7. Se decanta el sobrenadante y resuspender las células sedimentadas en 1 ml de IMDM y se combinan con el sedimento se volvió a suspender ya descrito en el punto 2.3.
8. Contar las células usando un contador de células automatizado ¹⁰ o contar las células usando un hemocitómetro mediante la combinación de 10 l de la suspensión celular con 10 l de colorante azul de tripano. pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo diez veces para mezclar las células y el tinte. Carga de 10 lde la mezcla en la abertura de una de las dos cámaras de hemocitómetro. Contar todas las células en las cinco áreas de la cuadrícula. Mantenga un recuento separado de las células viables y no viables. Determinar la viabilidad celular utilizando la siguiente fórmula:% de células viables = células no viables x 100 células totales / número de células.
   Determinar la concentración posterior de células por ml (y el número total de células) usando los siguientes cálculos. Las células totales por ml x = células totales contadas (factor de dilución / número de cuadrados contados) x 10.000 células / ml.
9. Congelar las células endocervicales aislados utilizando medio de congelación que contiene 10% de DMSO y 90% de SFB.

3. citometría de flujo

1. Vuelva a suspender 1-3 x 10 ⁵ células endocervicales en 100 l de tampón FACS (PBS que contiene 1% de albúmina de suero bovino
2. Añadir 1 l / 10 ⁶ LIVE / DEAD kit Muerto Amarillo corregible de la mancha de células y anticuerpos para marcadores de superficie en las concentraciones descritas en la Tabla 1.
3. Se incuban las células durante 30 minutos a 4 ° C, protegido de la luz.
4. Añadir 1 ml de tampón FACS y las células y los tubos de centrífuga durante 5 minutos a 350 xg
5. Vuelva a suspender el sedimento celular en 300 l 1% de paraformaldehído.
6. Preparar los controles de compensación usando perlas y los anticuerpos utilizados para la tinción mediante la adición de 100 l de tampón de FACS y una gota de las perlas y la misma concentración de los anticuerpos utilizados para la tinción de la muestra.
7. Adquirir perlas de colores y muestras en un citómetro de flujo, equipado con 405 nm, 488 nm y 635 nm láseres.

4. aislamiento de células endocervicales gamma delta T

1. Aislamiento de perlas magnéticas
   1. Vuelva a suspender el sedimento celular endocervical (≤10 ⁷ células totales), se describe en 2.6, en 40 l de tampón incluido en el kit de microperlas gamma delta TCR referencia en la tabla de Materiales y Reactivos.
   2. Siga las instrucciones del juego para protocolo de tinción de dos pasos: en primer lugar, el ingenioh anti-TCR gamma delta hapteno-anticuerpo y el segundo, con anti-hapteno microperlas-FITC
   3. Después de la incubación de 15 min a 4-8 ° C, se lavan las células mediante la adición de 1 ml de tampón y se centrifuga a 300 xg durante 10 min. Decantar el sobrenadante invirtiendo el tubo, y toque seco con la ayuda de un trozo de papel.
   4. Vuelva a suspender el sedimento celular en 500 l de tampón proporcionado y preparar la columna magnética, colocándolo en un separador magnético adecuado de acuerdo con el protocolo del proveedor.
   5. Aplicar la suspensión celular en la columna y recoger las células no marcadas que atraviesan la columna y lavar 3 veces con cantidad apropiada de tampón (500 l). Realizar las etapas de lavado mediante la adición de tampón tres veces, cada vez una vez que el depósito de la columna está vacía. Recoger efluente total. Esta es la fracción de células sin marcar, negativo
   6. Eliminar la columna forman el separador magnético y una pipeta de 1 ml de tampón en la columna y de inmediato a eliminar fracción con la etiqueta magnéticamentecélulas ed aplicando firmemente el émbolo suministrado con la columna.
      NOTA: gamma-delta, aislada de células T ya están manchadas con fluorescencia para el análisis por citometría de flujo, ya marcadas magnéticamente microperlas anti-hapteno se conjugan con FITC colorante fluorescente.
2. la clasificación de células
   1. Para la clasificación de células, la etiqueta células endocervicales con troquel viabilidad y panel de anticuerpos tal como se describe en la sección 3.
   2. Configurar puertas electrónicas en el vivo, CD45 ⁺ CD3 ⁺ y delta gamma células positivas y llevar a cabo la clasificación de células.

Resultados

Recientemente, se analizaron las células T intraepiteliales GD endocervicales y que fueron los primeros en reportar sobre la pérdida de células T gamma delta endocervical en mujeres infectadas por el VIH ^{9, 11.} Aquí, se describe el protocolo para aislar y analizar el subconjunto de células T gamma delta endocervical. Como se muestra en la Figura 1, las células T GD pueden ser detectados fácilmente en las m...

Discusión

Evaluación de la vulnerabilidad de la mucosa del tracto genital inferior femenino es un componente esencial de los estudios clínicos que abordaron riesgo de adquisición y transmisión del VIH. Típicamente FGT vulnerabilidad a la infección del VIH se evalúa midiendo moduladores inmunes solubles en las secreciones genitales (citoquinas, quimioquinas y péptidos antimicrobianos) ^{12, 13.} Sin embargo, estos biomarcadores son sólo indicativos de inflamación va...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cytobrush Plus GT	(CareFusion, San Diego, CA, USA
IMDM,Iscove's Modified Dulbecco's Medium	ThermoFisher Scientific	12440061
Beckman Coulter automated cell counter (The Vi-CELL Series Cell Viability Analyzer	Beckman Coulter	496178
DMSO, Dimethyl sulfoxide	Sigma Aldrich	D2650
FBS, Fetal Bovine Serum	Invitrogen, Gibco	26140-079
PBS	Invitrogen, Gibco	10010023
BSA	Sigma Aldrich	A-9647
LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit	Life Technologies,	L349S9
1% paraformaldehyde	Sigma Aldrich	D6148
Fortessa flow cytometer	Becton Dickinson
UltraComp eBeads	eBioscience	01-2222-42
ArC Amine Reactive Compensation Beads (Life Technologies, Grand Island, NY, USA)	Life Technologies	A10346
anti-TCR gamma/delta MicroBead Kit	Milteny Miltenyi Biotec Inc.	130-050-701
MS column		103-042-201
MACS separator		4124