Visualisation et analyse quantitative de l&#39;angiogenèse embryonnaire dans<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Résumé

Ce protocole démontre une méthode à base de fluorescence pour visualiser le système vasculaire et pour quantifier sa complexité chez Xenopus tropicalis . Les vaisseaux sanguins peuvent être imagés quelques minutes après l'injection d'un colorant fluorescent dans le coeur battant d'un embryon après des manipulations génétiques et / ou pharmacologiques pour étudier le développement cardiovasculaire in vivo .

Résumé

Les vaisseaux sanguins fournissent de l'oxygène et des nutriments dans tout le corps, et la formation du réseau vasculaire est soumise à un contrôle étroit du développement. La visualisation efficace in vivo des vaisseaux sanguins et la quantification fiable de leur complexité sont essentielles à la compréhension de la biologie et de la maladie du réseau vasculaire. Ici, nous fournissons une méthode détaillée pour visualiser les vaisseaux sanguins avec un colorant fluorescent disponible dans le commerce, un complexe DII-lipoprotéine à faible densité acétylée plasmatique humain (DiI-AcLDL) et à quantifier leur complexité chez Xenopus tropicalis . Les vaisseaux sanguins peuvent être étiquetés par une simple injection de DiI-AcLDL dans le coeur battant d'un embryon, et les vaisseaux sanguins dans l'ensemble de l'embryon peuvent être imagés dans des embryons vivants ou fixes. Combinée à la perturbation du gène par la micro-injection ciblée d'acides nucléiques et / ou l'application du bain de réactifs pharmacologiques, les rôles d'un gène ou d'une voie de signalisation sur le développement vasculaire peuvent être inveStigmatisé dans une semaine sans recourir à des animaux génétiquement modifiés. En raison du système veineux bien défini de Xenopus et de son angiogenèse stéréotypée, la germination des vaisseaux préexistants, la complexité des vaisseaux peut être quantifiée efficacement après les expériences de perturbation. Ce protocole relativement simple devrait servir d'outil facilement accessible dans divers domaines de la recherche cardiovasculaire.

Introduction

La vasculogenèse, la formation de nouveaux vaisseaux sanguins provenant de cellules endothéliales nouvellement nées et l'angiogenèse, la formation de nouveaux vaisseaux à partir de vaisseaux préexistants sont deux processus distincts qui forment la vascularisation embryonnaire ¹ . Toute dysrégulation dans ces processus entraîne diverses maladies cardiaques et anomalies structurelles des vaisseaux. En outre, la croissance tumorale est associée à une croissance non surveillée des vaisseaux. En tant que tel, les mécanismes moléculaires sous-jacents à la vasculogenèse et à l'angiogenèse font l'objet d'une enquête intense ² .

Xenopus et le poisson zèbre sont des modèles attrayants de vertébrés pour les études de vasculogenèse et d'angiogenèse, pour plusieurs raisons. Premièrement, leurs embryons sont petits; Par conséquent, il est relativement facile d'imaginer l'ensemble du système vasculaire. Deuxièmement, le développement embryonnaire est rapide; Il ne faut que quelques jours pour développer l'ensemble du système vasculaire, période pendant laquelle le vasculisme en développement L'image peut être imagée. Troisièmement, les interventions génétiques et pharmacologiques avant et pendant la formation des vaisseaux sont faciles à réaliser, par exemple grâce à la micro-injection de nucléotides morpholino-antisens (MO) dans l'embryon en développement ou par l'application du bain de médicaments ^{3 , 4 , 5} .

L'avantage unique de Xenopus sur le poisson zèbre est que des manipulations embryologiques peuvent être effectuées car Xenopus suit des clivages holoblastiques stéréotypés et la carte du sort embryonnaire est bien définie ⁶ . Par exemple, il est possible de générer un embryon dans lequel un seul côté latéral est manipulé génétiquement en injectant un MO antisens à une cellule au stade à deux cellules. Il est également possible de transplanter le primordium cardiaque d'un embryon à un autre pour déterminer si le gène exerce sa fonction par un mécanisme cellulaire intrinsèque ou extrinsèqueAss = "xref"> 7. Bien que ces techniques aient surtout été développées chez Xenopus laevis , qui est allotetraploïde et n'est donc pas idéale pour les études génétiques, elles peuvent être directement appliquées à Xenopus tropicalis , une espèce diploïde étroitement liée ⁸ .

Une façon de visualiser le système vasculaire dans un embryon Xenopus vivant consiste à injecter un colorant fluorescent pour étiqueter les vaisseaux sanguins. La lipoprotéine de basse densité acétylée (AcLDL) marquée avec une molécule fluorescente telle que DiI est une sonde très utile. Contrairement aux LDL non acétylées, les LDL ne se lient pas au récepteur LDL ⁹ mais sont endocytées par les macrophages et les cellules endothéliales. L'injection de DiI-AcLDL dans le cœur d'un animal vivant entraîne l'étiquetage spécifique des cellules endothéliales par fluorescence et toute la vascularisation peut être imagée par microscopie fluorescente dans des embryons vivants ou fixes ⁴ .

Ici, nous présDes protocoles détaillés pour la visualisation et la quantification des vaisseaux sanguins utilisant DiI-AcLDL dans Xenopus tropicalis ( figure 1 ). Nous fournissons des points pratiques clés, avec des exemples d'expériences réussies et infructueuses. En outre, nous fournissons une méthode simple pour l'analyse quantitative de la complexité vasculaire, ce qui pourrait être utile pour évaluer les effets des facteurs génétiques et environnementaux sur la mise en forme du réseau vasculaire.

Protocole

Toutes les expériences ont respecté les protocoles approuvés par les comités institutionnels de soins et d'utilisation des animaux de l'Université de l'Université de Yonsei.

1. Préparation des embryons de Xenopus tropicalis

NOTE: Les embryons de Xenopus tropicalis ont été produits comme décrit précédemment ¹⁰ , avec une légère modification. Les embryons de Xenopus tropicalis ont été mis en scène selon les tableaux de Nieuwkoop et Faber ¹¹ .

1. Induction de l'ovulation
   1. Pour pré-amorcer, injecter une gonadotrophine chorionique humaine (hCG) dans le sac lymphatique dorsal d'une paire de grenouilles (un mâle et une femelle) le jour précédant le jour de l'accouplement. Injecter 20 unités par grenouille et 10 unités par homme. Entrez un homme et une femelle dans le même réservoir pendant la nuit (plus de 18 h).
   2. Pour amorcer, le lendemain, injectez 200 unités de hCG à la femelle pré-apprêtée et 100 unités de hCG au pré-apprêtémâle; La femelle amorcée commencera à mettre des oeufs environ 3 h et continuera à le faire tout au long de la journée. Gardez la paire masculine et féminine pour un accouplement naturel ou dans des réservoirs séparés pour la fécondation in vitro (étape 1.2).
2. Fertilisation
   NOTE: Les œufs peuvent être fécondés par accouplement naturel ou fertilisation in vitro . Dans l'accouplement naturel, les œufs sont fertilisés au fur et à mesure qu'ils sont posés et, par conséquent, le moment de la fécondation ne peut être contrôlé. Alternativement, une grenouille apprêtée peut être logée dans un réservoir séparé et les œufs non fertilisés peuvent être collectés pour la fertilisation in vitro , ce qui génère des centaines d'embryons fertilisés en même temps. Cette dernière approche est utile lorsque la micro-injection ciblée par blastomère sera effectuée avant l'étiquetage du navire. Dans cette approche, cependant, un homme est sacrifié.
   1. Accouplement naturel
      1. Quitter la paire femelle et mâle dans le même réservoir. Le mâle serra le fEmale, entraînant une fertilisation immédiate des œufs pondus. Recueillir les oeufs avec une pipette en verre ou en plastique et les transférer dans une boîte à pétri. Pour empêcher les oeufs de coller à la pipette, enduire la surface interne de la pipette avec une albumine de sérum bovin (BSA) à 0,5%.
   2. Fertilisation in vitro (FIV)
      1. Séparer la femelle apprêtée du mâle après l'amorçage. La femelle commencera à pondre spontanément les œufs dans environ 3 h. Transférer quelques œufs posés à l'aide d'une pipette enduit de BSA dans une boîte de Petri et vérifier leur qualité au microscope. Si des œufs sains (pigments clairs, élastiques en forme de boule) ont été posés, préparez-vous à disséquer les testicules du mâchoire apprêté.
      2. Faire 0,4% de méthanesulfonate de tricaine (MS222) pour l'euthanasie et injecter 300 μL dans le sac lymphatique dorsal du mâchoir apprêté. En environ 10 min, le mâle perd son sens de l'équilibre et restera à flot; Confirmez que le mâle est euthanasié en pinçant une patte arrière avec unPaire de pinces émoussées et n'observe aucune réponse.
      3. Dissectez les deux testicules, nettoyez-les en les tapant rapidement sur du papier sans peluches et transférez-les dans un microtube contenant 1 mL de 60% de milieu L-15 de Leibovitz additionné de 10% de sérum bovin fœtal (FBS); Une procédure détaillée est décrite ailleurs ¹⁰ .
      4. Masser doucement les testicules avec un pilon pour extraire le sperme. À cette concentration ( c.-à-d. 2 testicules dans 1 mL de FBS à 10% dans 60% de L-15), quelques gouttes de solution de testicule (0,1 mL) peuvent fertiliser environ trois cents oeufs. Le sperme restant peut être stocké à 4 ° C dans un tube hermétiquement fermé et utilisé pour la FIV le lendemain.
      5. Pressez les œufs de la femelle dans une petite boîte de Petri. Tenez la partie supérieure de la femelle à l'envers sur la paume et placez l'index entre ses pattes postérieures. Faites passer les pattes postérieures avec l'index et l'autre pour exposer le cloaca. Touchez le cloaca dans la boîte de Petri. Manteau tHe Petri avec 0,5% de BSA pour répartir uniformément les œufs en monocouche pendant la FIV.
      6. Ajoutez quelques gouttes (0,1 ml) de milieu L-15 contenant du sperme aux oeufs. Pour une fertilisation synchrone, remuer légèrement la solution de sperme sur le plat. Après 4 min à température ambiante, remplir la boîte de Petri avec 0.01x Modified Barth's Saline (MBS), incuber pendant 10 minutes et remplacer la solution par 0.1x MBS. Les œufs fertilisés subiront le premier clivage en environ 1 h à température ambiante. 1x MBS est 88 mM de NaCl, 1 mM de KCl, 2,5 mM de NaHC03, 5 mM d'HEPES, 1 mM de MgS04 et 0,7 mM de CaCl2, pH 7,5.
3. (Facultatif) Injection d'oligonucléotides morpholino antisens (MO) et / ou d'ARNm
   1. Pour étudier l'effet d'un gène d'intérêt sur la formation des vaisseaux, effectuer la micro-injection de MO antisens et / ou d'ARNm.
   2. Pour de telles expériences, dégraisser les oeufs avec 2% de L-cysteine ​​dans 1x MBS (pH 7,5-7,8).Remplacer 0.1x MBS dans le plat contenant les embryons fertilisés avec 2% de L-cysteine ​​dans 1x MBS. Tournez doucement le plat pour mélanger la solution.
      REMARQUE: il faut généralement environ 5 minutes pour que les embryons soient déshumelés. Au cours de cette étape, surveillez fréquemment les oeufs pour s'assurer qu'ils ne sont pas trop exposés à la solution. Si les œufs sont surexposés, ils perdront de l'élasticité et deviendront aplaties, ce qui entraînera un développement aberrant et une létalité.
   3. Laver les oeufs dégelés cinq fois avec 0,1x MBS. Effectuer la micro-injection dans 4% de Ficoll dissous dans 0,1 x MBS. Typiquement, injecter 4 ng de MO et 600 pg d'ARNm par blastomère au stade à deux cellules. Injecter dans une cellule pour manipuler l'expression des gènes sur un seul côté de l'embryon. Utilisez le côté non injecté du même embryon comme un témoin.
   4. Comme autre contrôle pour la spécificité de la manipulation des gènes, injectez la même quantité d'un MO de contrôle (CoMO) ou contrôlez l'ARNm ( par exemple, l'ARNm de la bêta-galactosidase). CoMO doit avoir le même mLe poids moléculaire comme MO spécifique du gène et ne doit pas cibler aucun gène dans le génome de Xenopus . Pour une visualisation facile du côté injecté, utilisez un MO marqué par fluorescéine ou co-injectez un traceur ( p. Ex., MRNA EGFP).
   5. Laissez les embryons injectés dans Ficoll 4% pendant 2 h puis transférez-les dans une nouvelle boîte de Petri de 60 mm remplie de 0,1 x MBS.
4. Élevage
   1. Relever les embryons à 23 ° C. Bien que la vitesse de développement puisse être ralentie ou accélérée en utilisant des températures inférieures ou supérieures à 23 ° C, respectivement (portée: 16-26 ° C), il est conseillé de les élever à 23 ° C.
5. (Facultatif) Traitement avec des réactifs pharmacologiques
   1. Pour les manipulations pharmacologiques, administrer des médicaments aux embryons en développement par application de bain.

2. Préparation de l'injection de DiI-AcLDL

1. Faire une pipette en verre effilé à l'aide d'un micromètre standardExtracteur d'opiette. Placez un tube en verre borosilicate dans l'extracteur à micropipette et utilisez les réglages suivants: pression, 200; Chaleur, 30; Pull, 30; Vitesse 120; Temps, 200.
2. Stocker la solution mère DiI-AcLDL à 4 ° C. Prenez la partie supérieure transparente de la solution pour injection, mais pas les particules précipitées au fond du tube. Tout débris dans la pipette en verre perturbera l'éjection correcte de la solution.
3. Remplissez la pipette en verre préparée avec une quantité appropriée de solution DiI-AcLDL (~ 5 μL) à l'aide d'un microchargeur.
4. Retirez la pointe de la pipette en verre peu à peu à l'aide d'une pince fine (numéro 55). Mettre en place le système d'injection à pression contrôlée afin d'éjecter environ 5 nL de solution à la fois; 50-60 nL de la solution DiI-AcLDL suffit à tacher les vaisseaux d'un embryon.
5. Ne laissez pas la pipette chargée DiI-AcLDL dans l'air pendant une période prolongée afin d'éviter le séchage. Garder la pointe de la pipette immergée dans 0,04% MS222 dans la solution MBS 0,1X. Juste avant de l'injecter dans l'embryon (étape 4.2.1), vérifiez si la même quantité de colorant éjecte.

3. Configuration de l'injection

1. Moule de Sylgard
   1. Pour préparer un petit moule de Sylgard, mélanger la base Sylgard et le durcisseur avec un rapport pondéral de 10 à 1. Remplir environ la moitié d'une petite boîte de Petri (plat 35 mm ou 60 mm) avec cette solution mélangée puis laissez-la solidifier pendant environ 48 h à température ambiante.
2. Anesthésie
   1. Utilisez 0,04% de MS222 dans 1x MBS (pH 7,5-8,0) pour l'anesthésie. Lorsqu'une longue anesthésie est nécessaire ( p. Ex., Lors de l'imagerie en direct), utilisez MSC222 0,04% dans 0,1% de MBS pour réduire le déséquilibre osmotique. Pour ajuster le pH, ajouter quelques gouttes de NaOH (~ 20 μL) et vérifier le pH en utilisant du papier pH.
   2. Attendez que les embryons transférés cessent de bouger. Touchez les nageoires dorsales des embryons et vérifiez s'ils répondent pour confirmer compléter unNesthésie.
3. Positionnement des embryons pour injection
   1. Déposer la surface du moule Sylgard durci avec une lame mince et pointue. Faire une indentation concave en forme de V pour placer les embryons (voir la figure 2D ). Placez un embryon anesthésié, côté ventrale vers le haut, de manière légèrement oblique (environ 30 °) ( Figure 2D ).
   2. Remplissez le moule avec une solution MS222 et placez les embryons dans le moule.

4. DiI-AcLDL Injection

1. Incision de la peau qui recouvre le cœur
   1. Préparez deux broches (Minutiens, 0,10 mm) pour couper la peau qui recouvre le cœur. Fixez complètement chaque goupille sur un porte-épingle; Le cœur doit être facilement identifiable car il pulsse ( Figure 2A-2C , rose).
   2. Percer la peau d'un embryon avec une épingle. Insérez la broche dans le trou dans l'espace entre le cœur et la peau ( figure 2C , flèche pleine). Ne percute pas le cœur. Placez la partie insérée de cette broche dans la région où l'incision sera effectuée.
   3. Faites une incision linéaire en frottant doucement l'autre cheville maintenue à l'extérieur de la peau contre la broche insérée. Agrandissez doucement cette incision avec deux épingles, exposant le cœur ( Figure 2B ' et 2D' , flèche). La pipette chargée avec DiI-AcLDL peut maintenant s'approcher directement du coeur ( Figure 2D ' ).
2. Injection
   1. Insérez la pointe de la pipette de verre chargée dans le cœur et injectez 50 à 60 nL de solution DiI-AcLDL dans environ 10 impulsions d'éjection. Ne pas injecter une quantité excessive de solution, car elle provoque une rupture du cœur. Vérifiez si le cœur continue de battre après l'injection. Après chaque injection, vérifiez si la même quantité de DiI-AcLDL est éjectée; Sinon, la pointe de la pipette peut être bloquée (voir l'étape 2.5).
3. Récupération et dépistage visuel
   1. Transférer les embryons injectés dans une nouvelle boîte de Petri remplie de 0,1 x MBS pour récupérer. Après 5 à 10 minutes, les têtards doivent retrouver la conscience et commencer à bouger. À l'heure actuelle, les vaisseaux étiquetés peuvent être imagés. Il est recommandé d'examiner visuellement des embryons étiquetés avec succès sous un microscope à fluorescence ( Figure 3A et 3B ). Si une quantité insuffisante de DiI-AcLDL est injectée dans un embryon, elle peut être à nouveau injectée ( Figure 3C ).
   2. Jeter les têtards qui ont d'autres organes marqués ( figure 3D ). Continuez jusqu'à ce que le nombre requis d'embryons étiquetés avec succès soit obtenu.
4. (Facultatif) Fixation des embryons
   1. Pour une imagerie plus approfondie des vaisseaux sanguins, utiliser une microscopie confocale; Il pourrait être plus facile de réparer les embryons marqués pour la microscopie confocale. Anesthésier les embryons marqués dans 0,04% MS222 en 1x MBS (pH 7,5-8,0) et ensuite les réparer dans du paraformaldéhyde à 4% dans de la solution salée tamponnée au phosphate 1X (PBS) pendant 1 h à température ambiante. Les embryons fixés peuvent être stockés pendant plusieurs jours à 4 ° C; Protéger les échantillons injectés de la lumière pour éviter le photoblanchage du DII.

5. Imagerie de DiI-AcLDL

1. Imagerie stéréoscopique
   1. Prenez des photos sous un microscope à fluorescence stéréoscopique ( Figure 3 ) pour évaluer la morphologie globale du système vasculaire.
   2. Faire fondre 1% d'agarose dans 1x PBS pour des embryons fixes ou en 1x MBS pour l'imagerie en direct. Verser l'agarose fondu dans une boîte de Petri et attendre jusqu'à ce qu'elle se solidifie. Effectuez une échancrure superficielle à la surface du gel d'agarose qui s'adaptera à l'embryon à imager lorsqu'il est couché sur son côté latéral. Remplir le plat avec un tampon (solution MS222 pour des embryons anesthésiés ou 1x PBS pour des embryons fixes).
2. Microscopie de fluorescence (filtre à rhodamineT)
   1. Comme DiI est un colorant émoussé vert et émetteur rouge, une image utilisant un ensemble de filtres standard pour la rhodamine ou des fluorophores apparentés à la spectralité (excitation maximale à 554 nm et émission à 571 nm). Placez les embryons injectés dans les indentations sur le moule d'agarose et prenez des photos ( Figure 3 ).
3. Microscopie confocale
   NOTE: Pour une analyse plus approfondie de l'architecture vasculaire, utilisez une microscopie confocale.
   1. Si vous utilisez un microscope inversé, placez les embryons sur un plat en verre. Ajouter quelques gouttes de 1x PBS et les immobiliser en plaçant un slip sur le dessus. Enlevez l'excès de PBS. Si les embryons vivants doivent être imagés, utiliser des embryons anesthésiés et utiliser 0,015% de MS222 dans 0,1x MBS au lieu de PBS.
   2. Pour une imagerie à faible grossissement, utilisez un objectif 4X à 10X pour trouver la zone d'intérêt; La partie rostrale de la veine cardiaque postérieure (PCV) est une région utile pour étudier l'angiogenèse du développement (figure 4, pointillédes boites).
      1. Utilisez un paramètre d'acquisition pour un fluorophore à émission rouge (tel que Rhodamine).
      2. Faites des images empilées en z par imagerie de la moitié latérale d'un embryon. Tout d'abord, mettez l'accent sur le PCV sur le côté latéral près de l'objectif, puis réglez la limite inférieure de la mise au point à la position où les vaisseaux les plus proches de l'objectif sont concentrés. Réglez la limite supérieure à la position où la partie médiane du PCV en cours d'image peut être focalisée. Image cette moitié latérale entière de l'embryon. Utilisez un logiciel qui stocke les métadonnées sur les paramètres d'acquisition, telles que les échelles x, y et z, car elles sont nécessaires pour calculer les longueurs des navires.
      3. Si nécessaire, utilisez le mode balayage de la tuile pour imaginer l'ensemble du système vasculaire d'un embryon. Déterminer de façon empirique le nombre de carreaux horizontaux et verticaux.
   3. Pour une imagerie à grand grossissement, suivez les procédures ci-dessus pour imaginer la partie rostrale du PCV et 4 veines intersomiites (ISVs) rostrales ( figure 4 ,Boîte pointillée). Ajustez le nombre de piles (z-stack) et les tuiles (balayage de la tuile) de manière appropriée.

6. Quantification des navires étiquetés DiI

REMARQUE: les navires étiquetés DiI peuvent être tracés manuellement ou utiliser un logiciel. Nous utilisons le «traceur de neurites simple», un plugin gratuit ImageJ (NIH), qui permet le traçage semi-automatique de structures tubulaires telles que les vaisseaux sanguins et les neurites ¹² . En utilisant ce logiciel gratuit, les paramètres suivants peuvent être calculés. Une procédure détaillée pour l'utilisation de ce logiciel est décrite ailleurs (https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer) ¹² . Ci-dessous, nous utilisons des exemples du système vasculaire d'embryons dans lequel la signalisation Tie2 est inhibée ou améliorée ( figure 4A-4C ) ⁵ . L'exposition aux embryons antisens Tie2MO-injectée réduit l'angiogenèse et raccourcit les ISV ( Figure 4B ), alors que la co-injection de Tie2 active constitutivementL'ARNm mutant (ARNm caTie2) surpasse ce phénotype, ce qui entraîne des branches exubérantes d'ISV ( Figure 4C ).

1. Longueurs ISV
   1. En utilisant le traceur de neurites simple, calculez la longueur de chaque vaisseau tracé. Calculez les longueurs des 4 ISV plus grands de Rostral.
2. Branches ISV
   NOTE: Dans les embryons de type sauvage, seules quelques branches courtes jaillissent de la plupart des ISV au rostral au stade 42.
   1. Dans le traceur de neurites simple, tracez ces petits vaisseaux après avoir fait l'ISV d'où ils proviennent la branche primaire. Calculez les paramètres suivants de ces branches provenant des ISV.
   2. Numéro de branche totale
      1. Une fois que tous les ISV et les branches associées sont tracés, calculez le nombre total de branches ( Figure 5B-5D ).
   3. Ordre de succursale
      1. Comme le traceur de neurites simple enregistre l'ordre de chaque branche ( Figure 5A ), calculerE le nombre de succursales pour chaque commande. La majorité des navires dans les embryons de type sauvage devraient être des branches primaires ( c'est-à-dire les ISV).
   4. Indice de complexité des veines (VCI)
      1. Comme VCI est un paramètre utile pour la complexité des navires, qui donne plus de poids aux branches d'ordre supérieur, calculez le VCI pour chaque embryon en utilisant la formule de la Figure 5A . Par exemple, les embryons injectés Tie2MO ont une VCI plus faible par rapport au contrôle ( Figure 5B et 5C ), et les embryons injectés par ARNm caTie2 ont un VCI plus élevé ( Figure 5D ).

Résultats

Chronologie des expériences (figures 1 et 2)

Peu de temps après la fécondation, une micro-injection ciblée peut être effectuée pour moduler l'expression des gènes. Par exemple, un MO antisens qui se lie spécifiquement au codon d'initiation de l'ARNm Tie2 endogène peut être injecté, inhibant la traduction de l'ARNm cible Tie2 par un empêchement stérique. Un MO peut être conjugué à la fluorescéine p...

Discussion

Le protocole présenté ici a d'abord été développé par Ali H. Brivanlou et ses collègues pour enquêter sur les événements de développement lors de la formation vasculaire dans Xenopus laevis ⁴ , mais, comme le montre ce manuscrit, il peut être appliqué à d'autres petits animaux. L'injection de teinture dans le cœur est simple à réaliser, et l'ensemble du réseau vasculaire peut être imagé sous un microscope à dissection de fluorescence, ainsi qu'un ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm Petri dish	SPL	10035	Sylgard mold frame
60 mm Petri dish	SPL	10060	Embryo raising tray
Borosilicate Glass	Sutter instrument	B100-50-10	Needle for injection
BSA	Sigma	A3059-10G	Coating reagent
CaCl2	D.S.P.GR Reagent		0.1x MBS component
Coverslip	Superior	HSU-0111520	For confocal imaging
DiI-AcLDL	Thermo Fisher Scientific	L3484	Vessel staining solution
FBS	Hyclone	SH.30919.02	For storage of testis
Fiber Optical Illuminator	World Precision Instruments	Z-LITE-Z	Light
Ficoll	Sigma	F4375	Injection buffer
Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter instrument	P-97	Injection needle puller
Forcep	Fine Science Tool	11255-20	For embryo hatching and needle tip cutting
Glass Bottom dish	SPL	100350	For confocal imaging
hCG	MNS Korea		For priming of frogs
HEPES	Sigma	H3375	Buffering agent
Incubator	Lab. Companion	ILP-02	For raising embryos
KCl	DAEJUNG	6566-4400	MBS component
L15 medium	Gibco	11415-114	For storage of testis
L-cysteine	Sigma	168149-100G	De-jellying reagent
MgSO4	Sigma	M7506	MBS component
Microtube	Axygen	MCT-175-C-S	For storage of testis
MS222	Sigma	E10521	Anesthetic powder
NaCl	DAEJUNG	7647-14-5	MBS component
NaOH	Sigma	S-0899	pH adjusting reagent
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	Fixatives
PBS	BIOSESANG	P2007	Buffer for imaging
pH paper	Sigma	P4536-100EA	For confirming pH
PICO-LITER INJECTOR	Waner instruments	PLI-100A	For injection
Pin	Pinservice	26002-10	For incision
Pinholder	Scitech Korea	26016-12	For incision
Precision Stereo Zoom Binocular Microscope	World Precision Instruments	PZMIII	For visual screening
Standard Manual Control Micromanipulator	Waner instruments	W4 64-0056	For microinjection
SYLGARD 184 Kit	Dow Corning		For DiI injection
Transfer pipette	Korea Ace Scientific Co.	YM.B78-400	For eggs and embryo collection