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  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Se desarrolló un método selectivo y sensible de espectrometría de masa tándem de cromatografía líquida (LC-MS / MS) acoplado con una extracción en fase sólida eficiente en una microplaca de 96 pocillos de intercambio catiónico de modo mixto (MCX) para la medición de 3-nitrotirosina libre 3-NT) en la orina humana con alto rendimiento, que es adecuado para aplicaciones clínicas.

Resumen

La 3-nitrotirosina libre (3-NT) ha sido ampliamente utilizada como un posible biomarcador para el estrés oxidativo. Los niveles aumentados de 3-NT han sido reportados en una amplia variedad de condiciones patológicas. Sin embargo, los métodos existentes carecen de la suficiente sensibilidad y / o especificidad necesarias para medir el bajo nivel endógeno de 3-NT confiablemente y son demasiado engorrosos para aplicaciones clínicas. Por lo tanto, la mejora analítica es urgentemente necesario para cuantificar con precisión los niveles de 3-NT y verificar el papel de 3-NT en condiciones patológicas. Este protocolo presenta el desarrollo de una nueva cromatografía líquida de espectrometría de masa tándem (LC-MS / MS) de detección combinado con una extracción de fase sólida miniaturizada (SPE) para la medición rápida y precisa de 3-NT en la orina humana como un biomarcador no invasivo Para el estrés oxidativo. SPE utilizando una placa de 96 pocillos marcadamente simplificado el proceso mediante la combinación de la limpieza de muestras y el enriquecimiento de analito sin derivatización tedioso y etapas de evaporación, La reducción del consumo de disolventes, la eliminación de residuos, el riesgo de contaminación y el tiempo total de procesamiento. El empleo de acetato de amonio 25 mM (NH 4 OAc) a pH 9 como la solución SPE elución mejora sustancialmente la selectividad. La respuesta de la señal de espectrometría de masas se mejoró mediante el ajuste de las transiciones de monitorización de reacción múltiple (MRM). El uso de HCOOH al 0,01% como aditivo en una columna de pentafluorofenilo (PFP) (150 mm x 2,1 mm, 3 mu m) mejoró la respuesta de señal 2,5 veces más y acortó el tiempo total de ejecución a 7 min. Se alcanzó un límite inferior de cuantificación (LLOQ) de 10 pg / mL (0,044 nM), lo que representa una mejora significativa de la sensibilidad con respecto a los ensayos descritos. Este método simplificado, rápido, selectivo y sensible permite procesar dos placas de muestras de orina (n = 192) en un período de 24 h. Teniendo en cuenta el rendimiento analítico notablemente mejorado y el muestreo de orina no invasivo y barato, el ensayo propuesto es beneficioso para las pruebas preclínicas y clínicasestudios.

Introducción

Los efectos del estrés oxidativo en la presentación clínica se han puesto en primer plano en los últimos años 1 . Uno de los biomarcadores que se están explorando es la 3-nitrotirosina (3-NT), un producto estable al final formado cuando las especies reactivas del nitrógeno (RNS) interactúan con la tirosina, un precursor del neurotransmisor de la catecolamina. Aunque 3-NT puede tener valor clínico como un biomarcador para RNS in vivo, los cambios sustanciales de las propiedades y funciones de la tirosina puede afectar negativamente a las correspondientes proteínas y funciones celulares [ 1 , 2] . Investigaciones emergentes han sugerido que el 3-NT puede desempeñar un papel importante en las condiciones inflamatorias 3 , los trastornos neurodegenerativos 4 , 5 , las enfermedades cardiovasculares 6 y la diabetes 7 , así como las condiciones relacionadas con el estrés oxidativo. Sin embargo, estos obseLas revisiones se basan en resultados de metodologías que carecen de sensibilidad y / o selectividad 8 , 9 , 10 , 11 . Los enormes rangos de concentración de 3-NT para las muestras biológicas previamente reportadas en la literatura revelan que se asocian serios problemas analíticos con estos ensayos y se necesita una mejora técnica para cuantificar con precisión los niveles de 3-NT y verificar su papel en la patología de estas condiciones .

La cuantificación de 3-NT libre en matrices biológicas presenta un reto especial para el hombre y el instrumento 8 , 9 , 10 , 11 . En primer lugar, el nivel de traza de 3-NT endógeno requiere una detección ultra-sensible; Segundo, la existencia de numerosos análogos estructuralmente similares, especialmente la tirosina, que está presente enGran exceso, requiere un alto grado de selectividad; Tercero, la formación artefactual de NT-NT por nitración de tirosina con nitrato y nitrito omnipresentes requiere consideración especial durante la preparación de la muestra para evitar una falsa sobrestimación del 3-NT.

Entre una amplia variedad de metodologías empleadas para medir el 3-NT, MS / MS ha sido considerado el método estándar de oro debido a su superior sensibilidad y selectividad 11 , 12 , 13 , 14 . La cromatografía de gases (GC) acoplada MS / MS ofrece la mejor sensibilidad, sin embargo, los pasos indispensables de derivatización de la muestra son demasiado tediosos y requieren mucho tiempo para ser eficientes para la utilidad clínica 15 , 16 . LC-MS / MS no requiere derivatización de muestras complejas, lo que la convierte en la opción más prometedora. Sin embargo, hay varios obstáculos a superar como elNsitivity de los métodos de LC-MS / MS reportados en la literatura necesita mejorar para la medición de 3-NT 7 , 17 , 18 y el tiempo de respuesta relativamente largo debe ser acortado para aplicaciones de alto rendimiento 12 , 13 , 17 , 19 .

Además, al considerar las aplicaciones clínicas, la matriz biológica utilizada desempeña un papel importante. Debe ser fácil y barato de obtener y no invasivo si es posible 20 , 21 , 22 . El plasma, la muestra tradicionalmente utilizada en la literatura, no es una matriz clínicamente deseable, por lo que se buscó una metodología que utilizara orina que no sea invasiva y que tuviera un costo efectivo.

Varios intentos de desarrollar relSe han realizado metodologías LC-MS / MS específicas y específicas con la orina 9 , 10 , 11 . Sin embargo, todos ellos han dejado de ser selectivos, fiables o suficientemente eficaces para el uso clínico. Se ha cuestionado la efectividad de la SPE predominante con cartucho tradicional de fase inversa (tipo C18) como limpieza de muestra para el análisis de 3-NT y se ha propuesto una SPE secuencial de intercambio catiónico fuerte (SCX) y C18-OH de fase inversa 6 , 7 , 19 . Un método recientemente desarrollado de LC-MS / MS utilizó un proceso de purificación de etapas múltiples de SPE C18 manual, cromatografía líquida de alta presión preparativa (HPLC) y SPE en línea para análisis de 3-NT 23 . Aunque este método fue lo suficientemente sensible para fines clínicos, con un LLOQ de 0,041 nM, el proceso de limpieza fue intensivo y tedioso y requiRojo 3 mL de orina, lo que limita su viabilidad para el alto rendimiento. Se empleó un polímero impreso molecularmente como sorbente SPE para mejorar la eficiencia del proceso de limpieza 14 , pero el LLOQ resultante (0,7 μg / ml) no era lo suficientemente bajo como para muestras clínicas. Otro método requirió LC-MS / MS bidimensional (2D) y cromatografía de inmunoafinidad para la limpieza de muestras con el fin de alcanzar un límite de detección (LOD) de 0,022 nM [ 24] . Si bien todos estos métodos han hecho avances en la evaluación de 3-NT, ninguno ha logrado la sensibilidad, fiabilidad y eficiencia necesarias para las aplicaciones clínicas.

Con el fin de investigar la patología de 3-NT libre y su papel como un biomarcador de estrés oxidativo en clínicas, hemos desarrollado una metodología que es simple, eficiente, precisa y precisa, lo que permite de alto rendimiento aplicaciones clínicas 25 . Una catión de modo mixto miniaturizado excHange (MCX) de 96 pocillos se realizó una microplaca de extracción para lograr una simple y efectiva limpieza de muestras y enriquecimiento de 3-NT en una sola extracción, superando los inconvenientes observados en los métodos existentes que requieren derivatización, evaporación y 2D-LC. La cromatografía líquida con HCOOH al 0,01% como aditivo en fase móvil ofreció una respuesta de señal mejorada con un tiempo de ciclo rápido. La selectividad se mejora aún más mediante la aplicación de un NH 4 solución de elución suave OAc para la elución selectiva de 3-NT, y el uso de transición MRM para ambos 3-NT y el patrón interno (IS). El efecto de la matriz se compensa mediante el uso de una cantidad reducida de un 13 isotópica C marcado preferido es para la cuantificación. Con el advenimiento de esta metodología, los investigadores y los médicos serán capaces de verificar el papel de 3-NT en las condiciones clínicas y seguir explorando el impacto del estrés oxidativo.

Protocolo

Todos los estudios que incluyeron muestras de orina humana se realizaron siguiendo el procedimiento aprobado por la Junta de Revisión Institucional de Pharmasan / Neuroscience (IRB).

1. Recogida de muestras de orina y determinación de creatinina (Cr)

  1. Recoger 5 ml de la mañana siguiente muestras de orina después de ca. 10 h de ayuno durante la noche en un tubo de transporte A de 5 ml que contiene 250 μl de HCl 3 N como conservante y se almacena a -20 ° C hasta su uso.
  2. Descongelar y vortex 5 ml de orina de transporte Un tubo y centrifugar en una centrífuga ( por ejemplo, Sorvall) (2297 xg, 10 min).
  3. Alícuota 1 ml de orina dos veces del tubo de transporte de 5 ml A.
  4. Determinar Cr por un método de creatinina urinaria 26 .

2. Preparación de muestras estándar, IS y control de calidad (QC)

  1. Preparar una solución madre de 3-NT a 100 μg / mL en agua con 0,01% de HCOOH fase móvil A (MA) y almacenar a -20 ° C.
  2. HacerUna solución patrón de trabajo de 3 NT a una concentración de 100 ng / ml diluyendo la solución madre de 3-NT de 100 μg / mL con MA.
  3. Generar estándares que varían de 5 a 2500 pg / mL por dilución del estándar de trabajo de 100 ng / mL con orina en blanco acidificada con HCl 0,15 M libre de 3-NT junto con muestras en blanco y doble en blanco.
  4. Preparar una solución madre de IS 13 C 9 -3-NT a 100 μg / mL en agua con MA y almacenar a -20 ° C.
  5. Hacer una solución de trabajo IS a 500 pg / mL mediante la dilución de la solución madre de 13 C 9 -3-NT IS de 100 μg / mL con MA.
  6. Establecer cinco niveles de muestras QC que cubran los niveles LLOQ, bajo, medio y alto ( es decir , 10, 25, 100, 500 y 1.250 pg / mL), por dilución del estándar de trabajo 3-NT en la orina en blanco acidificada.

3. Procedimiento de extracción en fase sólida

  1. Descongelar y vortizar muestras de orina, patrones y muestras de control de calidad.
  2. Añadir muestras de orina, normas y QC samp(250 mu l cada uno) a 32 pocillos de una placa de recogida de 96 pocillos limpios de 2 ml.
  3. Introducir la solución de 500 μg / ml de solución de IS (50 μl) en cada pocillo, excepto en el pocillo de muestras en blanco doble. Se añade HCOOH al 0,01% (50 mu l) al pocillo de muestra doble en blanco.
  4. Añadir agua de LC - MS / MS con HCOOH al 0,1% (250 mu L).
  5. Mezclar la mezcla anterior con una pipeta de 8 canales tres veces.
  6. Cubra la placa hasta cargar SPE.
  7. Coloque una placa de extracción MCX de 96 pocillos y un depósito de recogida en un procesador de presión positiva.
  8. Condicione la placa de extracción con MeOH fluido (200 μl) a través del sorbente.
  9. Equilibrar por flujo de agua con HCOOH al 2% (200 μl) a través del sorbente.
  10. Cargue el volumen entero de cada una de las muestras premezcladas cuidadosamente en la placa de extracción previamente acondicionada con una pipeta de 8 canales.
  11. Ajuste la presión positiva baja ( por ejemplo , 3 psi) en el procesador de presión positiva para permitir que la mezcla fluyaO el sorbente lentamente, ajustar la presión si es necesario.
  12. Lavar los pozos con agua corriente con HCOOH al 2% (200 μl) a través del sorbente.
  13. Lave los pocillos fluyendo metanol (200 μl) a través del sorbente.
  14. Lave los pozos con agua corriente (200 μl) a través del sorbente.
  15. Seque completamente los pocillos con un ajuste de presión positiva alta ( por ejemplo , 40 psi) en el procesador de presión positiva.
  16. Vuelva a colocar el depósito con una placa de recogida de 96 pocillos limpia de 2 ml.
  17. Aplicar 25 NH mM 4 OAc a pH 9 (50 l) para eluir el analito retenido y es de la placa de extracción.
  18. Pipetear agua LC-MS con HCOOH al 5% (50 μl) para neutralizar el eluato.
  19. Mezclar tres veces con la pipeta de 8 canales y enviarlo a la estación LC-MS / MS para su análisis.

4. Análisis de LC-MS / MS

  1. Medir con exactitud 2.000 ml de agua LC-MS con un cilindro graduado y transferirlo a una botella de 2 litros.
  2. PAG200 μL de HCOOH puro en la botella anterior que contiene agua de LC-MS.
  3. Mezclar bien y etiquetar como fase móvil A (MA). Incluya iniciales, fecha de preparación y fecha de vencimiento.
  4. Tome una botella de 2 litros de metanol LC-MS y etiquételo como fase móvil B (MB) con fecha de inicio y fecha de caducidad.
  5. Ajuste la temperatura del auto-muestreador a 4 ° C.
  6. Coloque la placa de recogida con muestras preparadas en el inyector automático.
  7. Colocar una columna PFP (150 mm x 2,1 mm id, 3 μm) y una columna de protección en el horno.
  8. Ajuste la temperatura del horno a 30 ° C.
  9. Equilibrar 10 min usando el método de adquisición con la elución de gradiente de LC como se muestra en la Tabla 1 .
Tiempo (min) Módulo Eventos Parámetro
0 Zapatillas Bomba B Conc. 5
0,5 Zapatillas Bomba B Conc. 20
1 Zapatillas Bomba B Conc. 50
3 Zapatillas Bomba B Conc. 80
4 Zapatillas Bomba B Conc. 90
4,01 Zapatillas Bomba B Conc. 95
5,5 Zapatillas Bomba B Conc. 95
5,6 Zapatillas Bomba B Conc. 5
7 Controlador Detener

Tabla 1: Condiciones de Elución de Gradiente de Cromatografía Líquida

  1. Cree una lista de lotes que incluyaNormas, QC y muestras de orina.
  2. Iniciar el lote por inyección de las muestras preparadas (12 μl).

5. Identificación de Picos, Integración y Proceso de Datos

  1. Control de adquisición y procesamiento de datos mediante el software.
  2. Identificar e integrar los picos 3-NT e IS para todas las muestras.
  3. Establecer una curva estándar con el rango de 10-2,500 pg / mL para la cuantificación de 3-NT por regresión lineal de la relación de área de pico de 3-NT e IS frente a la concentración nominal de 3-NT con un factor de ponderación de 1 / x.
  4. Cuantificar todas las muestras utilizando la curva estándar.
  5. Determine si las muestras de QC caen en el rango establecido.
  6. Convertir las concentraciones detectadas de muestras de orina a los resultados finales en la unidad de nM o nmol / mmol Cr.

Resultados

La Figura 1 ilustra que el 3-NT está completamente separado cromatográficamente de otros análogos de tirosina estructuralmente similares bajo la condición LC optimizada, lo que elimina las interferencias co-eluyentes debidas a estos compuestos excesivamente excesivos y, en consecuencia, aumenta el grado de selectividad del ensayo. Además, la elución en gradiente con HCOOH al 0,01% como aditivo en MA y metanol a un caudal de 0,45 ml / min permite la elu...

Discusión

Las variaciones sustanciales en las concentraciones previamente reportadas en la literatura para el 3-NT libre endógeno en muestras de orina humana revelan problemas metodológicos asociados con los ensayos disponibles 8 , 9 , 10 , 11 . La determinación exacta del bajo nivel basal de 3-NT en la orina humana sigue siendo una tarea difícil que requiere precauciones especiales para la preparac...

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

Los autores reconocerían a Scott Howard y Abigail Marinack por el apoyo general y la coordinación de este trabajo.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
3-Nitro-L-tyrosineSigmaN7389-5g
3-Nitro-L-tyrosine-13C9Sigma652296-5.0mg
Mass Spec Gold UrineGolden West BiologicalsMSG 5000-1L
Oasis MCX 96-well µElution plateWaters186001830BA
2mL 96 well collection platePhenomenex  AH0-7194
96 positive processorWaters 186005521
LC-MS Ultra CHROMASOLV methanol  Sigma14262-2L
LC-MS Ultra CHROMASOLV waterSigma14263-2L
Formic acid for mass spectrometrySigma94318-50ML-F
Ammonium hydroxide solutionSigma338818-1L
Ultra PFP propyl columnsRestek9179362
5500 Triple quadAB Sciex /Contact manufacture for more detail
UFLC-XRShimadzu /Contact manufacture for more detail
Integra 400 Plus Roche/Urinary Creatinine Jaffé Gen 2 method
LCMS certified 12 x 32mm screw neck vialWaters600000751CV
LCGC certified 12 x 32mm screw neck total recovery vialWaters186000384C
5 mL transport tubePhenixTT-3205
50 mL Centrifuge tubeCrystalgen 23-2263
15 mL Centrifuge tubeCrystalgen 23-2266
eLine electronic pipetteSartorius730391
Microfuge centrifuge Beckman CoulterA46474
OHAUS balance  Kennedy Scales, inc.735
Vortex mixer Bernstead ThermolyneM16715

Referencias

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