Visualización y análisis cuantitativo de la angiogénesis embrionaria<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Resumen

Este protocolo demuestra un método basado en la fluorescencia para visualizar la vasculatura y para cuantificar su complejidad en Xenopus tropicalis . Los vasos sanguíneos pueden visualizarse minutos después de la inyección de un colorante fluorescente en el corazón de un embrión después de manipulaciones genéticas y / o farmacológicas para estudiar el desarrollo cardiovascular in vivo .

Resumen

Los vasos sanguíneos suministran oxígeno y nutrientes en todo el cuerpo, y la formación de la red vascular está bajo un estricto control del desarrollo. La visualización in vivo eficaz de los vasos sanguíneos y la cuantificación confiable de su complejidad son fundamentales para comprender la biología y la enfermedad de la red vascular. Aquí, proporcionamos un método detallado para visualizar los vasos sanguíneos con un colorante fluorescente comercialmente disponible, plasma humano acetilado de lipoproteína de baja densidad DiI complejo (DiI-AcLDL), y para cuantificar su complejidad en Xenopus tropicalis . Los vasos sanguíneos pueden ser etiquetados mediante una simple inyección de DiI-AcLDL en el corazón de un embrión y los vasos sanguíneos de todo el embrión se pueden visualizar en embriones vivos o fijos. Combinada con la perturbación génica por la microinyección dirigida de ácidos nucleicos y / o la aplicación en el baño de reactivos farmacológicos, las funciones de un gen o de una vía de señalización sobre el desarrollo vascular pueden ser inveEstigmatizados en una semana sin recurrir a sofisticados animales modificados genéticamente. Debido al sistema venoso bien definido de Xenopus y su angiogénesis estereotípica, el brote de vasos preexistentes, la complejidad de los vasos pueden ser cuantificados eficientemente después de experimentos de perturbación. Este protocolo relativamente simple debe servir como una herramienta de fácil acceso en diversos campos de la investigación cardiovascular.

Introducción

La vasculogénesis, la formación de nuevos vasos sanguíneos de células endoteliales recién nacidas y la angiogénesis, la formación de nuevos vasos de vasos preexistentes, son dos procesos distintos que configuran la vasculatura embrionaria ¹ . Cualquier desregulación en estos procesos da como resultado varias enfermedades del corazón y anomalías estructurales de los vasos. Además, el crecimiento tumoral está asociado con un crecimiento descontrolado de vasos. Como tal, los mecanismos moleculares subyacentes a la vasculogénesis y la angiogénesis son objeto de intensa investigación [ ^2] .

Xenopus y pez cebra son modelos de vertebrados atractivos para estudios de vasculogénesis y angiogénesis, por varias razones. Primero, sus embriones son pequeños; Por lo tanto, es relativamente fácil imaginar toda la vasculatura. En segundo lugar, el desarrollo embrionario es rápido; Sólo toma un par de días para que se desarrolle toda la vasculatura, durante cuyo tiempo la vascula en desarrollo Una imagen. En tercer lugar, las intervenciones genéticas y farmacológicas antes y durante la formación de los vasos son fáciles de llevar a cabo, por ejemplo mediante la microinyección de morfolino nucleótidos antisentido (MOs) en el embrión en desarrollo oa través de la aplicación de ba~no de fármacos ^{3 , 4 , 5} .

La ventaja única de Xenopus sobre el pez cebra es que las manipulaciones embriológicas pueden realizarse porque Xenopus sigue clivajes holoblásticos estereotípicos y el mapa embrionario del destino está bien definido ⁶ . Por ejemplo, es posible generar un embrión en el que sólo se manipula genéticamente un lado lateral mediante la inyección de un MO antisentido a una célula en la etapa de dos células. También es posible trasplantar el corazón primordio de un embrión a otro para determinar si el gen ejerce su función por una célula intrínseca o mecanismo -extrínsecoAsno = "xref"> 7. Aunque estas técnicas se han desarrollado principalmente en Xenopus laevis , que es alotetraploide y por lo tanto no es ideal para los estudios genéticos , pueden aplicarse directamente a Xenopus tropicalis , una especie diploide estrechamente relacionada ⁸ .

Una manera de visualizar la vasculatura en un embrión vivo de Xenopus es inyectar un colorante fluorescente para marcar los vasos sanguíneos. La lipoproteína de baja densidad acetilada (AcLDL) marcada con una molécula fluorescente tal como DiI es una sonda muy útil. A diferencia de la LDL no acetilada, la AcLDL no se une al receptor de LDL ⁹ sino que es endocitados por los macrófagos y las células endoteliales. La inyección de DiI-AcLDL en el corazón de un animal vivo resulta en el marcaje fluorescente específico de las células endoteliales, y toda la vasculatura puede ser visualizada por microscopía de fluorescencia en embriones vivos o fijos [ ^4] .

Aquí prestamosDe protocolos detallados para la visualización y cuantificación de vasos sanguíneos utilizando DiI-AcLDL en Xenopus tropicalis ( Figura 1 ). Proporcionamos puntos prácticos clave, con ejemplos de experimentos exitosos y sin éxito. Además, proporcionamos un método sencillo para el análisis cuantitativo de la complejidad vascular, que podría ser útil para evaluar los efectos de factores genéticos y ambientales en la conformación de la red vascular.

Protocolo

Todos los experimentos cumplieron con los protocolos aprobados por el Colegio Universitario de Medicina de la Universidad de Medicina Institucional Cuidado de Animales y Comités de Uso.

1. Preparación de los embriones de Xenopus tropicalis

NOTA: Los embriones de Xenopus tropicalis se produjeron como se describió anteriormente ¹⁰ , con ligeras modificaciones. Xenopus tropicalis embriones se realizaron de acuerdo con las tablas de Nieuwkoop y Faber [ ^11] .

1. Inducción de la ovulación
   1. Para inyectar la gonadotropina coriónica humana (hCG) en el saco linfático dorsal de un par de ranas (un macho y una hembra) el día anterior al día de apareamiento. Inyectar 20 unidades por rana hembra y 10 unidades por macho. Casa de un macho y una hembra en el mismo tanque durante la noche (por más de 18 h).
   2. Para cebar, al día siguiente, se inyectan 200 unidades de hCG a la hembra preimpregnada y 100 unidades de hCG a la preimpregnadamasculino; La hembra preparada comenzará a poner huevos en aproximadamente 3 h y continuará haciéndolo durante todo el día. Mantenga los pares macho y hembra juntos para apareamiento natural o en tanques separados para fertilización in vitro (paso 1.2).
2. Fertilización
   NOTA: Los huevos pueden ser fertilizados por apareamiento natural o fertilización in vitro . En el apareamiento natural, los huevos son fertilizados a medida que se ponen, y por lo tanto, el momento de la fertilización no puede ser controlado. Alternativamente, una rana hembra cebada puede alojarse en un tanque separado y los huevos no fertilizados pueden ser recolectados para fertilización in vitro , lo que genera cientos de embriones fertilizados al mismo tiempo. Este último enfoque es útil cuando la microinyección dirigida al blastómero se llevará a cabo antes del etiquetado del vaso. En este enfoque, sin embargo, un macho es sacrificado.
   1. Apareamiento natural
      1. Deje el par cebado macho y hembra en el mismo tanque. El macho se cierra el fEmana, que conduce a la fertilización inmediata de los huevos puestos. Recoger los huevos con una pipeta de vidrio o de plástico y transferirlos a una placa de Petri. Para evitar que los huevos se peguen a la pipeta, cubra la superficie interna de la pipeta con albúmina de suero bovino al 0,5% (BSA).
   2. Fertilización in vitro (FIV)
      1. Separar la hembra cebada del macho después del cebado. La hembra comenzará a poner huevos espontáneamente en aproximadamente 3 h. Transferir algunos huevos puestos con una pipeta revestida con BSA a una placa de Petri y comprobar su calidad bajo un microscopio. Si se ponen huevos sanos (pigmento claro, elástico en forma de bola), prepárese para diseccionar los testículos del macho cebado.
      2. Hacer 0.4% Tricaine metanosulfonato (MS222) para la eutanasia e inyectar 300 μ l en el saco dorsal linfáticos del macho cebado. En aproximadamente 10 minutos, el macho perderá su sentido del equilibrio y se mantendrá a flote; Confirmar que el macho es eutanasiado pellizcando una pata trasera con unaPar de fórceps romos y observando sin respuesta.
      3. Disecar los dos testículos, limpiarlos rápidamente tapándolos en papel sin pelusa y transferirlos a un microtubo que contenga 1 mL de L-15 Medium (60%) de Leibovitz suplementado con suero fetal bovino al 10% (FBS); Un procedimiento detallado se describe en otro lugar ¹⁰ .
      4. Picar suavemente los testículos con un mazo para extraer el esperma. A esta concentración ( es decir, 2 testículos en 1 ml de FBS al 10% en 60% de L-15), unas gotas de solución de testículo (0,1 ml) pueden fertilizar aproximadamente trescientos huevos. El esperma restante se puede almacenar a 4 ° C en un tubo bien sellado y se utiliza para la fertilización in vitro al día siguiente.
      5. Apriete los huevos de la hembra en una pequeña placa de Petri. Sostenga la parte superior de la hembra boca abajo en la palma y coloque el dedo índice entre sus patas traseras. Extender las patas traseras con el dedo índice y la otra mano para exponer la cloaca. Toca la cloaca a la placa de Petri. AbrigoPlato de Petri con 0,5% de BSA para distribuir uniformemente los huevos como monocapa durante la FIV.
      6. Añadir unas gotas (0,1 ml) de medio L-15 que contiene esperma a los huevos. Para la fertilización sincrónica, agitar suavemente la solución de esperma a través del plato. Después de 4 min a temperatura ambiente, llenar la placa de Petri con 0,01x Modificado Barth's Saline (MBS), incubar durante 10 min, y sustituir la solución con 0.1x MBS. Los huevos fertilizados sufrirán la primera escisión en aproximadamente 1 h a temperatura ambiente. 1x MBS es NaCl 88 mM, KCl 1 mM, NaHCO _ { ₃ } 2,5 mM, HEPES 5 mM, MgSO _ { ₄ } 1 mM y CaCl _ { ₂ } 0,7 mM, pH 7,5.
3. (Opcional) Inyección de oligonucleótidos (MOs) morfolinos antisentido y / o ARNm
   1. Para investigar el efecto de un gen de interés en la formación de vasos, realizar la microinyección de antisentido MO y / o mRNAs.
   2. Para tales experimentos, des-gelificar los huevos con 2% de L-cisteína en 1x MBS (pH 7,5-7,8).Reemplazar 0.1x MBS en el plato que contiene los embriones fertilizados con 2% de L-cisteína en 1x MBS. Remueva suavemente el plato para mezclar la solución.
      NOTA: Por lo general, se tarda unos 5 min para que los embriones se des-gelifican. Durante este paso, supervise los huevos frecuentemente para asegurarse de que no estén sobreexpuestos a la solución. Si los huevos están excesivamente expuestos, perderán elasticidad y se aplastarán, lo que causará desarrollo aberrante y letalidad.
   3. Lave los huevos de gelatina cinco veces con 0.1x MBS. Realizar la microinyección en Ficoll 4% disuelto en 0.1x MBS. Típicamente, inyectar 4 ng de MO y 600 pg de mRNA por blastómero en la etapa de dos células. Inyectar en una célula para manipular la expresión génica en sólo un lado del embrión. Utilice el lado no inyectado del mismo embrión como control.
   4. Como otro control para la especificidad de la manipulación de genes, inyectar la misma cantidad de un MO de control (CoMO) o ARNm de control ( por ejemplo, mARN de beta-galactosidasa). CoMO debe tener el mismo mOlecular como MO específico del gen y no debe dirigirse a ningún gen en el genoma de Xenopus . Para facilitar la visualización del lado inyectado, utilice MO marcado con fluoresceína o co-inyecte un trazador ( por ejemplo, EGFP mRNA).
   5. Dejar los embriones inyectados en 4% de Ficoll durante 2 hy luego transferirlos a una nueva placa de Petri de 60 mm llena de 0.1x MBS.
4. Levantamiento
   1. Levante los embriones a 23 ° C. Aunque la velocidad de desarrollo puede ser ralentizada o acelerada usando temperaturas por debajo o por encima de 23 ° C, respectivamente (rango: 16-26 ° C), se recomienda levantarlas a 23 ° C.
5. (Opcional) Tratamiento con reactivos farmacológicos
   1. Para manipulaciones farmacológicas, administrar fármacos a los embriones en desarrollo por aplicación de baño.

2. Preparación de Inyección de DiI-AcLDL

1. Hacer una pipeta de vidrio ahusante con un micr estándarExtractor opipette Coloque un tubo de vidrio de borosilicato en el extractor de micropipeta y utilice los siguientes ajustes: presión, 200; Calor, 30; Pull, 30; Velocidad 120; Tiempo, 200.
2. Almacene la solución madre DiI-ACLDL a 4 ° C. Tome la parte clara superior de la solución inyectable, pero no las partículas precipitadas en el fondo del tubo. Cualquier desecho en la pipeta de vidrio perturbar la correcta expulsión de la solución.
3. Llenar la pipeta de vidrio preparada con una cantidad adecuada de solución DiI-AcLDL (~ 5 μL) usando un microcargador.
4. Corte la punta de la pipeta de vidrio poco a poco usando un par de pinzas finas (número 55). Configure el sistema de inyección controlado por presión de modo que se expulsen aproximadamente 5 nL de solución a la vez; 50-60 nL de solución DiI-ACLDL es suficiente para manchar los vasos de un embrión.
5. No deje la pipeta con DiI-ACLDL en el aire durante un período de tiempo prolongado para evitar el secado. Mantenga la punta de la pipeta sumergida en MS al 0,04%222 en una solución de 0.1X MBS. Justo antes de inyectarlo en el embrión (paso 4.2.1), verifique si la misma cantidad de colorante se expulsa.

3. Configuración de la inyección

1. Molde de Sylgard
   1. Para preparar un pequeño molde de Sylgard, mezcle la base de Sylgard y el agente de curado con una relación de peso de 10 a 1. Llene aproximadamente la mitad de una pequeña placa de Petri (plato de 35 mm o 60 mm) con esta solución mezclada y luego deje solidificar durante aproximadamente 48 h a temperatura ambiente.
2. Anestesia
   1. Utilizar MS222 al 0,04% en 1x MBS (pH 7,5-8,0) para la anestesia. Cuando se necesita una anestesia prolongada ( por ejemplo, durante la imagen en vivo), use MS222 al 0.04% en 0.1x MBS para reducir el desequilibrio osmótico. Para ajustar el pH, agregue unas gotas de NaOH (~ 20 μL) y compruebe el pH usando papel de pH.
   2. Espere hasta que los embriones transferidos dejen de moverse. Toque las aletas dorsales de los embriones e inspeccione si responden a confirmar completar unaNesthesia.
3. Posicionamiento de embriones para inyección
   1. Indent la superficie del molde endurecido de Sylgard con una cuchilla fina y afilada. Hacer una hendidura cóncava en forma de V en la que colocar los embriones (véase la figura 2D ). Coloque un embrión anestesiado, ventral hacia arriba, de forma ligeramente oblicua (aproximadamente 30 °) ( Figura 2D ).
   2. Llenar el molde con solución MS222 y colocar los embriones en el molde.

4. Inyección DiI-AcLDL

1. Incisión de la piel sobre el corazón
   1. Prepare dos alfileres (Minutiens, 0,10 mm) para cortar la piel sobre el corazón. Fije firmemente cada pasador a un porta-pernos; El corazón debe ser fácilmente identificable a medida que pulsa ( Figura 2A-2C , rosa).
   2. Perfore la piel de un embrión con un alfiler. Inserte el pasador a través del agujero en el espacio entre el corazón y la piel ( Figura 2C , flecha sólida). No perfore el corazón. Coloque la parte insertada de este pasador en la región donde se realizará la incisión.
   3. Haga una incisión lineal frotando suavemente el otro pasador sostenido fuera de la piel contra el pasador insertado. Amplíe suavemente esta incisión con dos clavijas, exponiendo el corazón ( Figura 2B ' y 2D' , flecha). La pipeta cargada con DiI-AcLDL puede ahora acercarse directamente al corazón ( Figura 2D ' ).
2. Inyección
   1. Inserte la punta de la pipeta de vidrio cargada en el corazón e inyecte 50-60 nL de solución DiI-ACLDL en aproximadamente 10 pulsos de inyección. No inyecte una cantidad excesiva de solución, ya que provoca la ruptura del corazón. Compruebe si el corazón sigue latiendo después de la inyección. Después de cada inyección, compruebe si la misma cantidad de DiI-AcLDL es expulsada; De lo contrario, la punta de la pipeta puede estar bloqueada (ver paso 2.5).
3. Recuperación y control visual
   1. Transferir los embriones inyectados a una nueva placa de Petri llena de 0.1x MBS para su recuperación. Después de 5-10 min, los renacuajos deben recuperar la conciencia y empezar a moverse. En este momento, los vasos etiquetados pueden ser visualizados. Se recomienda que se visualicen visualmente los embriones marcados con éxito bajo un microscopio de fluorescencia ( Figura 3A y 3B ). Si se inyecta una cantidad insuficiente de DiI-AcLDL en un embrión, se puede inyectar de nuevo ( Figura 3C ).
   2. Deseche los renacuajos que tienen otros órganos etiquetados ( Figura 3D ). Continúe hasta que se obtenga el número requerido de embriones marcados con éxito.
4. (Opcional) Fijación de los embriones
   1. Para una imagen más completa de los vasos sanguíneos, utilice microscopía confocal; Podría ser más fácil fijar los embriones marcados para la microscopía confocal. Primero anestesiar los embriones marcados en MS222 al 0,04% en 1x MBS (pH 7,5-8,0) y luego se fijan en paraformaldehído al 4% en solución salina tamponada con fosfato 1X (PBS) durante 1 h a temperatura ambiente. Los embriones fijos se pueden almacenar durante varios días a 4 ° C; Proteger las muestras inyectadas de la luz para evitar el fotoblanqueo de la DiI.

5. Imágenes de DiI-AcLDL

1. Imágenes estereoscópicas
   1. Tomar fotografías bajo un microscopio estereoscópico de fluorescencia ( Figura 3 ) para evaluar la morfología general de la vasculatura.
   2. Fundir 1% de agarosa en 1x PBS para embriones fijos o en 1x MBS para imágenes en vivo. Vierta la agarosa fundida en una placa de Petri y espere hasta que se solidifique. Hacer una sangría poco profunda en la superficie del gel de agarosa que se ajustará al embrión a la imagen cuando se extiende en su lado lateral. Llenar el plato con tampón (solución MS222 para embriones anestesiados o 1x PBS para embriones fijos).
2. Microscopía de fluorescencia (Rhodamine filter seT)
   1. Como DiI es un colorante verde-excitado y que emite rojo, usando un filtro estándar para rodamina o fluoróforos relacionados espectralmente (excitación máxima a 554 nm y emisión a 571 nm). Colocar los embriones inyectados en las muescas en el molde de agarosa y tomar fotografías ( Figura 3 ).
3. Microscopia confocal
   NOTA: Para un análisis más detallado de la arquitectura vascular, utilice microscopía confocal.
   1. Si usa un microscopio invertido, coloque los embriones en un plato de fondo de vidrio. Añadir unas gotas de 1x PBS e inmovilizarlos colocando un cobertor en la parte superior. Quitar el exceso de PBS. Si los embriones vivos son imágenes, utilizar embriones anestesiados y utilizar 0,015% MS222 en 0,1x MBS en lugar de PBS.
   2. Para imágenes de baja ampliación, utilice un objetivo de 4X a 10X para encontrar el área de interés; La parte rostral de la vena cardinal posterior (PCV) es una región útil para investigar la angiogénesis del desarrollo (Figura 4, trazosCajas).
      1. Utilice un ajuste de adquisición para un fluoróforo de emisión roja (como Rhodamine).
      2. Haga imágenes apiladas en z mediante la obtención de imágenes de la mitad lateral de un embrión. En primer lugar, se centran en el PCV en el lado lateral cerca del objetivo y luego establecer el límite inferior del foco en la posición donde los buques más cercanos al objetivo están en foco. Establezca el límite superior en la posición en la que se puede enfocar la parte medial del PCV que se está formando una imagen. Imagen de toda esta mitad lateral del embrión. Utilice un software que almacena metadatos en los ajustes de adquisición, como las escalas x, y y z, ya que son necesarios para calcular las longitudes del recipiente.
      3. Si es necesario, utilice el modo de exploración de azulejos para imitar toda la vasculatura de un embrión. Determinar empíricamente el número de mosaicos horizontales y verticales.
   3. Para imágenes de alta magnificación, siga los procedimientos anteriores para la imagen de la parte rostral de la PCV y 4 rostral mayoría de las venas intersomíticas (ISV) ( Figura 4 ,Cuadro discontinuo). Ajuste el número de pilas (pila-z) y azulejos (escaneado de baldosas) de manera apropiada.

6. Cuantificación de los buques con etiqueta DiI

NOTA: Los vasos Di-etiquetados pueden rastrearse manualmente o usar software. Usamos "Simple neurite tracer", una libre ImageJ (NIH) plugin, que permite el seguimiento semiautomático de tubos como las estructuras como los vasos sanguíneos y neurites [ ^12] . Utilizando este software libre, se pueden calcular los siguientes parámetros. Un procedimiento detallado para el uso de este software se describe en otra parte (https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer) ¹² . A continuación, se utilizan ejemplos de la vasculatura de los embriones en los que Tie2 señalización es inhibido o mejorado ( Figura 4A-4C ) [ ^5] . Antisentido Tie2MO inyectados embriones exposición reduce la angiogénesis y acorta la ISVs ( Figura 4B ], mientras que la co-inyección de constitutivamente activa Tie2Mutante mRNA (caTie2 mRNA) sobre-rescata este fenotipo, dando lugar a exuberante ISV ramas ( Figura 4C ].

1. Longitudes ISV
   1. Usando el trazador simple de la neurita, calcule la longitud de cada recipiente trazado. Calcular las longitudes de los 4 ISVs rostral más.
2. Ramas ISV
   NOTA: En embriones de tipo salvaje, sólo unas pocas ramas cortas brotan de la mayoría de los ISV rostrales en la etapa 42.
   1. En el trazador simple de las neuritas, trace estos pequeños vasos después de hacer el ISV del cual originan la rama primaria. Calcular los siguientes parámetros de estas ramas originarias de los ISV.
   2. Número total de sucursales
      1. Una vez que todos los ISV y las ramas asociadas se trazan, calcular el número total de ramas ( Figura 5B-5D ).
   3. Orden de la sucursal
      1. Como Simple neurite tracer registra el orden de cada rama ( Figura 5A ), calculatE el número de sucursales para cada orden. La mayoría de los vasos en embriones de tipo salvaje deben ser ramas primarias ( es decir, ISVs).
   4. Índice de complejidad venosa (VCI)
      1. Como VCI es un parámetro útil para la complejidad de los vasos, lo que da más peso a las ramas de orden superior, calcular la VCI para cada embrión utilizando la fórmula de la Figura 5A . Por ejemplo, los embriones inyectados con Tie2MO tienen una VCI más baja en comparación con el control ( Figura 5B y 5C ), y los embriones inyectados con mRNA caTie2 tienen una VCI más alta ( Figura 5D ).

Resultados

Cronología de los experimentos (Figuras 1 y 2)

Poco después de la fecundación, la microinyección dirigida se puede realizar para modular la expresión génica. Por ejemplo, se puede inyectar un MO antisentido que se une específicamente al codón de iniciación del ARNm de Tie2 endógeno, inhibiendo la traducción del mRNA diana de Tie2 por impedimento estérico. Un MO puede conjugarse con fluoresceína para el fácil rastreo...

Discusión

El protocolo presentado aquí fue desarrollado por Ali H. Brivanlou y sus colegas para investigar eventos de desarrollo durante la formación vascular en Xenopus laevis ⁴ , pero, como se muestra en este manuscrito, se puede aplicar a otros animales pequeños. La inyección de colorante en el corazón es simple de realizar, y toda la red vascular puede ser visualizada bajo un microscopio de disección de fluorescencia, así como un microscopio confocal. Si el colorante se inyecta en el co...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm Petri dish	SPL	10035	Sylgard mold frame
60 mm Petri dish	SPL	10060	Embryo raising tray
Borosilicate Glass	Sutter instrument	B100-50-10	Needle for injection
BSA	Sigma	A3059-10G	Coating reagent
CaCl2	D.S.P.GR Reagent		0.1x MBS component
Coverslip	Superior	HSU-0111520	For confocal imaging
DiI-AcLDL	Thermo Fisher Scientific	L3484	Vessel staining solution
FBS	Hyclone	SH.30919.02	For storage of testis
Fiber Optical Illuminator	World Precision Instruments	Z-LITE-Z	Light
Ficoll	Sigma	F4375	Injection buffer
Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter instrument	P-97	Injection needle puller
Forcep	Fine Science Tool	11255-20	For embryo hatching and needle tip cutting
Glass Bottom dish	SPL	100350	For confocal imaging
hCG	MNS Korea		For priming of frogs
HEPES	Sigma	H3375	Buffering agent
Incubator	Lab. Companion	ILP-02	For raising embryos
KCl	DAEJUNG	6566-4400	MBS component
L15 medium	Gibco	11415-114	For storage of testis
L-cysteine	Sigma	168149-100G	De-jellying reagent
MgSO4	Sigma	M7506	MBS component
Microtube	Axygen	MCT-175-C-S	For storage of testis
MS222	Sigma	E10521	Anesthetic powder
NaCl	DAEJUNG	7647-14-5	MBS component
NaOH	Sigma	S-0899	pH adjusting reagent
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	Fixatives
PBS	BIOSESANG	P2007	Buffer for imaging
pH paper	Sigma	P4536-100EA	For confirming pH
PICO-LITER INJECTOR	Waner instruments	PLI-100A	For injection
Pin	Pinservice	26002-10	For incision
Pinholder	Scitech Korea	26016-12	For incision
Precision Stereo Zoom Binocular Microscope	World Precision Instruments	PZMIII	For visual screening
Standard Manual Control Micromanipulator	Waner instruments	W4 64-0056	For microinjection
SYLGARD 184 Kit	Dow Corning		For DiI injection
Transfer pipette	Korea Ace Scientific Co.	YM.B78-400	For eggs and embryo collection