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Resumo

Seguindo a preparação de um anticorpo monoclonal 64 Cu-modificados se ligar a um receptor de células T de murino transgico, as células T são radiomarcados in vivo, analisadas para a viabilidade, funcionalidade, estabilidade rotulagem e apoptose, e transferidas adoptivamente para ratinhos com uma via aérea hipersensibilidade de tipo retardado reacção para imagem não invasivo por tomografia de emissão de positrões / tomografia computadorizada (PET / CT).

Resumo

Este protocolo ilustra a produção de 64 Cu e o quelante de conjugao / radiomarcação de um anticorpo monoclonal (mAb), seguido por cultura de células de linfócitos de murídeo e o receptor 64 de Cu-anticorpo segmentação das células. Avaliação in vitro do marcador radioactivo e não-invasivo de rastreamento de células in vivo num modelo animal de uma via respiratória de tipo retardado de reacção de hipersensibilidade (DTHR) por PET / CT são descritos.

Em detalhe, a conjugação de um mAb com o quelante de ácido 1,4,7,10-tetra-azaciclododecano-1,4,7,10-tetra-acético (DOTA) é mostrado. Após a produção de 64 Cu radioactivos, marcação radioactiva do mAb DOTA-conjugado é descrito. Em seguida, a expansão de ovalbumina de galinha (Cova) CD4 + espec�ico interferão (IFN) -γ produtoras de células T auxiliares (Cova-TH1) e a radiomarcação subsequente das células Cova-TH1 estão representados. Várias técnicas in vitro são apresentados para avaliar a effects de 64 Cu-radiomarcao sobre as células, tais como a determinação da viabilidade das células por exclusão do azul de tripano, a coloração para a apoptose com anexina V por citometria de fluxo, e a avaliação da funcionalidade por ensaio imunossorvente ligado a enzima de IFN-γ (ELISA) . Além disso, a determinação da incorporação radioactiva nas células e a estabilidade de marcação são descritos em detalhe. Este protocolo descreve ainda como realizar os estudos de seguimento de células em um modelo animal para uma DTHR das vias respiratórias e, por conseguinte, a indução de-induzida das vias respiratórias Cova DHTR aguda em ratinhos BALB / c está incluído. Finalmente, um fluxo de trabalho / CT robusta PET incluindo aquisição de imagem, reconstrução e análise é apresentada.

A abordagem de direccionamento do receptor 64 de Cu-anticorpo com a internalização do receptor subsequente proporciona uma elevada especificidade e estabilidade, reduzida toxicidade celular, e as taxas de efluxo baixos em comparação com PET-traçadores comuns para marcação celular, por exemplo, 64 Cu-pyruvaldehyde bis (N-4-metiltio-semicarbazona) (64 Cu-PTSM). Finalmente, a nossa abordagem permite não invasiva no rastreamento de células in vivo por PET / CT com uma óptima relação sinal-para-fundo durante 48 h. Esta abordagem experimental pode ser transferido para modelos animais e tipos de células diferentes com receptores ligados a membranas que são internalizados.

Introdução

Rastreamento de células não-invasiva é um instrumento versátil para monitorizar a função celular, migração e homing in vivo. Estudos recentes de rastreamento de células têm-se centrado no mesenquimais 1, 2 ou da medula óssea derivadas de células estaminais 3 no contexto da medicina regenerativa, as células brancas do sangue perifico autogos em inflamação ou linfócitos T em terapias de células adoptivas contra cancro de 3, 4. A elucidação dos locais de acção e os princípios subjacentes biológicos de terapias à base de células é de grande importância. Linfócitos T citotóxicos CD8 +, por engenharia genética do receptor de antigénio quimérico (CAR) células T ou linfócitos que se infiltram no tumor (TIL) foram amplamente considerada como o padrão de ouro. No entanto, as células TH1 específicas para o antigénio associado a tumores provaram ser uma alternativa eficaz opção de tratamento 4, </ sup> 5, 6, 7.

Como actores-chave na inflamação, as doenças auto-imunes específicas de órgãos (por exemplo, artrite reumatóide ou asma brônquica), e células de elevado interesse em imunoterapia do cancro, é importante caracterizar a distribuição e homing padrões temporais de células TH1. Não invasiva in vivo de imagiologia por PET apresenta, um método altamente sensível quantitativa 8 para analisar os padrões de migração celular, no retorno in vivo, e os sítios de acção de células T e respostas durante a inflamao, alergias, infecções ou de rejeição de tumor 9, 10, 11.

Clinicamente, 111In-oxina é usado para cintigrafia de leucócitos para a discriminação de inflamação e infecção de 12, enquanto que 2-desoxi-2- (18F) fluoro-D-glucose (18F-FDG) é comumente utilizada para estudos de rastreio celular por PET 3, 13. Uma grande desvantagem deste marcador de PET, no entanto, é a meia-vida curta do radionuclídeo 18 M em 109,7 min e a baixa estabilidade intracelular que impede a imagiologia em pontos de tempo mais tardios após a transferência adoptiva de células. Para longo prazo, os estudos in vivo de rastreio celular por PET, embora instável nas células, 64 Cu-PTSM é frequentemente usado para marcar as células não especificamente 14, 15, com efeitos prejudiciais minimizadas sobre a viabilidade das células T e a função de 16.

Este protocolo descreve um método para reduzir ainda mais os efeitos desvantajosos sobre a viabilidade e função das células utilizando um receptor de células T (TCR) de mAb marcado radioactivamente espec�ico. Em primeiro lugar, a produção do radioisótopo 64 Cu, a conjugação do mAb KJ1-26 com the quelante DOTA, e o subsequente 64 de Cu-radiomarcação são mostrados. Num segundo passo, o isolamento e a expansão de células TH1 Cova-de ratinhos dadores DO11.10 e a radiomarcação com 64Cu-carregado DOTA-conjugado mAb KJ1-26 (64 Cu-DOTA-KJ1-26) são descritos em detalhe. A avaliação dos valores de absorção e de efluxo de radioactividade com um calibrador de doses e pela y-contagem, respectivamente, bem como a avaliação dos efeitos de 64 Cu-radiomarcao sobre a viabilidade celular por exclusão com azul de tripano e funcionalidade com ELISA y IFN-são apresentados . Para não invasiva no rastreamento de células in vivo, o desencadeamento de um modelo de ratinho de-induzida aguda das vias aéreas Cova DTHR e aquisição de imagem por PET / CT após transferência adoptiva de células encontram-se descritos.

Além disso, esta abordagem de marcao podem ser transferidos para diferentes modelos de doença, as células T de murídeo com diferentes TCRs ou células gerais de interesse com receptores ligados a membranas ou mar expressãokers subjacente membrana contínua de vaivém 17.

Protocolo

Medidas de Segurança: Ao manusear radioactividade, armazenar 64 Cu atrás tijolos de chumbo 2 polegadas de espessura e utilizar respectivo blindagem para todos os vasos que transportam actividade. Use ferramentas apropriadas para tratar indiretamente fontes não blindados para evitar contato manual direto e minimizar a exposição a material radioativo. Sempre use radiação emblemas monitoramento dosimetria e equipamentos de proteção individual e verificar-se ea área de trabalho para a contaminação de enfrentá-lo imediatamente. Descartar equipamento de protecção individual potencialmente contaminado antes de deixar a área onde o material radioativo é usado. Armazenar toda a resíduos radioactivos atrás protecção de chumbo até que a radioactivos 64 Cu é deteriorado (aproximadamente 10 meias-vidas = 127 h) antes do descarte adequado.

1. 64 Cu Produção

NOTA: O radioisótopo 64 Cu é produzido através da 64 Ni (p, n) 64 reacção nuclear Cu utilizando um Pettciclotrão corrida de acordo com um protocolo modificado de McCarthy et al. 18.

  1. Para a produção de 64 Cu, Ni irradiar 64, que é galvanizado em um prato de platina / irídio (90/10), com 30 mA, durante 6 h com um feixe de protões de 12,4 MeV.
  2. Aqueça o alvo de platina / irídio a 100 ° C numa câmara de polieteretercetona dedicado (PEEK) e incubar em 2 mL de HCl concentrado durante 20 min para dissolver 64 Cu / Ni 64.
  3. Adicione outro 1 mL de HCl concentrado e incubar durante 10 min.
  4. Evapora-se HCI utilizando uma corrente de árgon e arrefece-se a câmara até à temperatura ambiente.
  5. Lavar a câmara com 3 mL de 4 M de HCl 0,2% e 96% de metanol (v / v) e transferir esta solução a uma coluna de permuta iónica que foi pré-condicionada com 4% de HCl 0,2 M em metanol durante pelo menos 15 min. O efluente pode ser usado para reciclar 64 Ni.
  6. Lava-se a 64 Cu retida na coluna com 4% de HCl 0,2 M in metanol.
  7. Eluir 64 Cu com 70% de HCl 1,3 M / 30% de isopropanol (v / v) para um frasco de recolha, evapora-se a solução numa corrente de árgon e deixar o frasco arrefecer para a temperatura ambiente.
  8. Dissolve-se 64 Cu em 140-210 mL de HCl 0,1 M.

2. Anticorpo Conjugação com DOTA e posterior 64 de Cu-radiomarcao

NOTA: O quelante DOTA vai ser ligada a grupos amino funcionais do mAb por N-hidroxissuccinimida (NHS) de éster química e o conjugado será subsequentemente marcado radioactivamente com 64 Cu 19.

  1. Ajustar a concentração do KJ1-26-mAb a 8 mg / ml e diafiltrado 1 mL de solução de mAb contra 0,1 M de Na 2 HPO 4, pH 7,5 tratados com 1,2 g / L de uma resina de permuta iónica quelante usando um peso molecular de corte ( MWCO 30 kDa) unidade do filtro centrífugo. Aplicar 3 passos de lavagem subsequentes com 14 ml do tampão. Após o passo de lavagem final,concentra-se a solução novamente para 1 mL. Quantificar a concentração de anticorpo por medições 280nm.
  2. Prepara-se uma solução de DOTA-NHS em ultrapura ou água-PCR grau a uma concentração de 10 mg / ml imediatamente antes da utilização. Deixe o frasco atingir a temperatura ambiente antes de abrir para evitar a condensação de água, e cuidadosamente remover DOTA-NHS utilizando uma espátula de plástico. Adicionar 216 ul desta solução DOTA-NHS a 8 mg da solução KJ1-26-mAb diafiltrada, homogeneiza-se, e incuba-se durante 24 h a 4 ° C num misturador de tambor.
  3. Diafiltrado o DOTA-KJ1-26-mAb contra acetato de amónio 0,25 M, pH 7,0, tratados com 1,2 g / L de uma resina de permuta iónica quelante, usando um peso molecular de corte (MWCO 30 kDa) unidade do filtro centrífugo. Aplicar 7 etapas de lavagem. Concentra-se o mAb a um volume final de 1 ml e novamente medir a concentração de proteína por meio de medições 280nm.
  4. Antes de radiomarcao, trocar o tampão da DOTA-KJ1-26-mAb para o PBS através de tamanho-exccromatografia Lusion usando colunas de filtração de gel. Isto também remove impurezas potenciais de pequenas moléculas.
  5. Preparar 100 MBq 64 CuCl 2 em solução de HCl a 10 mM e ajustar o pH para 6-7 com 10x de PBS. Adicionar 200 mg de DOTA-KJ1-26-mAb. Incubar durante 60 minutos a 37 ° C.
  6. Para o controlo de qualidade, realizar uma cromatografia de camada fina com citrato de sódio 0,1 M (pH 5) como fase móvel e analisar-se por autorradiografia. Pelo menos 90% da actividade deve ser ligada ao anticorpo e, portanto, ser detectado no ponto de partida. actividade não ligada é quelado pela fase e estrias móvel à base de citrato para a frente do solvente. Para obter uma referência, o uso de 64 CuCl 2 é aconselhada.

TH1 específico para ovalbumina de galinha 3. (Cova-TH1) o isolamento de células e de expansão

NOTA: A cultura de células TH1 é descrito de acordo com os estudos anteriormente publicados 16, 17.

  1. Isolar os baços e os nódulos linfáticos extraperitoneal (LNs) de ratinhos DO11.10.
    1. Sacrificar o mouse de acordo com os regulamentos federais. Desinfectar o animal com 70% de etanol e fixar-o com fita adesiva para a remoção do baço e LN. Faça uma incisão mediana e separar a pele do peritônio, puxando-o lateralmente para cada site.
    2. Localizar o colo do útero, axial, braquial e LNs inguinais. Removê-los com uma pinça sem corte e colocá-los em 1% de soro fetal de vitelo (FCS) / tampão PBS.
    3. Abrir o peritoneu e localizar o baço. Separa-se o baço do pâncreas e do tecido conjuntivo e colocá-lo em 1% de tampão de FCS / PBS. Para mais orientações, ver referências 20,21.
  2. Tritura baço e LNs através de um filtro de 40 um em 50 ml de parafuso tubo de tampa utilizando o êmbolo de uma seringa. Lavar o filtro com 10 mL de 1% de FCS / PBS-tampão.
  3. Centrifugar a 400 xg durante 5 min e remover o sobrenadante. Subsequently, realizar a lise dos eritrócitos adicionando-amónio cloreto e potássio (ACK) de tampão de lise (1,5 mL por animal dador) durante 5 min à temperatura ambiente. Adicionar 8,5 mL de 1% de FCS / PBS-tampão (por animal dador).
  4. Centrifugar as células a 400 xg durante 5 min e remover o sobrenadante. Lavam-se as células em 10 mL de 1% de FCS / PBS-tamp, centrifugar a 400 xg durante 5 min e remover o sobrenadante.
  5. Para a separação de células magnético, ressuspender as células em 1% de FCS / PBS-tampão e adicionar CD4 + microesferas. Referem-se as instruções do fabricante para o volume de tampão e a quantidade de células T CD4 + microesferas de usar.
  6. Incubar durante 20 min a 4 ° C. Em seguida, adicionar 1% de FCS / PBS-tampão até 50 mL, centrifugar as células a 400 xg durante 5 min, e remover o sobrenadante.
  7. Continuar com o isolamento de células T CD4 + utilizando colunas de separação magnética comerciais e um respectivo suporte de íman de acordo com o protocolo do fabricante. Ajustar as células T CD4 + a um co eluídosncentration de 10 6 culas / mL em Meio de Eagle Modificado de Dulbecco com 2,5% de penicilina / estreptomicina, 1% de tampão HEPES, ácidos FCS a 10%, inactivado pelo calor 1% MEM aminoácidos, 1% de piruvato de sódio, e 0,2% de 2-mercaptoetanol e loja -los a 4 ° C.
  8. Recolha a descarga da coluna em um tubo de 50 mL com tampa de rosca para preparar células apresentadoras de antígenos (APCs). Centrifugar a descarga da coluna a 400 xg durante 5 min e remover o sobrenadante.
  9. Adiciona-se 10 ug / ml de anti-CD4 (clone: ​​GK1.5), 10 ug / mL de anti-CD8 (clone: ​​5367,2) e 10 ug de rato / ml de anti-rato-mAb (MAR18.5) e 1,5 mL de complemento de coelho. Incubar durante 45 min a 37 ° C.
  10. Centrifugar as células a 400 xg durante 5 minutos, remover o sobrenadante e adicionar 3 mL de meio. Irradiar o APC em uma fonte de raios γ ou raios-x com 30 Gy no total. Em seguida, as APCs ajustar a uma concentração de 5 x 10 6 culas / mL.
  11. Adicionar 100 uL de células T CD4 + e 100 mL de APCs numa pla de 96 cavidadeste em conjunto com 10 ug / mL cOVA 323-339-peptídeo, 10 ug / ml de anti-IL-4, mAc de 0,3 uM CPG1668-oligonucleótidos e 5 U / ml de IL-2.
  12. Adicionar 50 U / mL de IL-2 a cada segundo dia. Depois de 3 - 4 dias, a transferência das células de placas de 96 pos para placas de 24 poços. Combinar 3-5 poços da placa de 96 poços em um poço na placa de 24 poços. Adicionam-se 100 U / ml de IL-2 que contém meio em uma proporção de 1: 1.
  13. Após mais 2-3 dias, transferir as células a partir da placa de 48 poços a 175 cm 2 frascos de cultura de células (1 x 48 poços de placas por frasco). Encha com o meio em uma proporção de 1: 1. Adicionar 50 U / mL de IL-2 a cada segundo dia.
  14. Dividir as células de acordo com a densidade celular e adicionar 50 U / mL de IL-2 a cada segundo dia. Desta forma, a cultura das células para mais 10 dias.

4. Cova-TH1 radiomarcação celular

NOTA: O 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb vai ser aplicada às células TH1 Cova-cultivadas para permitir a marcação radioactiva intracelular.

  1. Para Cova-TH1 cell radiomarcao, desenhar 37 MBq da radiomarcado 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb numa seringa sem volume morto usando um calibrador de doses. Adicionar 1 ml de solução salina para receber uma solução de 37 MBq / ml.
  2. Suspender as células Cova-TH1 em meio a 2 X 10 6 células / ml e adiciona-se 0,5 mL da suspensão celular a cada poço numa placa de 48 poços.
  3. Adiciona-se 20 uL dos preparados de fresco de 37 MBq / mL de 64 solução de Cu-DOTA-KJ1-26-mAb para cada uma das cavidades da placa de 48 poços. A razão final para a rotulagem é 0,7 MBq por 10 6 culas, num volume de 520 uL. Incubar a 37 ° C e 7,5% de CO 2 durante 30 min.
  4. Após a incubação, ressuspender cuidadosamente as células em cada poço e transferir a suspensão de células a partir da placa de 48 poços em 50 mL de um parafuso tubo de tampa. Para minimizar a perda de células, lave cada po com meio de pré-aquecido.
  5. Centrifugar a suspensão de células Cova-TH1 a 400 xg durante 5 minutos, descarta-se o sobrenadante e ressuspender as células em 10 mL de PBS pré-aquecido. Remover um umliquot da suspensão de células para contagem das células. Repetir o passo de lavagem.
  6. Contagem de células viáveis ​​Cova-TH1 em uma diluição apropriada com coloração com azul de tripano.
  7. Ajustar a concentração de células a 5 x 10 7 células / ml para injecção intraperitoneal (ip) de 10 7 culas em 200 de PBS.
  8. Repita os passos de 4,3-4,5 para marcar radioactivamente as culas Cova-TH1 com quantidades crescentes de actividade, por exemplo, 1,4 ou 2,1 MBq MBq por 10 6 culas.
    1. Para marcar radioactivamente as culas com 1,4 MBq por 10 6 culas, usar 40 ul dos 37 MBq / mL de 64 solução de Cu-DOTA-KJ1-26-mAb e 60 uL para radiomarcao com 2,1 MBq por 10 6 culas. Executar os passos 4,3-4,7 com 0,7 MBq, 1,4 MBq e 2,1 MBq 64 Cu-PTSM mas aumentar o tempo de etiquetagem até 3 h para estudos comparativos 17.
    2. Avance para o passo 5 para determinar a quantidade óptima de actividade.

5. Avaliação in vitro do efeito do marcador radioactivo em Células Cova-TH1

NOTA: A caracterização das influências do marcador radioactivo nas células TH1 é realizada por meio de ensaio de exclusão de azul de tripano para a viabilidade, o IFN-y de ELISA para a avaliação da funcionalidade e V coloração PE-Anexina para a indução de apoptose 16, 17. Determinação da absorção intracelular e o efluxo de radioactividade é também descrita abaixo. Como comparação, as células 64 de Cu-PTSM marcado Cova-TH1 também pode ser usado.

  1. Efeito na viabilidade por exclusão de azul tripano
    1. Ajustar, pelo menos, 18 x 10 6 culas Cova-TH1 radiomarcados com 0,7 MBq / 10 6 culas, 1,4 MBq / 10 6 culas e 2,1 MBq / 10 6 culas, respectivamente, a uma concentração de 2 x 10 6 culas / mL e executar passos 5.1. 2-5.1.7 para cada dose de actividade. Use non-radioactive KJ1-26-mAb marcado células Cova-TH1 e células Cova-TH1 n marcados como os controlos.
    2. Pipete 1 mL de solução de células em 9 pos de uma placa de 24 poços.
    3. Recolhe-se o conteúdo de 3 poços em 3 15 ml separados parafuso tubos de tampão, 3 h após a radiomarcação inicial.
    4. Lavar os poços agora vazios com meio pré-aquecido para minimizar a perda de células e adicionar o meio com os respectivos 15 mL parafuso tubos tampão a partir do passo 5.1.3.
    5. Centrifugar os tubos de 15 ml a 400 xg durante 5 min e ressuspender o sedimento de células resultante em 1 mL de meio de pré-aquecido.
    6. Contagem de células viáveis ​​e mortas, tanto em azul de tripano separadamente para cada tubo de 15 ml e calcular a percentagem de células viáveis.
    7. Repita os passos 5.1.3-5.1.6 24 e 48 h após a 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb radiomarcao.
  2. Efeitos sobre a funcionalidade determinada através de ELISA de IFN-y
    NOTA: Para avaliar o efeito do 64 Cu-DOTA-KJ1 26-mAb radioactivo em productio IFN-γn como um marcador de funcionalidade, realizar um ELISA de IFN-γ a partir de um fornecedor comercial e referem-se a referência 17 para mais detalhes.
    1. Dispersa-se 10 5 culas vieis em 100 uL de meio sobre uma placa de 96 poços, 3 h após 64 Cu-DOTA-KJ1-26 radiomarcação das células Cova-TH1 com 0,7 MBq, 1,4 MBq ou 2,1 MBq. Use ou 64 células não marcadas, não radioactivos KJ1-26-mAb marcados com Cu-PTSM marcados Cova-TH1 como os controlos.
    2. Estimular a produção de IFN-γ em 10 5 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb marcados com células Cova-TH1 em 100 uL de meio com 10 ug / mL de péptido Cova, 5 U / mL de IL-2 e 5x10 5 APCs em 100 ? L de meio durante 24 h a 37 ° C e 7,5% de CO 2. Outros controlos podem ser as outras condições, sem a adição do péptido Cova.
    3. Analisar o sobrenadante por ELISA de acordo com as instruções do fabricante.
    4. Repita o passo 5.2.2. a 5.2.3. às 24 e 48 h após o procedimento de marcação.
  3. A indução de apoptose determinada por PE-anexina V coloração por citometria de fluxo
    NOTA: Para avaliar a indução de apoptose pelo marcador radioactivo 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb, utilizar um kit disponível comercialmente para citometria de fluxo e preparar amostras de células de acordo com as instruções do fabricante antes de coloração com anexina V para a fosfatidil-serina exposição sobre a membrana celular .
    1. Às 3, 24 e 48 h após a 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb radiomarcação das células Cova-TH1, triplicados mancha com pelo menos 10 6 culas TH1 Cova-64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb marcados com o kit de anexina V de acordo com as instruções do fabricante e analisar na próxima hora. Use, 64 células não-radioactivos KJ1-26-mAb marcados com Cu-PTSM-marcados e não marcados Cova-TH1 como controlos. Consulte a Referência 17 para mais detalhes.
  4. Captação e de efluxo
    NOTA: A captação do 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb para dentro das células é medida num calibrador de doses e o efluxo de radioactividade é medida num ensaio de γ de contagem de 0, 5, 24, e 48 h após marcação radioactiva.
    1. Prepare dez tubos γ de contagem de cada para 64 células TH1 Cova-Cu-DOTA-KJ1-26-mAb marcados, o respectivo sobrenadante e o passo de lavagem.
    2. Transferir 10 6 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb marcado com células Cova-TH1 em 1 mL de meio em cada um dos dez tubos γ de contagem directamente após marcação radioactiva. Para cada um dos pontos de 5, 24 e 48 h após a radiomarcação de tempo, manter pelo menos 10 7, 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb marcados com células Cova-TH1 em meio em placas de 24 cavidades de cultura de culas numa incubadora a 37 ° C e 7,5% de CO 2.
    3. Centrifugar os tubos γ de contagem a 400 xg durante 5 min, e transferir o sobrenadante para novos tubos de dez γ-contagem.
    4. Lavar as células uma vez em 1 ml de meio para remover a fracção não ligada de 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb umd recolher o sobrenadante em dez novos tubos γ-contagem.
    5. Adicionar 1 mL de meio novo para as células Cova-TH1 e determinar o valor de absorção inicial de um calibrador de doses. Os tubos também pode ser armazenado numa incubadora a 37 ° C e 7,5% de CO 2.
    6. Repita os passos 5.4.2 a 5.4.5 após 5, 24 e 48 h e medir todos os tubos em um γ-contador de acordo com o protocolo do fabricante. Para corrigir quanto ao decaimento radioactivo e para a análise quantitativa, usar um padrão com uma dose definida de radioactividade.

6. OVA-induzida aguda das vias aéreas DTHR

NOTA: A dinâmica de migração e padrões homing de células radiomarcado Cova-TH1 transferidos adoptivamente e para o local da inflamação serão visualizados e quantificados em um modelo animal para-induzida das vias respiratórias Cova-DTHR 16, 17.

  1. Injectar 8 semanas de idade, ratinhos BALB / c IP com uma mistura de 150 mL aluminum gel / 50 uL Cova-solução (10 ug em 50 uL de PBS) para imunizar os ratinhos.
  2. Duas semanas após a imunização, anestesiar os ratos com 100 mg / kg de cetamina e 5 mg / kg de xilazina por injecção ip. Colocar os ratinhos experimentais sobre as suas costas e lentamente pipetar 100 ug Cova dissolvido em 50 uL de PBS nas narinas dos animais. Os animais vai inalar a gota solução a gota.
  3. Repetir após 24 h. Para induções DTHR vias aéreas mais fortes, repita novamente após 48 h.
  4. Para analisar a migração específica das células TH1 Cova-transferidos, induzir a via aérea-DTHR com peru-ou faisão-OVA como controlo. Portanto, repita os passos de 6,1-6,3 usando o respectivo OVA-proteína.

7. Na In Vivo usando PET / CT

NOTA: Imagiologia in vivo de 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb marcados com células Cova-TH1 em Cova-DTHR ratinhos doentes e animais da mesma ninhada de controlo demonstra o homing específica e a midinâmica gração das células Cova-Th1. Por isso, adquirir exames PET estáticos e anatómica tomografias sequencialmente transferência adoptiva de células pós 3, 24 e 48 h.

  1. Directamente após marcação radioactiva, ajustar as 64 células TH1 Cova-Cu-DOTA-KJ1-26-mAb marcados com 5 x 10 7 células / ml para injecção ip de 10 7 culas em 200? L.
  2. Usando uma seringa de 1 mL e uma agulha de calibre 30, desenhar 200 uL da suspensão de células TH1 Cova-64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb marcado e injectar as células ip nos animais Cova-DTHR-doentes entre a quatro e 5 de mamilo. Para determinar a quantidade total de radioactividade injectada, medir a seringa num calibrador de doses antes e depois da injecção.
  3. Anestesiar os ratos, 10 min antes do tempo de absorção desejado, com 1,5% de isoflurano em 100% de oxigénio (taxa de fluxo: 0,7 L / min) numa caixa de anestesia com temperatura controlada.
  4. Entretanto, para facilitar a co-registrationde imagens PET e CT durante a análise de imagem, corrigir capilares de vidro contendo 64 solução de Cu-DOTA-KJ1-26-mAb ou solução livre 64 CuCl 2 sob a cama de rato.
    1. Por conseguinte, preparar uma solução de 0,37 MBq / ml e preencher capilares de vidro com um volume de 10 ul com esta solução. Uma vez que os sinais de radioactividade derivada de células são inerentemente fraco, não usar quantidades elevadas de actividade para certificar-se de que os marcadores não interferem com sinais derivados de células em ratinhos.
  5. Depois de se atingir a tolerância cirúrgica, como indicado pela perda do reflexo de retirada do pedal do membro posterior, transferir o rato para uma cama de animais de pequeno porte e PET-CT-compatível equipado com um sistema de tubagem adequada para manter a anestesia.
  6. Imobilizar o mouse em cima da cama de pequenos animais usando cotonetes e fita cirúrgica. Aplicar pomada para evitar o ressecamento dos olhos.
  7. Transferir a cama do rato para o aparelho de PET, o centro do campo de visão com um focus nos pulmões e adquirir um 20 min PET scan estático com uma janela de energia de 350-650 KeV.
  8. Transfira a cama do mouse para o scanner CT. Via olheiro vista, centro do campo de visão sobre os pulmões. Adquirir uma imagem plana CT através de projecções 360, durante uma rotação de 360 ​​° no modo "passo e disparar" com um tempo de exposição de 350 ms e binning factor de quatro.

Análise 8. Imagem

  1. Reconstruir os dados de modo de lista de PET através da aplicação de algoritmo iterativo 2D estatística ordenada maximização subconjunto expectativa (OSEM) e tomografia computadorizada em uma imagem 3D com um tamanho de pixel de 75? M.
  2. Para uma imagem co-registo em um software de análise de imagem apropriado (por exemplo Inveon Research Workplace ou Pmod), use a ferramenta de co-registo automático. Se isto falhar, usar os capilares de vidro sob a cama de rato como orientação para co-registar as imagens de PET e CT reconstruídos espacialmente na axial, coronal e sagital.
  3. Corrigir as imagens de PETpara o decaimento radioactivo usando a lei de decaimento radioactivo e a meia-altura do radionuclídeo 64 Cu a 12,7 h. Para normalização imagem, escolher uma imagem (A) como uma referência e ajustar a intensidade da imagem de exibição no respectivo software de análise de imagem.
    1. Utilizando os valores assim definidas para a imagem de referência (A), a actividade injectada (A) e a actividade injectada para as outras imagens (X), normalizar as outras imagens usando a seguinte equação: (actividade injectada (X) / actividade injectada ( A)) Os valores x intensidade (A).
  4. Desenhar volumes 3D de interesse (ISV) do sinal de PET normalizado dos linfonodos pulmonares e perithymic.
  5. Determinar a dose injectada percentagem por cm 3 (% ID / cm3), usando a seguinte equação: (média de actividade da actividade ISV / global no murganho) x 100. Para orientação adicional relativa à análise de imagem, ver referências 22, 23.

Resultados

A Figura 1 resume a marcação das células Cova-TH1 com o 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb e a concepção experimental para o in vitro e em estudos in vivo abrangidos neste protocolo.

figure-results-345
Figura 1: 64 de Cu-DOTA-KJ1-26-mAb processo de etiquetagem & Desenho Experimental. (A)

Discussão

Este protocolo apresenta um método de confiança e fácil de radiomarcar estavelmente células para o rastreamento in vivo por PET. Utilizando este método, as células Cova-TH1, isoladas e expandidas in vitro a partir de ratinhos dadores, poderia ser marcado radioactivamente com 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb e sua homing foi rastreado para o LNS pulmonares e perithymic como locais de apresentação em um Cova Cova-induzida DTHR aguda das vias aéreas.

A modificação d...

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Os autores agradecem a Dr. Julia Mannheim, Walter Ehrlichmann, Ramona Stumm, Funda Cay, Daniel Bukala, Maren Harant, bem como Natalie Altmeyer pelo apoio durante a análise experiências e dados. Este trabalho foi apoiado pela Werner Siemens-Foundation, o DFG através do SFB685 (B6 projeto) e Fortune (2309-0-0).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
HCl, SuprapurMerck, Darmstadt, Germany1.0031864Cu production
Methanol, SuprapurMerck, Darmstadt, Germany1.0600764Cu production
Isopropanol, SuprapurMerck, Darmstadt, Germany1.010464Cu production
Pt/Ir (90/10) plateÖgussaCustom made64Cu production
PEEK chamberWKLCustom made64Cu production
64NiChemotrade64Cu production
Polygram SIL G/UV 254 plateMacherey-Nagel80502164Cu production
Ion exchange columnBioRadAG1-X864Cu production
Solid state target system for PETtraceWKLcostum made64Cu production
64Cu work-up moduleWKLcostum made64Cu production
Dose calibratorCapintecCRC-25R
PETtrace cyclotronGeneral Electric Medical Systems
DOTA-NHSMacrocyclicsB-280DOTA-conjugation
Anti-cOVA-TCR antibody (KJ1-26)Isolated from hybridoma cell cultureDOTA-conjugation
Na2HPO4Sigma-Aldrich71633DOTA-conjugation
H+ Chelex 100Sigma-AldrichC7901DOTA-conjugation
Amicon Ultra-15 filter unitMerck MilliporeUFC910008DOTA-conjugation
Rotipuran ultrapure waterCarl RothHN68.3DOTA-conjugation
Ammonium acetateSigma-Aldrich32301DOTA-conjugation
PBSUniversity TuebingenDOTA-conjugation
Micro Bio-spin P-6 columnBio-Rad Laboratories7326221DOTA-conjugation
Sodium citrateSigma-Aldrich71497DOTA-conjugation
Cyclone Plus PhosphorImager Perkin-ElmerL2250116DOTA-conjugation
DMEMMerck Millipore102568ingredient for T cell medium 
FCSMerck MilliporeS0115/1004Bingredient for T cell medium 
Sodium pyruvateMerck MilliporeL0473ingredient for T cell medium 
MEM-amino acidsMerck MilliporeK0293ingredient for T cell medium 
HEPES Merck MilliporeL 1613ingredient for T cell medium 
 Penicillin/StreptomycinMerck MilliporeA2212ingredient for T cell medium 
0.05 mM 2-β-mercaptoethanolSigma-AldrichM3148ingredient for T cell medium 
DO11.10 micein-house breedingTH1 cell culture
DPBSGibco14190144TH1 cell culture
Cell strainer 40 µm Corning352340TH1 cell culture
ACK Lysing BufferLonza10-548ETH1 cell culture
CD4 MicroBeads, mouseMiltenyi Biotech130-097-145TH1 cell culture
QuadroMACS separatorMiltenyi Biotech130-090-976TH1 cell culture
LS columnMiltenyi Biotech130-042-401TH1 cell culture
anti-CD4 antibody (Gk1.5)Isolated from hybridoma cell cultureTH1 cell culture
anti-CD8 antibody (5367.2)Isolated from hybridoma cell cultureTH1 cell culture
Anti-rat antibody (MAR18.5)Isolated from hybridoma cell cultureTH1 cell culture
Rabbit complement MAtebu-BioCL3221TH1 cell culture
Anti-IL-4 antibody (11B11)Isolated from hybridoma cell cultureTH1 cell culture
cOVA 323-339-peptide EMC-micro-collectionsCustom orderTH1 cell culture
CPG1668-oligonucleotidesEurofins MWG OperonCustom orderTH1 cell culture
IL-2Novartis65483-116-07TH1 cell culture
96-well platesGreiner 655180TH1 cell culture
24-well platesGreiner 662160TH1 cell culture
cell culture flaskGreiner 660175TH1 cell culture
48-well platesGreiner 677 180cell labeling
Gammacell 1000Best Theratronicsvia inquiry 
Gulmay RT225Gulmayvia inquiry 
Trypan blueMerck MilliporeL6323in vitro evaluation
Mouse IFN-γ ELISABD Biosciences558258in vitro evaluation
PE Annexin V Apoptosis Detection Kit BD Biosciences559763in vitro evaluation
Tube 5 mLSarstedt55.476in vitro evaluation
Round-bottom tubes BD Biosciences352008in vitro evaluation
Wizard γ-counterPerkin-Elmer2480-0010in vitro evaluation
ELISA Reader MultiscanEXThermo Fisher Scientific51118177in vitro evaluation
MicroscopeLeicavia inquiry in vitro evaluation
BD LSRII BD Biosciencesvia inquiry in vitroevaluation
BALB/c miceCharles River028in vivo cell trafficking
Aluminum gelServa Electrophoresis12261.01in vivo cell trafficking
XylazineBayer HealthCareOrdered via University hospitalin vivo cell trafficking
KetamineRatiopharmOrdered via University hospitalin vivo cell trafficking
IsofluraneCP-PharmaOrdered via University hospitalin vivo cell trafficking
30 G needleBD Biosciences304000in vivo cell trafficking
SyringeBD Biosciences11612491in vivo cell trafficking
Capillaries 10 µLVWR612-2439
Inveon PET scannerSiemens Healthineersno longer availablein vivo cell trafficking, alternative companies: Bruker, Mediso 
Inveon SPECT/CT scannerSiemens Healthineersno longer availablein vivo cell trafficking
Inveon Research WorkplaceSiemens Healthineersimage analysis, alternative software: Pmod

Referências

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