Isolamento e Citometria de Fluxo Analysis of Human Endocervical Gama Cells Delta T

Resumo

We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.

Resumo

O trato reprodutivo (FRT) da mucosa sistema imunológico feminino serve como a primeira linha de defesa. Melhor conhecimento da mucosa genital é, portanto, essencial para a compreensão da patogenicidade de diferentes patógenos, incluindo o HIV. Gama células delta (GD) T são o protótipo de células T 'não convencionais' e representam um subconjunto relativamente pequeno de células T definidos pela sua expressão de receptores de células T heterodiméricos (TCRs) compostas de cadeias gama e delta. Isso os diferencia das células T clássicos e muito melhor conhecidos CD4 ⁺ auxiliares e células CD8 ⁺ T citotóxicos que são definidos por TCRs alfa-beta. GD células T muitas vezes mostram a localização específica do tecido e são enriquecidos em epitélio. GD células T orquestrar respostas imunes em inflamação, vigilância de tumores, doenças infecciosas e auto-imunidade.

Aqui, apresentamos um método para isolar reprodutível e analisar linfócitos intra-epiteliais endocervicais humanos GD T. que have amostras cytobrush endocervicais usados ​​mulheres participantes Infecção Estudo Interagency HIV das Mulheres (WIHS). Conhecimento sobre GD células T interações durante as condições em que não é um insulto à mucosa vaginal poderia ser aplicada a qualquer estudo clínico em que a vulnerabilidade das mucosas são os destinatários, incluindo o desenvolvimento de adição microbicides.In vaginal, o conhecimento sobre as respostas das células da mucosa GD T tem potencial para aplicação de terapia imunitária baseada em células T GD no tratamento de doenças infecciosas.

Introdução

Nós desenvolvemos metodologia de utilização de amostras escova endocervical para avaliar células GD T intra-epitelial. O canal endocervical é recoberto por uma camada única de epitélio colunar. Linfócitos intra-epiteliais representam linfócitos linha de frente que residem na camada epitelial que podem iniciar rapidamente as respostas imunes ao encontrar micróbios patogênicos ^{7, 8.} Compreender os eventos imunológicos do compartimento intra-epitelial endocervical é importante para a concepção de estratégias eficazes para prevenir infecções, incluindo o HIV.

O nosso método pode ser aplicado a amostras endocervicais humanos recentemente recolhidos, bem como células endocervicais congelados para explorar ainda mais o papel das células T intra-epiteliais GD em mulheres com infecção por VIH ou em risco de infecção pelo HIV. O principal objectivo deste protocolo é descobrir novos eventos imunológicos no compartimento intra-epitelial endocervical e Avaliado comrespostas de células e GD T como um marcador de vulnerabilidade da mucosa em mulheres com infecção pelo HIV.

As lacunas substanciais no conhecimento em torno imunidade FGT são parcialmente devido à dificuldade na recolha e processamento de amostras de mucosa com sucesso. Além disso, o complexo de heterogeneidade das células imunes das mucosas, e a sua interligação uns com os outros, são os principais desafios para a identificação de medições clinicamente relevantes que reflectem o estado e a capacidade do sistema imunitário. Nós desenvolvemos um método para obter células T GD intra-epitelial altamente purificados que podem ser analisados ​​usando tecnologias altamente multiplexados, de uma única célula que pode ser fundamental para identificar os mecanismos subjacentes da imunidade FRT.

Protocolo

atividades de estudo teve lugar na Universidade de Miami Unidade de Pesquisa de HIV em colaboração com Estudo das Mulheres Miami HIV Interagency (WIHS) e do Centro Miami for AIDS Research (CFAR) .Institutional Review Board (Universidade de Miami Miller School of Medicine) aprovação foi obtida antes ao recrutamento e quaisquer procedimentos de avaliação ou de estudos relacionados.

Coleta de Amostras 1. Endocervical Escova

NOTA: Os participantes foram submetidos a um exame vaginal realizado por MD treinados ou ginecologista e recolha de linfócitos intra-epiteliais foram realizadas em exame especular, inserindo cytobrush.

1. As características dos participantes
   1. Recrutar mulheres participantes que estão com idade de 18 a 45 anos de idade, sexualmente ativa, não está grávida e não em medicamentos contraceptivos ou com um dispositivo intra-uterino.
   2. Antes do exame vaginal, têm participantes passam por um empate de 10 mL de sangue em verdeVACUTAINERS heparina superior para o isolamento periférico de células mononucleares do sangue (PBMC). para servir como um controle para análise intra-epitelial endocervical ^9.
2. Coleta das amostras endocervicais
   1. Inserir um espéculo estéril de tamanho apropriado na vagina sem lubrificação. Usar uma água quente para facilitar a inserção do espéculo e gaze estéril para limpar o muco. A posição do espéculo permite a visualização completa do sistema operacional e ectocérvice.
   2. Insira escova endocervical no canal endocervical até que apenas as cerdas mais próxima da mão são visíveis. Girar a escova para 360 °. Transferir a escova para um tubo de 15 ml contendo 5 ml de meio IMDM.
   3. Imediatamente após a coleta, colocar o tubo contendo cytobrush no gelo. Para obter uma alta viabilidade das células intra-epitelial recolhidos, entregar o cytobrush para o laboratório e processo dentro de 1 h.

2. Processamento Endocervical Amostra cytobrush

1. tubo de vórtice contendo cytobrush endocervical aplicando 4 cursos de curta duração (10 seg).
2. Centrifuga-se o tubo, contendo cytobrush, durante 10 min a 250 x g.
3. Cuidadosamente remover o cytobrush a partir do tubo (não perturbar o sedimento no fundo do tubo) e adicionar 1 mL de meio IMDM e colocar o tubo em gelo.
4. Colocar o cytobrush no filtro de células 100 milímetros na parte superior do tubo de 50 ml.
5. Lave o cytobrush com 20 ml de IMDM.
6. tubo de centrifugação durante 10 min a 250 x g.
7. Decantar o sobrenadante e ressuspender as células peletizadas em 1 ml de IMDM e combinam-se com o sedimento ressuspenso já descrito em 2.3.
8. Contar as células utilizando um contador de células automatizado ¹⁰ ou contar as células utilizando um hemocitómetro, combinando 10 ul da suspensão celular com 10 ul de corante azul de tripano. Suavemente pipeta cima e para baixo dez vezes para misturar as células e corante. Carga de 10 ulda mistura para dentro da abertura de uma das duas câmaras de hemocitómetro. Contar todas as células nas cinco áreas de grade. Manter uma contagem separada de as células viáveis ​​e não viáveis. Determinar a viabilidade celular usando a seguinte fórmula:% de células viáveis ​​= células não viáveis ​​x 100 células / total de número de células.
   Determinar a concentração de células por ml subsequente (e o número total de células) utilizando os seguintes cálculos. Total de células por ml = x total de células contadas (fator de diluição / número de quadrados contados) x 10.000 células / ml.
9. Congelar as células endocervicais isolados utilizando meio de congelamento contendo 10% de DMSO e 90% de FBS.

3. Citometria de Fluxo

1. Re-suspender a 1-3 x 10 ⁵ células endocervicais em 100 ul de tampão de FACS (PBS contendo 1% de albumina de soro bovino
2. Adicionar 1 mL / 10 ⁶ Live / Dead fixável kit celular mancha amarela inoperante e anticorpos para marcadores de superfície nas concentrações descritas na Tabela 1.
3. Incubam-se as células durante 30 min a 4 ° C, protegidos da luz.
4. Adicionar 1 mL de tampão de FACS e as células e tubos de centrifugação durante 5 min a 350 xg
5. Re-suspender a pelete de células em 300 uL de paraformaldeído a 1%.
6. Preparar controlos de compensação usando grânulos e anticorpos utilizados para a coloração por adição de 100 uL de tampão de SCAF e uma gota de os grânulos e a mesma concentração dos anticorpos utilizados para a coloração da amostra.
7. Adquirir pérolas coradas e as amostras num citómetro de fluxo, equipado com 405 nm, 488 nm e 635 nm lasers.

4. Endocervical Gamma delta T Isolamento celular

1. Isolamento esférulas magnéticas
   1. Re-suspender a pelete de células endocervicais (≤ 10 ⁷ células totais), descrito em 2.6, em 40 mL de tampão incluídos no kit micropérola gama delta TCR referenciado na Tabela de Materiais e Reagentes.
   2. Siga as instruções do kit para protocolo de coloração de duas etapas: primeiro, sagacidadeh anti TCR-delta gamma de hapteno-anticorpo e, segundo, com anti-hapteno microbeads-FITC
   3. Após a incubação de 15 min a 4-8 ° C, lavar as células por adição de 1 ml de tampão e centrifugar a 300 xg durante 10 min. Decantar o sobrenadante por inversão do tubo, e toque em seco com a ajuda de um pedaço de papel.
   4. Re-suspender o sedimento celular em 500 uL de tampão fornecido e preparar a coluna magnética, colocando-o num separador magnético apropriado de acordo com o protocolo do fornecedor.
   5. Aplicar a suspensão de células na coluna e recolher células não marcadas que passam através da coluna e lavar 3x com a quantidade apropriada de tampão (500 uL). Executar passos de lavagem através da adição de tampão três vezes, cada vez que uma vez que o reservatório está vazio da coluna. Recolha efluente total. Esta é a fracção de células não marcado, negativo
   6. Retirar a coluna do separador magnético formar e pipeta de 1 ml de tampão para a coluna e imediatamente expulsar fracção com o rótulo magneticamenteed células, aplicando firmemente o êmbolo fornecidas com a coluna.
      NOTA: célula isolada T gama delta já estão fluorescente corada para análise de citometria de fluxo desde marcadas magneticamente microesferas anti-hapteno são conjugados com FITC corante fluorescente.
2. separação de células
   1. Para separação de células, as células endocervicais de etiquetas com die viabilidade e painel de anticorpos, como descrito na seção 3.
   2. Configurar portões eletrônicos na ao vivo, CD45 ⁺ CD3 ⁺ e delta gamma células positivas e executar separação de células.

Resultados

Recentemente, analisamos células GD T intraepiteliais endocervicais e fomos o primeiro a relatar sobre a perda de células T gama delta endocervical em mulheres infectadas pelo HIV ^{9, 11.} Aqui, descrevemos o protocolo para isolar e analisar o subconjunto de células T gama delta endocervical. Como mostrado na Figura 1, as células T GD pode ser facilmente detectado em amostras de células endocervicais humanos. ...

Discussão

Avaliação da vulnerabilidade das mucosas do tracto genital inferior feminino é um componente essencial de estudos clínicos que abordam risco de aquisição e transmissão do HIV. Tipicamente FGT vulnerabilidade à infecção do HIV é avaliada através da medição moduladores imunitários solúveis em secreções genitais (citocinas, quimiocinas e péptidos antimicrobianos) ^{12, 13.} No entanto, estes biomarcadores são apenas indicativos da inflamação vagi...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cytobrush Plus GT	(CareFusion, San Diego, CA, USA
IMDM,Iscove's Modified Dulbecco's Medium	ThermoFisher Scientific	12440061
Beckman Coulter automated cell counter (The Vi-CELL Series Cell Viability Analyzer	Beckman Coulter	496178
DMSO, Dimethyl sulfoxide	Sigma Aldrich	D2650
FBS, Fetal Bovine Serum	Invitrogen, Gibco	26140-079
PBS	Invitrogen, Gibco	10010023
BSA	Sigma Aldrich	A-9647
LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit	Life Technologies,	L349S9
1% paraformaldehyde	Sigma Aldrich	D6148
Fortessa flow cytometer	Becton Dickinson
UltraComp eBeads	eBioscience	01-2222-42
ArC Amine Reactive Compensation Beads (Life Technologies, Grand Island, NY, USA)	Life Technologies	A10346
anti-TCR gamma/delta MicroBead Kit	Milteny Miltenyi Biotec Inc.	130-050-701
MS column		103-042-201
MACS separator		4124