JoVE Logo
Autores
Contáctenos

Iniciar sesión

Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

En este artículo

  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Después de la preparación de un anticuerpo monoclonal modificado-Cu 64 la unión a un receptor de células T murino transgénico, las células T son radiomarcado in vivo, se analizaron para viabilidad, la funcionalidad, la estabilidad etiquetado y apoptosis, y adoptivamente transferidas en ratones con una vía aérea hipersensibilidad de tipo retardado reacción para formación de imágenes no invasiva mediante tomografía de emisión de positrones / tomografía computarizada (PET / CT).

Resumen

Este protocolo ilustra la producción de 64 Cu y el quelante de conjugación / radiomarcaje de un anticuerpo monoclonal (mAb), seguido de cultivo de células de linfocitos murinos y receptor 64 Cu-anticuerpo dirigido de las células. Evaluación in vitro de se describen el radiomarcador y no invasiva en el rastreo de células in vivo en un modelo animal de una reacción de hipersensibilidad de tipo retardado de la vía aérea (DTHR) por PET / CT.

En detalle, se muestra la conjugación de un mAb con el quelante de ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacético (DOTA). Después de la producción de radioactivo 64 Cu, radiomarcaje del mAb DOTA-conjugado se describe. A continuación, la expansión de la ovoalbúmina de pollo (COVA) CD4 específica de + interferón (IFN) -γ productoras se representan las células T helper (cova-Th1) y el posterior radiomarcaje de las células cova-TH1. Diversas técnicas in vitro se presentan para evaluar la efefec- de 64 Cu-radiomarcaje en las células, tales como la determinación de la viabilidad celular por exclusión de azul de tripano, la tinción para la apoptosis con Anexina V para citometría de flujo, y la evaluación de la funcionalidad mediante la enzima de ensayo inmunoabsorbente ligado a IFN-γ (ELISA) . Además, la determinación de la absorción radiactiva en las células y la estabilidad de etiquetado se describen en detalle. Este protocolo describe además cómo realizar estudios de seguimiento de células en un modelo animal para una DTHR las vías respiratorias y, por lo tanto, se incluye la inducción de la vía aérea DHTR aguda inducida por cova en ratones BALB / c. Por último, se presenta un robusto flujo de trabajo de PET / CT incluyendo la adquisición de imágenes, reconstrucción y análisis.

El enfoque dirigido a un receptor 64 Cu-anticuerpo con la subsiguiente internalización del receptor proporciona una alta especificidad y estabilidad, la reducción de la toxicidad celular, y las bajas tasas de flujo de salida en comparación con PET comunes trazadores para el etiquetado de células, por ejemplo 64 Cubis -pyruvaldehyde (N4-metiltiosemicarbazona) (64 Cu-PTSM). Por último, nuestro enfoque permite no invasivo en el seguimiento in vivo de células mediante PET / CT con una relación óptima de señal a fondo durante 48 h. Este enfoque experimental se puede transferir a diferentes modelos animales y tipos de células con receptores unidos a la membrana que se internalizan.

Introducción

Seguimiento de células no invasiva es una herramienta versátil para controlar la función celular, la migración y homing in vivo. Recientes estudios de seguimiento celular se han centrado en mesenquimales 1, 2 o de médula ósea las células madre derivadas de 3 en el contexto de la medicina regenerativa, las células blancas de la sangre periférica autólogas en la inflamación o linfocitos T en las terapias con células adoptivas contra el cáncer de 3, 4. La elucidación de los sitios de acción y los principios biológicos subyacentes de las terapias basadas en células es de tremenda importancia. Linfocitos T citotóxicos CD8 +, por ingeniería genética del receptor de antígeno quimérico (CAR) las células T o linfocitos infiltrantes de tumor (TIL) fueron consideradas ampliamente como el estándar de oro. Sin embargo, las células TH1 específicos de antígeno asociado a tumores han demostrado ser una opción de tratamiento alternativa efectiva 4, </ sup> 5, 6, 7.

Como actores clave en la inflamación, enfermedades autoinmunes específicas de órganos (por ejemplo, la artritis reumatoide o el asma bronquial), y células de gran interés en la inmunoterapia del cáncer, es importante para caracterizar los patrones de distribución y homing temporales de células TH1. No invasiva in vivo de formación de imágenes por PET presenta un método cuantitativo, altamente sensible 8 para examinar los patrones de migración de células, en homing vivo, y los sitios de acción y las respuestas de células T durante la inflamación, alergias, infecciones o el rechazo del tumor 9, 10, 11.

Clínicamente, 111 In-oxina se utiliza para la gammagrafía de leucocitos para la discriminación de la inflamación y la infección 12, mientras que 2-desoxi-2- (18F) fluoro-D-glucosa (18 F-FDG) se utiliza comúnmente para estudios de seguimiento celular por PET 3, 13. Una desventaja importante de este trazador PET, sin embargo, es la corta vida media del radionúclido 18 F a 109,7 min y la baja estabilidad intracelular que impide de formación de imágenes en los puntos de tiempo posteriores poste de transferencia de células adoptivas. Para más largo plazo en los estudios de seguimiento de células in vivo por PET, aunque inestable en las células, 64 Cu-PTSM se utiliza con frecuencia para etiquetar de manera no específica las células 14, 15 con efectos perjudiciales minimizadas en la viabilidad de las células T y la función 16.

Este protocolo describe un método para reducir aún más efectos desventajosos sobre la viabilidad celular y la función utilizando un receptor de células T (TCR) mAb radiomarcado específico de. En primer lugar, la producción del radioisótopo 64 Cu, la conjugación del mAb KJ1-26 con ésimoe quelante DOTA, y la posterior 64 Cu-radiomarcaje se muestran. En una segunda etapa, el aislamiento y la expansión de las células cova-TH1 de ratones donantes DO11.10 y el radiomarcado con 64 cargado-Cu DOTA-conjugado mAb KJ1-26 (64 Cu-DOTA-KJ1-26) se describen en detalle. La evaluación de los valores de captación y de flujo de salida de la radiactividad con un calibrador de dosis y por gamma-conteo, respectivamente, así como la evaluación de los efectos de 64 Cu-radiomarcaje sobre la viabilidad celular por exclusión de azul de tripano y la funcionalidad con se presentan IFN-gamma ELISA . Para no invasivo en el seguimiento de células in vivo, se describen la obtención de un modelo de ratón de inducida por COVA vías respiratorias aguda DTHR y Adquisición de imágenes por PET / CT después de la transferencia celular adoptiva.

Además, este enfoque de etiquetado puede ser transferido a diferentes modelos de enfermedad, las células T murinas con diferentes TCR o células generales de interés con los receptores unidos a la membrana o mar expresiónkers subyacente membrana continua shuttling 17.

Protocolo

Precauciones de seguridad: Al manipular la radiactividad, almacenar 64 Cu detrás de ladrillos de plomo 2 pulgada de grosor y utilizar respectivo blindaje para todos los buques que llevan actividad. Utilizar las herramientas adecuadas para manejar indirectamente fuentes sin blindaje para evitar el contacto directo de las manos y reducir al mínimo la exposición a material radiactivo. Siempre use insignias de monitoreo dosimetría de radiación y equipo de protección personal y comprobar uno mismo y la zona de trabajo para la contaminación de abordar inmediatamente. Desechar el equipo de protección personal potencialmente contaminado antes de salir de la zona donde se utiliza material radiactivo. Almacenar toda los residuos radiactivos detrás de blindaje de plomo hasta que el radiactiva 64 Cu se han debilitado (aproximadamente 10 vidas medias = 127 h) antes de su eliminación adecuada.

1. 64 Cu Producción

NOTA: El radioisótopo 64 Cu se produce a través de la 64 Ni (p, n) 64 Cu reacción nuclear utilizando un Pettciclotrón carrera de acuerdo con un protocolo modificado de McCarthy et al. 18.

  1. Por 64 la producción de Cu, irradiar 64 Ni, que se galvaniza en un plato de platino / iridio (90/10), con 30 μA durante 6 h con un haz de protones de 12,4 MeV.
  2. Calentar el objetivo de platino / iridio a 100 ° C en una cámara de polieteretercetona dedicado (PEEK) y se incuban en 2 ml de HCl concentrado durante 20 min para disolver 64 Cu / 64 Ni.
  3. Añadir otro 1 ml de HCl concentrado y se incuba durante 10 min.
  4. Evaporar HCl utilizando una corriente de argón y se enfría la cámara a temperatura ambiente.
  5. Enjuague la cámara con 3 ml de 4% M HCl 0,2 y 96% de metanol (v / v) y la transferencia de esta solución a una columna de intercambio de iones que fue pre-acondicionado con 4% de HCl 0,2 M en metanol durante al menos 15 min. El flujo a través se puede utilizar para reciclar 64 Ni.
  6. Lavar el 64 Cu retenido en la columna con 4% 0,2 M HCl in metanol.
  7. Eluir 64 Cu con 70% M HCl 1,3 / 30% isopropanol (v / v) en un vial de recogida, se evapora la solución en una corriente de argón y dejar que el vial enfriar a temperatura ambiente.
  8. Disolver 64 Cu en 140-210 l de HCl 0,1 M.

2. Anticuerpo conjugación con DOTA y posterior 64 Cu-radiomarcaje

NOTA: El quelante DOTA estará vinculado a grupos amino funcionales del mAb por N-hidroxisuccinimida (NHS) química éster y el conjugado se pueden radiomarcar subsiguientemente con 64 Cu 19.

  1. Ajustar la concentración de la KJ1-26-mAb a 8 mg / ml y diafiltrado 1 ml de mAb solución contra 0,1 M Na 2 HPO 4 pH 7,5 se trató con 1,2 g / L de una resina de intercambio de iones quelante usando un corte de peso molecular ( MWCO 30 kDa) unidad de filtro centrífugo. Aplicar 3 etapas de lavado subsiguientes con 14 ml del tampón. Después de la etapa de lavado final,concentrar la solución de nuevo a 1 ml. Cuantificar la concentración de anticuerpo mediante mediciones de DO 280 nm.
  2. Preparar una solución de DOTA-NHS en ultrapura o agua de calidad para PCR a una concentración de 10 mg / ml inmediatamente antes del uso. Deje el vial ajustar a la temperatura ambiente antes de abrir para evitar la condensación de agua, y cuidadosamente eliminar DOTA-NHS usando una espátula de plástico. Añadir 216! L de esta solución de DOTA-NHS a 8 mg de la solución diafiltrada KJ1-26-mAb, mezclar a fondo, y se incuba durante 24 horas a 4 ° C en un mezclador de tambor.
  3. Diafiltrado la DOTA-KJ1-26-mAb frente a acetato de amonio 0,25 M, pH 7,0, se trató con 1,2 g / L de una resina de intercambio de iones quelante, usando un corte de peso molecular (MWCO 30 kDa) unidad de filtro centrífugo. Aplicar 7 etapas de lavado. Se concentra el mAb a un volumen final de 1 ml y de nuevo medir la concentración de proteína mediante medidas de 280 nm de DO.
  4. Antes de radiomarcaje, intercambiar el tampón de la DOTA-KJ1-26-mAb a PBS a través de tamaño-exccromatografía lusion usando columnas de filtración en gel. Esto también elimina posibles impurezas de molécula pequeña.
  5. Preparar 100 MBq solución 64 CuCl 2 en HCl 10 mM y ajustar el pH a 6-7 con 10x PBS. Añadir 200 g de DOTA-KJ1-26 mAb. Incubar durante 60 min a 37 ° C.
  6. Para el control de calidad, lleve a cabo cromatografía en capa fina con citrato de sodio 0,1 M (pH 5) como fase móvil y analizar por autorradiografía. Al menos el 90% de la actividad debe ser unido al anticuerpo y por lo tanto ser detectada en el punto de partida. actividad no unido se quelado por la fase móvil a base de citrato y rayas para el frente del disolvente. Para una referencia, se aconseja el uso de CuCl 64 2.

3. pollo ovoalbúmina-específico TH1 (cova-TH1) aislamiento de células y de expansión

NOTA: El cultivo de células TH1 se describe de acuerdo con los estudios publicados previamente 16, 17.

  1. Aislar los bazos y los ganglios linfáticos extraperitoneal (LNS) de ratones DO11.10.
    1. Sacrificar el ratón de acuerdo a las regulaciones federales. Desinfectar el animal con 70% de etanol y fijar con cinta adhesiva para la eliminación del bazo y LN. Hacer una incisión media y separar la piel del peritoneo por lateralmente tirando de él a cada sitio.
    2. Localizar la cervical, axial, braquial y los LN inguinales. Retire ellos con unas pinzas romas y colocarlos en 1% de suero de ternera fetal (FCS) / tampón PBS.
    3. Abrir el peritoneo y localizar el bazo. Separar el bazo del páncreas y tejido conectivo y colocarlo en tampón FCS / PBS 1%. Para mayor orientación, véase las referencias 20,21.
  2. Pique bazo y LN a través de un filtro de 40 micras en una de 50 ml de tornillo tubo con tapón utilizando el émbolo de una jeringa. Enjuague el filtro con 10 ml de 1% de FCS / PBS-buffer.
  3. Centrifugar a 400 xg durante 5 min y separar el sobrenadante. SubsequenTLY, lleve a cabo la lisis de eritrocitos mediante la adición de amonio-cloruro-potasio (ACK) de tampón de lisis (1,5 ml por animal donante) durante 5 min a temperatura ambiente. Añadir 8,5 ml de 1% de FCS / PBS-tampón (por animal donante).
  4. Centrifugar las células a 400 xg durante 5 min y separar el sobrenadante. Se lavan las células en 10 ml de FCS al 1% / PBS-tampón, centrifugar a 400 xg durante 5 min y separar el sobrenadante.
  5. Para la separación celular magnética, resuspender las células en 1% de FCS / PBS-tampón y añadir CD4 + microperlas. Consulte las instrucciones del fabricante para el volumen de compensación y la cantidad de células CD4 + microperlas de usar.
  6. Incubar durante 20 min a 4 ° C. A continuación, añadir 1% de FCS / PBS-tampón hasta 50 ml, centrifugar las células a 400 xg durante 5 min, y eliminar el sobrenadante.
  7. Continuar con el aislamiento de células T CD4 + utilizando columnas de separación magnética comerciales y un soporte magnético correspondiente de acuerdo con el protocolo del fabricante. Ajustar las células T CD4 + eluidas a un concentration de 10 6 células / ml en medio de Eagle modificado de Dulbecco con 1% de ácidos 10% de FCS, inactivado por calor 2,5% de penicilina / estreptomicina, tampón HEPES 1%, MEM aminoácidos, piruvato de sodio 1%, y 0,2% de 2-mercaptoetanol y tienda ellos a 4 ° C.
  8. Recoger la descarga de columna en un tubo de 50 ml tapón de rosca para preparar células presentadoras de antígeno (APCs). Centrifugar la descarga de la columna a 400 xg durante 5 min y separar el sobrenadante.
  9. Añadir 10 g / ml anti-CD4 (clon: GK1.5), 10 g / ml anti-CD8 (clon: 5367,2) y 10 g de ratón / ml anti-rata-mAb (MAR18.5) y 1,5 ml de complemento de conejo. Incubar durante 45 min a 37 ° C.
  10. Centrifugar las células a 400 xg durante 5 min, eliminar el sobrenadante y añadir 3 ml de medio. Irradiar las APC en una fuente de rayos γ o rayos x con 30 Gy en total. Después, ajustar las APC a una concentración de 5 x 10 6 células / ml.
  11. Añadir 100 células l de T CD4 + y 100 l de APCs en un pla de 96 pocilloste junto con 10 g / mL cOVA 323-339-péptido, 10 g / ml anti-IL-4-mAb, 0,3 mu M CPG1668-oligonucleótidos y 5 U / ml de IL-2.
  12. Añadir 50 U / ml de IL-2 cada segundo día. Después de 3 - 4 días, la transferencia de las células de las placas de 96 pocillos a placas de 24 pocillos. Combinar 3-5 pozos de la placa de 96 pocillos en un pocillo en la placa de 24 pocillos. Añadir 100 U / ml de IL-2 que contenía medio en una proporción de 1: 1.
  13. Después de otros 23 días, la transferencia de las células de la placa de 48 pocillos a 175 cm 2 frascos de cultivo de células (placa 1 x 48 pocillos por matraz). Rellenar con en un 1 medio: 1. Añadir 50 U / ml de IL-2 cada segundo día.
  14. Dividir las células de acuerdo con la densidad celular y añadir 50 U / ml de IL-2 cada segundo día. De esta manera, cultivar las células durante otros 10 días.

El radiomarcaje de la célula 4. cova-TH1

NOTA: El 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb se aplicará a las células cova-TH1 cultivadas para permitir el etiquetado radiactivo intracelular.

  1. Para cova-TH1 ceradiomarcaje ll, dibujar 37 MBq de la radiomarcado 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb en una jeringa sin volumen muerto usando un calibrador de dosis. Añadir 1 ml de solución salina para recibir una solución al 37 MBq / ml.
  2. Suspender las células cova-Th1 en medio a 2 x 10 6 células / ml y añadir 0,5 ml de la suspensión celular a cada pocillo en una placa de 48 pocillos.
  3. Añadir 20 l de la recién preparadas 37 MBq / ml 64 solución de Cu-DOTA-KJ1-26-mAb a cada pocillo de la placa de 48 pocillos. La relación final para el etiquetado es de 0,7 MBq por 10 6 células en un volumen de 520! L. Incubar a 37 ° C y 7,5% de CO2 durante 30 min.
  4. Después de la incubación, resuspender cuidadosamente las células en cada pocillo y transferir la suspensión de células de la placa de 48 pocillos en un 50 ml de tornillo tubo con tapón. Para minimizar la pérdida de células, enjuague cada pocillo con medio precalentado.
  5. Centrifugar la suspensión celular cova-TH1 a 400 xg durante 5 min, descartar el sobrenadante, y resuspender las células en 10 ml de PBS precalentado. Eliminar una unaliquot de la suspensión celular para el recuento celular. Repetir el paso de lavado.
  6. Recuento de células cova-TH1 viables en una dilución apropiada con tinción con azul de tripano.
  7. Ajustar la concentración de células a 5 x 10 7 células / ml para la inyección intraperitoneal (ip) de 10 7 células en 200 l de PBS.
  8. Repetir los pasos 4.3 a 4.5 para radiomarcar las células cova-TH1 con cantidades crecientes de la actividad, por ejemplo, 1,4 MBq o 2.1 MBq por 10 6 células.
    1. Para radiomarcar las células con 1,4 MBq por 10 6 células, usar 40! L de los 37 MBq / ml 64 solución de Cu-DOTA-KJ1-26-mAb y 60 l para radiomarcar con 2,1 MBq por 10 6 células. Realice los pasos 4.3 a 4.7 con 0,7 MBq, 1,4 MBq y 2,1 MBq 64 Cu-PTSM pero aumentar el tiempo de etiquetado a 3 h para investigaciones comparativas 17.
    2. Continúe en el paso 5 para determinar la cantidad óptima de actividad.

5. Evaluación in vitro del efecto del radiomarcador en células cova-TH1

NOTA: La caracterización de las influencias del radiomarcador en las células TH1 se realiza mediante el ensayo de exclusión de azul de tripano para determinar la viabilidad, IFN-gamma ELISA para la evaluación de la funcionalidad y V tinción PE-Anexina para la inducción de la apoptosis 16, 17. Determinación de la absorción intracelular y el flujo de salida de radioactividad también se describe a continuación. Como comparación, las células marcado con Cu-PTSM 64 cova-TH1 también se pueden utilizar.

  1. Efecto sobre la viabilidad mediante exclusión con azul de tripano
    1. Ajustar por lo menos 18 x 10 6 células cova-TH1 radiomarcados con 0,7 MBq / 10 6 células, 1,4 MBq / 10 6 células y 2,1 MBq / 10 6 células, respectivamente, a una concentración de 2 x 10 6 células / ml y realizar los pasos 5.1. 2-5.1.7 para cada dosis actividad. El uso no radiactivamenteve KJ1-26-mAb marcado células cova-TH1 y células cova-TH1 no marcados como los controles.
    2. Pipetear 1 ml de la solución de células en 9 pocillos de una placa de 24 pocillos.
    3. Recoger el contenido de 3 pocillos en 3 separadas 15 ml de tornillo tubos con tapa, 3 h después de radiomarcaje inicial.
    4. Lavar los pocillos ahora vacías con medio de pre-calentado para reducir al mínimo la pérdida de células y añadir el medio a los respectivos 15 ml tornillo tubos con tapón de la etapa 5.1.3.
    5. Centrifugar los tubos de 15 ml a 400 xg durante 5 min y resuspender el sedimento celular resultante en 1 ml de medio de pre-calentado.
    6. Recuento de células viables y muertas en azul de tripano por separado para cada tubo de 15 ml y calcular el porcentaje de células viables.
    7. Repetir los pasos 5.1.3-5.1.6 24 y 48 h post 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb radiomarcaje.
  2. Efectos sobre la funcionalidad determinaron por ELISA IFN-gamma
    NOTA: Para evaluar el efecto de la 64 Cu-DOTA-KJ1 26-mAb radiomarcador en productio IFN-γn como un marcador de la funcionalidad, lleve a cabo un ELISA de IFN-γ de un proveedor comercial y se refieren a la referencia 17 para más detalles.
    1. Dispersar 10 5 células viables en 100 l de medio en una placa de 96 pocillos, 3 h después de 64 Cu-DOTA-KJ1-26 radiomarcaje de las células cova-TH1 con 0,7 MBq, 1,4 MBq o 2,1 MBq. Utilice no radiactivos o 64 células no marcadas, etiquetadas-KJ1-26-mAb-etiquetados-PTSM Cu cova-TH1 como los controles.
    2. Estimular la producción de IFN-γ en 10 5 etiquetados-Cu-DOTA-KJ1-26-mAb 64 células cova-Th1 en 100 l de medio con 10 g / ml de péptido COVA, 5 U / ml de IL-2 y 5x10 5 APCs en 100 l de medio durante 24 h a 37 ° C y 7,5% de CO2. Otros controles pueden ser las otras condiciones sin la adición del péptido COVA.
    3. Analizar el sobrenadante por ELISA de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    4. Repita el paso 5.2.2. a 5.2.3. a las 24 y 48 h después del procedimiento de etiquetado.
  3. La inducción de la apoptosis determinada por V tinción PE-Anexina para citometría de flujo
    NOTA: Para evaluar la inducción de apoptosis por el radiomarcador 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb, utilizar un kit comercialmente disponible para citometría de flujo y se preparan muestras de células de acuerdo con las instrucciones del fabricante antes de la tinción con anexina V para fosfatidil serina exposición en la membrana celular .
    1. A las 3, 24 y 48 h post 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb radiomarcado de las células cova-TH1, triplicados mancha con al menos 10 6 etiquetados-Cu-DOTA-KJ1-26-mAb 64 células cova-TH1 con el kit de Anexina V de acuerdo con las instrucciones del fabricante y analizar dentro de la hora siguiente. Usa, 64 células cova-TH1 no radiactivos marcados con KJ1-26-mAb-PTSM marcadas con Cu y no marcados como controles. Por favor refiérase a la referencia 17 para más detalles.
  4. Captación y el flujo de salida
    NOTA: La absorción de la 64 Cu-DOTAKJ1-26-mAb en las células se mide en un calibrador de dosis y el flujo de salida de la radiactividad se mide en un ensayo de γ-conteo de 0, 5, 24, y 48 h después de radiomarcaje.
    1. Preparar diez tubos γ-contando cada durante 64 células cova-TH1-etiquetados Cu DOTA KJ1-26 mAb-, el sobrenadante respectivo y el paso de lavado.
    2. Transferencia 10 6 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb marcado con células cova-TH1 en 1 ml de medio en cada uno de los diez tubos γ-conteo directamente después de marcar radiactivamente. Para cada uno de los puntos 5, 24 y 48 h después de radiomarcaje de tiempo, mantener al menos 10 etiquetados-Cu-DOTA-KJ1-26-mAb 7 64 células cova-Th1 en medio en placas de cultivo celular de 24 pocillos en un incubador a 37 ° C y 7,5% de CO2.
    3. Centrifugar los tubos de γ-conteo a 400 xg durante 5 min y transferir el sobrenadante a diez nuevos tubos de γ-recuento.
    4. Lavar las células una vez en 1 ml de medio para eliminar la fracción no unida de 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb unad recoger el sobrenadante en diez nuevos tubos γ-recuento.
    5. Añadir 1 ml nuevo medio a las células cova-TH1 y determinar el valor de captación inicial en un calibrador de dosis. Los tubos también se pueden almacenar en una incubadora a 37 ° C y 7,5% de CO2.
    6. Repetir los pasos 5.4.2 a 5.4.5 después de 5, 24 y 48 h y medir todos los tubos en un γ-contador según el protocolo del fabricante. Para corregir por la desintegración radiactiva y para el análisis cuantitativo, utilizar un estándar con una dosis definida de la radiactividad.

Inducida por OVA 6. aguda de las vías respiratorias DTHR

NOTA: La dinámica de migración y patrones de homing de células radiomarcado cova-TH1 adoptivamente transferidas y en el sitio de la inflamación se visualizó y se cuantificó en un modelo animal para inducida por COVA vía aérea-DTHR 16, 17.

  1. Inyectar ratones de 8 semanas de edad BALB / c ip con una mezcla de 150 l aluminum gel / 50 l cova-solución (10 g en 50 l de PBS) para inmunizar los ratones.
  2. Dos semanas después de la inmunización, anestesiar a los ratones con 100 mg / kg de ketamina y 5 mg / kg de xilazina por inyección ip. Coloque los ratones experimentales sobre sus espaldas y lentamente pipetear 100 g COVA disuelto en 50 l de PBS en las fosas nasales de los animales. Los animales serán inhalar la solución gota a gota.
  3. Repita después de 24 h. Para las inducciones DTHR de las vías respiratorias más fuertes, repetir de nuevo después de 48 h.
  4. Para analizar la migración específica de las células cova-TH1 transferidos, inducir la vía aérea-DTHR con el pavo-o faisán-OVA como control. Por lo tanto, repita los pasos 6.1 a 6.3 mediante el uso de la respectiva OVA-proteína.

7. El uso de imágenes in vivo de PET / CT

NOTA: En imágenes in vivo de 64-etiquetados Cu DOTA KJ1-26-mAb-células cova-Th1 en cova-DTHR ratones enfermos y compañeros de camada de control demuestra la homing específico y el midinámica gración de las células cova-TH1. Por lo tanto, adquirir exploraciones PET estáticas y anatómica CT escanea secuencialmente 3, 24 y 48 h de la transferencia celular adoptiva poste.

  1. Directamente después de radiomarcaje, ajustar las 64 células cova-TH1-etiquetados Cu DOTA KJ1-26 mAb a 5 x 10 7 células / ml para inyección ip de 10 7 células en 200 l.
  2. Usando una jeringa de 1 ml y una aguja de calibre 30, dibujar 200 l de la suspensión celular cova-TH1 marcado con Cu-DOTA-KJ1-26-mAb 64 y se inyectan las células IP en los animales cova-DTHR-enfermas entre el 4 y 5 de pezón. Para determinar la cantidad total inyectada de la radiactividad, medir la jeringa en un calibrador de dosis antes y después de la inyección.
  3. Anestesiar los ratones, 10 min antes del tiempo de absorción se desea, con 1,5% de isoflurano en oxígeno al 100% (velocidad de flujo: 0,7 L / min) en una caja de la anestesia con temperatura controlada.
  4. Mientras tanto, para facilitar la co-registrode imágenes PET y CT durante el análisis de imágenes, fijar los capilares de vidrio que contenían 64 solución de Cu-DOTA-KJ1-26-mAb o solución libre 64 CuCl 2 debajo de la cama del ratón.
    1. Por lo tanto, preparar una solución de 0,37 MBq / ml y llenar capilares de vidrio con un volumen de 10 l con esta solución. Dado que las señales de radiactividad derivados de células son inherentemente débil, no utilice altas cantidades de actividad para asegurarse de que los marcadores no están interfiriendo con las señales derivadas de las células en ratones.
  5. Después de alcanzar la tolerancia quirúrgica, como se indica por la pérdida del reflejo de retirada pedal de la extremidad posterior, transferir el ratón para un pequeño animal cama compatible-CT PET-y equipado con un sistema de tubos adecuado para mantener la anestesia.
  6. Inmovilizar el ratón en la pequeña cama animal usando hisopos de algodón y cinta quirúrgica. Aplicar ungüento para los ojos para evitar la desecación de los ojos.
  7. La transferencia de la cama de ratón para el escáner PET, centrar el campo de visión con una focus en los pulmones y adquirir una exploración PET estática 20 minutos con una ventana de energía de 350-650 keV.
  8. La transferencia de la cama de ratón para el escáner CT. A través del explorador de vista, centrar el campo de visión de los pulmones. Adquirir una imagen planar CT a través de 360 ​​proyecciones durante una rotación de 360 ​​° en el modo de "paso y disparar" con un tiempo de exposición de 350 ms y binning factor de 4.

Análisis 8. Imagen

  1. Reconstruir PET de datos en modo de lista mediante la aplicación iterativa algoritmo estadístico ordenado a la maximización de la expectativa subconjunto (OSEM) 2D y tomografías computarizadas en una imagen 3D con un tamaño de píxel de 75 micras.
  2. Para la imagen co-registro en un software de análisis de imágenes apropiado (por ejemplo Inveon Investigación lugar de trabajo o Pmod), utilice la herramienta automática co-registro. Si esto no funciona, utilice los capilares de vidrio debajo de la cama ratón como guía para co-registrar las imágenes PET y CT reconstruidas espacialmente en la dirección axial, coronal y sagital.
  3. Corregir las imágenes PETpara la desintegración radiactiva usando la ley de la desintegración radiactiva y el tiempo medio del radionúclido 64 Cu a 12,7 h. Para la imagen de normalización, elegir una imagen (A) como una referencia y ajustar la intensidad de la visualización de imágenes en el software de análisis de imagen correspondiente.
    1. Utilizando los valores acaba de establecer la imagen de referencia (A) para, la actividad inyectada (A) y la actividad inyectada para las otras imágenes (X), normalizar las otras imágenes utilizando la siguiente ecuación: (actividad inyectada (X) / actividad inyectada ( A)) Los valores de x de intensidad (A).
  4. Dibujar volúmenes 3D de interés (VOI) en la señal de PET normalizada de la LNS pulmonares y peritímica.
  5. Determinar la dosis inyectada porcentaje por cm 3 (% ID / cm 3) usando la siguiente ecuación: (media de la actividad de la actividad VOI / total en el ratón) x 100. Para mayor orientación relativa a análisis de imágenes, ver referencias 22, 23.

Resultados

La Figura 1 resume el etiquetado de las células cova-TH1 con el 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb y el diseño experimental para la in vitro y en estudios in vivo cubiertos en este protocolo.

figure-results-354
Figura 1: 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb proceso de etiquetado y Diseño Experimental. (A)

Discusión

Este protocolo presenta un método fiable y fácil de marcar radiactivamente de forma estable células para el seguimiento in vivo mediante PET. Utilizando este método, las células cova-TH1, aislado y ampliado in vitro de ratones donantes, podría ser radiomarcados con 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb y su homing fue rastreado a la LNS pulmonares y peritímica como lugares de presentación COVA en una COVA inducida DTHR vías respiratorias aguda.

La modificación del mAb ...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores agradecen a la doctora Julia Mannheim, Walter Ehrlichmann, Ramona Stumm, Funda Cay, Daniel Bukala, Maren Harant, así como Natalie Altmeyer por el apoyo durante los experimentos y análisis de datos. Este trabajo fue apoyado por el Werner Siemens-Fundación, la DFG a través de la SFB685 (B6 proyecto) y la fortuna (2309-0-0).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
HCl, SuprapurMerck, Darmstadt, Germany1.0031864Cu production
Methanol, SuprapurMerck, Darmstadt, Germany1.0600764Cu production
Isopropanol, SuprapurMerck, Darmstadt, Germany1.010464Cu production
Pt/Ir (90/10) plateÖgussaCustom made64Cu production
PEEK chamberWKLCustom made64Cu production
64NiChemotrade64Cu production
Polygram SIL G/UV 254 plateMacherey-Nagel80502164Cu production
Ion exchange columnBioRadAG1-X864Cu production
Solid state target system for PETtraceWKLcostum made64Cu production
64Cu work-up moduleWKLcostum made64Cu production
Dose calibratorCapintecCRC-25R
PETtrace cyclotronGeneral Electric Medical Systems
DOTA-NHSMacrocyclicsB-280DOTA-conjugation
Anti-cOVA-TCR antibody (KJ1-26)Isolated from hybridoma cell cultureDOTA-conjugation
Na2HPO4Sigma-Aldrich71633DOTA-conjugation
H+ Chelex 100Sigma-AldrichC7901DOTA-conjugation
Amicon Ultra-15 filter unitMerck MilliporeUFC910008DOTA-conjugation
Rotipuran ultrapure waterCarl RothHN68.3DOTA-conjugation
Ammonium acetateSigma-Aldrich32301DOTA-conjugation
PBSUniversity TuebingenDOTA-conjugation
Micro Bio-spin P-6 columnBio-Rad Laboratories7326221DOTA-conjugation
Sodium citrateSigma-Aldrich71497DOTA-conjugation
Cyclone Plus PhosphorImager Perkin-ElmerL2250116DOTA-conjugation
DMEMMerck Millipore102568ingredient for T cell medium 
FCSMerck MilliporeS0115/1004Bingredient for T cell medium 
Sodium pyruvateMerck MilliporeL0473ingredient for T cell medium 
MEM-amino acidsMerck MilliporeK0293ingredient for T cell medium 
HEPES Merck MilliporeL 1613ingredient for T cell medium 
 Penicillin/StreptomycinMerck MilliporeA2212ingredient for T cell medium 
0.05 mM 2-β-mercaptoethanolSigma-AldrichM3148ingredient for T cell medium 
DO11.10 micein-house breedingTH1 cell culture
DPBSGibco14190144TH1 cell culture
Cell strainer 40 µm Corning352340TH1 cell culture
ACK Lysing BufferLonza10-548ETH1 cell culture
CD4 MicroBeads, mouseMiltenyi Biotech130-097-145TH1 cell culture
QuadroMACS separatorMiltenyi Biotech130-090-976TH1 cell culture
LS columnMiltenyi Biotech130-042-401TH1 cell culture
anti-CD4 antibody (Gk1.5)Isolated from hybridoma cell cultureTH1 cell culture
anti-CD8 antibody (5367.2)Isolated from hybridoma cell cultureTH1 cell culture
Anti-rat antibody (MAR18.5)Isolated from hybridoma cell cultureTH1 cell culture
Rabbit complement MAtebu-BioCL3221TH1 cell culture
Anti-IL-4 antibody (11B11)Isolated from hybridoma cell cultureTH1 cell culture
cOVA 323-339-peptide EMC-micro-collectionsCustom orderTH1 cell culture
CPG1668-oligonucleotidesEurofins MWG OperonCustom orderTH1 cell culture
IL-2Novartis65483-116-07TH1 cell culture
96-well platesGreiner 655180TH1 cell culture
24-well platesGreiner 662160TH1 cell culture
cell culture flaskGreiner 660175TH1 cell culture
48-well platesGreiner 677 180cell labeling
Gammacell 1000Best Theratronicsvia inquiry 
Gulmay RT225Gulmayvia inquiry 
Trypan blueMerck MilliporeL6323in vitro evaluation
Mouse IFN-γ ELISABD Biosciences558258in vitro evaluation
PE Annexin V Apoptosis Detection Kit BD Biosciences559763in vitro evaluation
Tube 5 mLSarstedt55.476in vitro evaluation
Round-bottom tubes BD Biosciences352008in vitro evaluation
Wizard γ-counterPerkin-Elmer2480-0010in vitro evaluation
ELISA Reader MultiscanEXThermo Fisher Scientific51118177in vitro evaluation
MicroscopeLeicavia inquiry in vitro evaluation
BD LSRII BD Biosciencesvia inquiry in vitroevaluation
BALB/c miceCharles River028in vivo cell trafficking
Aluminum gelServa Electrophoresis12261.01in vivo cell trafficking
XylazineBayer HealthCareOrdered via University hospitalin vivo cell trafficking
KetamineRatiopharmOrdered via University hospitalin vivo cell trafficking
IsofluraneCP-PharmaOrdered via University hospitalin vivo cell trafficking
30 G needleBD Biosciences304000in vivo cell trafficking
SyringeBD Biosciences11612491in vivo cell trafficking
Capillaries 10 µLVWR612-2439
Inveon PET scannerSiemens Healthineersno longer availablein vivo cell trafficking, alternative companies: Bruker, Mediso 
Inveon SPECT/CT scannerSiemens Healthineersno longer availablein vivo cell trafficking
Inveon Research WorkplaceSiemens Healthineersimage analysis, alternative software: Pmod

Referencias

  1. Cerri, S., et al. Intracarotid Infusion of Mesenchymal Stem Cells in an Animal Model of Parkinson's Disease, Focusing on Cell Distribution and Neuroprotective and Behavioral Effects. Stem Cells Trans Med. 4 (9), 1073-1085 (2015).
  2. Hasenbach, K., et al. Monitoring the glioma tropism of bone marrow-derived progenitor cells by 2-photon laser scanning microscopy and positron emission tomography. Neuro Oncol. 14 (4), 471-481 (2012).
  3. Sood, V., et al. Biodistribution of 18F-FDG-Labeled Autologous Bone Marrow – Derived Stem Cells in Patients With Type 2 Diabetes Mellitus. Clin Nucl Med. 40 (9), 697-700 (2015).
  4. Perez-Diez, A., et al. CD4 cells can be more efficient at tumor rejection than CD8 cells. Blood. 109 (12), 5346-5354 (2007).
  5. Muranski, P., Restifo, N. P. Adoptive immunotherapy of cancer using CD4+ T cells. Curr. Opin. Immunol. 21 (2), 200-208 (2009).
  6. Braumuller, H., et al. T-helper-1-cell cytokines drive cancer into senescence. Nature. 494 (7437), 361-365 (2013).
  7. Kochenderfer, J. N., et al. Eradication of B-lineage cells and regression of lymphoma in a patient treated with autologous T cells genetically engineered to recognize CD19. Blood. 116 (20), 4099-4102 (2010).
  8. Cherry, S. R. Fundamentals of Positron Emission Tomography and Applications in Preclinical Drug Development. J. Clin. Pharmacol. 41 (5), 482-491 (2001).
  9. Tavaré, R., et al. An Effective Immuno-PET Imaging Method to Monitor CD8-Dependent Responses to Immunotherapy. Cancer Res. 76 (1), 73-82 (2016).
  10. Tavaré, R., et al. Engineered antibody fragments for immuno-PET imaging of endogenous CD8+ T cells in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (3), 1108-1113 (2014).
  11. Dobrenkov, K., et al. Monitoring the Efficacy of Adoptively Transferred Prostate Cancer-Targeted Human T Lymphocytes with PET and Bioluminescence Imaging. J Nucl Med. 49 (7), 1162-1170 (2008).
  12. Rini, J. N., et al. PET with FDG-labeled Leukocytes versus Scintigraphy with 111In-Oxine-labeled Leukocytes for Detection of Infection. Radiology. 238 (3), 978-987 (2006).
  13. Ritchie, D., et al. In vivo tracking of macrophage activated killer cells to sites of metastatic ovarian carcinoma. Cancer Immunol. Immunother. 56 (2), 155-163 (2006).
  14. Adonai, N., et al. Ex vivo cell labeling with 64Cu-pyruvaldehyde-bis(N4-methylthiosemicarbazone) for imaging cell trafficking in mice with positron-emission tomography. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (5), 3030-3035 (2002).
  15. Huang, J., Lee, C. C. I., Sutcliffe, J. L., Cherry, S. R., Tarantal, A. F. Radiolabeling Rhesus Monkey CD34+ Hematopoietic and Mesenchymal Stem Cells with 64Cu-Pyruvaldehyde-Bis(N4-Methylthiosemicarbazone) for MicroPET Imaging. Mol. Imaging. 7 (1), (2008).
  16. Griessinger, C. M., et al. In Vivo Tracking of Th1 Cells by PET Reveals Quantitative and Temporal Distribution and Specific Homing in Lymphatic Tissue. J Nucl Med. 55 (2), 301-307 (2014).
  17. Griessinger, C. M., et al. 64Cu antibody-targeting of the T-cell receptor and subsequent internalization enables in vivo tracking of lymphocytes by PET. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (4), 1161-1166 (2015).
  18. McCarthy, D. W., et al. Efficient production of high specific activity 64Cu using a biomedical cyclotron. Nucl. Med. Biol. 24 (1), 35-43 (1997).
  19. Kalkhof, S., Sinz, A. Chances and pitfalls of chemical cross-linking with amine-reactive N-hydroxysuccinimide esters. Anal. Bioanal. Chem. 392 (1), 305-312 (2008).
  20. Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin Iii, ., J, Isolation and Th17 Differentiation of Naive CD4 T Lymphocytes. J Vis Exp. (79), e50765 (2013).
  21. Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse Naive CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets. J Vis Exp. (98), e52739 (2015).
  22. Judenhofer, M., Wiehr, S., Kukuk, D., Fischer, K., Pichler, B. Chapter 363. Small Animal Imaging. Basics and Practical Guide. , 363-370 (2011).
  23. Phelps, M. E. . PET. Molecular Imaging and Its Biological Applications. , 93-101 (2004).
  24. Wu, A. M. Antibodies and Antimatter: The Resurgence of Immuno-PET. JNM. 50 (1), 2-5 (2009).
  25. Lewis, M. R., et al. In vivo evaluation of pretargeted 64Cu for tumor imaging and therapy. J Nucl Med. 44 (8), 1284-1292 (2003).
  26. Boswell, C. A., et al. Comparative in vivo stability of copper-64-labeled cross-bridged and conventional tetraazamacrocyclic complexes. J Med Chem. 47 (6), 1465-1474 (2004).
  27. Ghosh, S. C., et al. Comparison of DOTA and NODAGA as chelators for (64)Cu-labeled immunoconjugates. Nucl Med Biol. 42 (2), 177-183 (2015).
  28. Johnson, T. E., Birky, B. K. . Health Physics and Radiological Health. , (2011).
  29. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Meth. 2 (12), 932-940 (2005).

Reimpresiones y Permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este JoVE artículos

Solicitar permiso

Explorar más artículos

Inmunolog aNo 122de formaci n de im genes de animales Peque omarcaje celularno invasiva In vivo Seguimiento de la c lulael PET CTlas c lulas T TH1reacci n de hipersensibilidad de las v as respiratorias de tipo retardado

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Contáctenos

RECOMIENDE A LA BIBLIOTECA

BOLETINES de JoVE

Investigación

Educación

Autores

Bibliotecarios

ACERCA DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados