Autori
Contattaci

Accedi

È necessario avere un abbonamento a JoVE per visualizzare questo. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Una metodica di spettrometria di massa tandem (LC-MS / MS) cromatografica a liquido selettivo e sensibile, accoppiata con un'estrazione efficiente di fase solida su una micropiastra a 96 pozzetti di MCX, è stata sviluppata per la misura della libera 3-nitrotirosina ( 3-NT) in urine umane con un elevato throughput, che è adatto per applicazioni cliniche.

Abstract

La libera 3-nitrotirosina (3-NT) è stata ampiamente utilizzata come possibile biomarker per lo stress ossidativo. Sono stati riportati livelli aumentati di 3 NT in una grande varietà di condizioni patologiche. Tuttavia, i metodi esistenti non dispongono di sufficiente sensibilità e / o specificità necessarie per misurare in modo affidabile il basso livello endogeno di 3 NT e sono troppo ingombranti per le applicazioni cliniche. Quindi, è urgentemente necessario un miglioramento analitico per quantificare accuratamente i livelli di 3 NT e verificare il ruolo del 3-NT in condizioni patologiche. Questo protocollo presenta lo sviluppo di una nuova rivelazione di spettrometria di massa tandem (LC-MS / MS) cromatografica a liquido combinata con un'estrazione miniaturizzata di fase solida (SPE) per la misurazione rapida ed accurata di 3-NT nelle urine umane come biomarker non invasivo Per lo stress ossidativo. SPE usando una piastra a 96 pozzetti ha semplificato notevolmente il processo combinando l'arricchimento del campione e l'arricchimento dell'analita- zione senza derivatizzazione e fasi di evaporazione, Riducendo il consumo di solventi, lo smaltimento dei rifiuti, il rischio di contaminazione e il tempo complessivo di lavorazione. L'impiego di 25 mM acetato di ammonio (NH 4 OAc) a pH 9 come soluzione di eluizione SPE ha migliorato sostanzialmente la selettività. La risposta al segnale di spettrometria di massa è stata migliorata attraverso la regolazione delle transizioni di monitoraggio delle reazioni multiple (MRM). L'uso di 0,01% HCOOH come additivo su una colonna pentafluorofenile (PFP) (150 mm x 2,1 mm, 3 μm) ha migliorato la risposta del segnale di un'altra 2,5 volte e ha abbreviato il tempo di esecuzione totale a 7 minuti. È stato raggiunto un limite inferiore di quantitativi (LLOQ) di 10 pg / mL (0,044 nM), che rappresenta un significativo miglioramento della sensibilità rispetto ai dosaggi riportati. Questo metodo semplificato, rapido, selettivo e sensibile consente di elaborare due lastre di campioni di urina (n = 192) in un periodo di 24 ore. Considerando le prestazioni analitiche notevolmente migliorate e il campionamento di urina non invasivo e poco costoso, il saggio proposto è vantaggioso per pre-cliniche e clinichestudi.

Introduzione

Gli effetti dello stress ossidativo sulla presentazione clinica sono stati spinti in prima linea negli ultimi anni 1 . Uno dei biomarcatori esplorati è la 3-nitrotirosina (3-NT), un prodotto stabile stabile formato quando le specie di azoto reattivo (RNS) interagiscono con la tirosina, un precursore di neurotrasmettitore di catecolamine. Mentre 3-NT può avere un valore clinico come biomarker per RNS in vivo, i cambiamenti sostanziali delle proprietà e delle funzioni della tirosina possono influenzare negativamente le corrispondenti proteine ​​e le funzioni cellulari 1 , 2 . La ricerca emergente ha suggerito che il 3-NT può svolgere un ruolo importante nelle condizioni infiammatorie 3 , nei disturbi neurodegenerativi 4 , 5 , nella malattia cardiovascolare 6 e nel diabete 7 , nonché nelle condizioni correlate allo stress ossidativo. Tuttavia, questi obseLe risposte si basano sui risultati di metodologie prive di sensibilità e / o selettività 8 , 9 , 10 , 11 . Le enormi intervalli di concentrazione di 3 NT per i campioni biologici precedentemente riportati in letteratura rivelano che sono stati associati seri problemi analitici con questi dosaggi e sono necessari miglioramenti tecnici per quantificare accuratamente i livelli di 3 NT e verificarne il ruolo nella patologia di queste condizioni .

La quantitazione di 3 NT gratuite in matrici biologiche rappresenta una sfida speciale per l'uomo e lo strumento 8 , 9 , 10 , 11 . In primo luogo, il livello di traccia di 3-NT endogeno richiede una rilevazione ultra-sensibile; In secondo luogo, l'esistenza di numerosi analoghi strutturalmente simili, in particolare la tirosina, che è presenteVasto eccesso, richiede un elevato grado di selettività; In terzo luogo, la formazione artificiale di 3 NT per nitrazione di tirosina con nitrati e nitriti onnipresenti richiede particolare attenzione durante la preparazione del campione per evitare falsi sovrastimazioni di 3 NT.

Tra un'ampia varietà di metodologie utilizzate per misurare 3-NT, MS / MS è stato considerato il metodo del gold standard dovuto alla sua maggiore sensibilità e selettività 11 , 12 , 13 , 14 . La cromatografia a gas (GC) accoppiata MS / MS offre la migliore sensibilità, tuttavia i passi indispensabili di derivatizzazione del campione sono troppo noiosi e richiedono molto tempo per essere efficienti per l'utilità clinica 15 , 16 . LC-MS / MS non richiede una derivatizzazione complessa del campione, rendendola l'opzione più promettente. Tuttavia, ci sono diversi ostacoli per superare come il seLa nsitività dei metodi LC-MS / MS riportati in letteratura deve essere migliorata per la misurazione della bassa abbondanza 3-NT 7 , 17 , 18 e il tempo di rotazione relativamente lungo deve essere abbreviato per applicazioni ad alta velocità 12 , 13 , 17 , 19 .

Inoltre, quando si considerano le applicazioni cliniche, la matrice biologica utilizzata svolge un ruolo significativo. Deve essere facile e poco costoso ottenere e non invasivo se possibile 20 , 21 , 22 . Il plasma, il campione tradizionalmente usato in letteratura, non è una matrice clinicamente desiderabile, quindi è stata ricercata una metodologia che utilizza urina non invasiva e conveniente.

Diversi tentativi di sviluppare relSono state effettuate metodologie LC-MS / MS specifiche e usando l'urina 9 , 10 , 11 . Tuttavia, essi non sono riusciti a essere selettivi, affidabili o efficienti per l'uso clinico. L'efficacia del SPE predominante che utilizza la cartuccia tradizionale a fase inversa (tipo C18) come pulizia del campione per l'analisi 3-NT è stata interrogata e è stato proposto un SPE sequenziale di scambio forte cation (SCX) e C18-OH in fase inversa 6 , 7 , 19 . Un metodo LC-MS / MS, recentemente sviluppato, ha utilizzato un processo di purificazione multipla di C18 SPE manuale, cromatografia liquida preparata ad alta pressione (HPLC) e SPE online per l'analisi di 3-NT 23 . Sebbene questo metodo fosse sufficientemente sensibile per scopi clinici, con un LLOQ di 0,041 nM, il processo di pulizia era intenso e noioso e richiedevaRosso 3 ml di urina, limitandone la sua fattibilità ad alta produttività. Un polimero impressa in molecola è stato impiegato come sorbente SPE per migliorare l'efficienza del processo di pulizia 14 , ma il risultato LLOQ (0,7 μg / mL) non era abbastanza basso per gli esemplari clinici. Un altro metodo ha richiesto la cromatografia bidimensionale (2D) LC-MS / MS e l'immunoaffinita per la pulizia del campione per ottenere un limite di rilevazione (LOD) di 0,022 nM 24 . Mentre tutti questi metodi hanno fatto progressi nella valutazione di 3-NT, nessuno ha raggiunto la sensibilità, l'affidabilità e l'efficienza necessaria per le applicazioni cliniche.

Per studiare la patologia del 3-NT libero e il suo ruolo di biomarker dello stress ossidativo in ambito clinico, abbiamo sviluppato una metodologia semplice, efficace, precisa e precisa, che consente di applicare applicazioni cliniche ad alto rendimento 25 . Un cation miniaturizzato in modalità mista excHange (MCX) è stata implementata in micropiastre di estrazione a 96 pozzetti per ottenere un semplice ed efficace processo di pulizia e arricchimento di 3 NT in una singola estrazione, superando gli inconvenienti osservati nei metodi esistenti che richiedono derivatizzazione, evaporazione e 2D-LC. La cromatografia liquida con 0,01% HCOOH come additivo in fase mobile ha offerto una risposta di segnale avanzata con un rapido tempo di ciclo. La selettività è stata ulteriormente migliorata attraverso l'applicazione di una soluzione di eluzione NH 4 OAc mite per l'eluizione selettiva di 3-NT e l'uso della transizione MRM per entrambi i 3 NT e lo standard interno (IS). L'effetto della matrice è stato compensato utilizzando una quantità ridotta di una isotopo preferito di 13 C-etero per la quantificazione. Con l'avvento di questa metodologia, i ricercatori e i clinici saranno in grado di verificare il ruolo di 3-NT nelle condizioni cliniche e di esplorare ulteriormente l'impatto dello stress ossidativo.

Protocollo

Tutti gli studi che hanno coinvolto campioni di urina umana sono stati condotti aderenza alla procedura approvata da Pharmasan / Neuroscience Institutional Review Board (IRB).

1. Determinazione del campione di urina e della determinazione della creatinina (Cr)

  1. Raccogli 5 ml dei campioni di urina del mattino successivo dopo ca. 10 ore di digiuno in un tubo di trasporto da 5 mL contenente 250 μL di 3 N HCl come conservante e conservare a -20 ° C fino all'uso.
  2. Sciogliere e vorticare 5 ml di urina di trasporto Un tubo e centrifugare in una centrifuga ( ad es. Sorvall) (2297 xg, 10 min).
  3. Aliquota 1 ml di urina due volte dal tubo di trasporto 5 mL.
  4. Determinare Cr con un metodo della creatinina urinaria 26 .

2. Preparazione dei campioni Standard, IS e Quality Control (QC)

  1. Preparare una soluzione di stock di 3 NT a 100 μg / mL in acqua con una fase mobile A (MA) di 0,01% HCOOH e conservare a -20 ° C.
  2. RendereUna soluzione di lavoro standard di 3-NT a concentrazione di 100 ng / mL diluendo la soluzione di stock di 3-NT di 100 μg / mL con MA.
  3. Generare standard che vanno da 5 a 2500 pg / mL per diluizione dello standard di lavoro di 100 ng / ml con 0,15 M HCl acidato vuoto in bianco senza 3 NT con campioni in bianco e doppio vuoto.
  4. Preparare una soluzione a base di IS 13 C 9 -3-NT a 100 μg / mL in acqua con MA e conservare a -20 ° C.
  5. Realizzare una soluzione di lavoro IS a 500 pg / mL diluendo la soluzione di stock di 100 μg / mL 13 C 9 -3-NT IS con MA.
  6. Stabilire cinque livelli di campioni di QC che coprono i livelli LLOQ, bassi, medi e alti ( vale a dire , 10, 25, 100, 500 e 1.250 pg / mL), diluendo lo standard di lavoro 3-NT nell'urina vuota acidificata.

3. Procedura di estrazione a fase solida

  1. Campioni di urina e di vortice, standard e campioni di QC.
  2. Aggiungere campioni di urina, standard e QC sampLes (250 μL ciascuno) a 32 pozzetti di una piastra di raccolta a 96 pozzetti puliti da 2 ml.
  3. Introdurre la soluzione di lavoro di 500 pg / ml IS (50 μL) ad ogni pozzetto, tranne il doppio campione di campioni vuoti. Aggiungere il 0,01% HCOOH (50 μL) al pozzetto campione doppio vuoto.
  4. Aggiungere acqua LC-MS / MS con 0,1% HCOOH (250 μL).
  5. Mescolare la miscela sopra con una pipetta a 8 canali tre volte.
  6. Coprire la piastra fino al caricamento SPE.
  7. Posizionare una piastra di estrazione MCX da 96 pozzetti e un serbatoio di raccolta su un processore a pressione positiva.
  8. Condizionare la piastra di estrazione con MeOH fluido (200 μL) attraverso il sorbente.
  9. Equilibrare con acqua corrente con 2% HCOOH (200 μL) attraverso il sorbente.
  10. Caricare l'intero volume di ciascuno dei campioni prelevati sulla piastra di estrazione pre-condizionata con una pipetta a 8 canali.
  11. Impostare una bassa pressione positiva ( ad esempio , 3 psi) sul processore di pressione positivo per consentire la miscelazione a fluireSe il sorbente è lento, regolare la pressione se necessario.
  12. Lavare i pozzetti con acqua fluente con 2% HCOOH (200 μL) attraverso il sorbente.
  13. Lavare i pozzetti facendo scorrere il metanolo (200 μL) attraverso il sorbente.
  14. Lavare i pozzetti con acqua corrente (200 μL) attraverso il sorbente.
  15. Asciugare completamente i pozzetti con un'alta pressione positiva ( es . 40 psi) sul processore di pressione positiva.
  16. Sostituire il serbatoio con una piastra di raccolta a 96 pozzetti da 2 ml.
  17. Applicare 25 mM NH 4 OAc a pH 9 (50 μL) per eluire l'analita conservata e IS dalla piastra di estrazione.
  18. Pipettare l'acqua LC-MS con 5% HCOOH (50 μL) per neutralizzare l'eluato.
  19. Mescolare con la pipetta a 8 canali tre volte e inviare alla stazione LC-MS / MS per l'analisi.

4. Analisi LC-MS / MS

  1. Misurare con precisione 2,000 ml di acqua LC-MS con un cilindro graduato e trasferirlo in una bottiglia da 2 L.
  2. PImmergere 200 μL di HCOOH puro nella bottiglia sopra riportata contenente acqua LC-MS.
  3. Mescolare accuratamente ed etichettare come fase mobile A (MA). Includi le iniziali, la data di preparazione e la data di scadenza.
  4. Prendere una bottiglia da 2 L di metanolo LC-MS e l'etichetta come fase mobile B (MB) con data di inizio e data di scadenza.
  5. Impostare la temperatura del campionatore automatico a 4 ° C.
  6. Posizionare la lastra di raccolta con campioni preparati nell'autocampionatore.
  7. Posizionare una colonna PFP (150 mm x 2,1 mm id, 3 μm) e una colonna di protezione nel forno.
  8. Impostare la temperatura del forno a 30 ° C.
  9. Equilibrare 10 min utilizzando il metodo di acquisizione con l'eluizione del gradiente LC come mostrato nella Tabella 1 .
Tempo (min) Modulo eventi Parametro
0 pompe Pompa B Conc. 5
0.5 pompe Pompa B Conc. 20
1 pompe Pompa B Conc. 50
3 pompe Pompa B Conc. 80
4 pompe Pompa B Conc. 90
4.01 pompe Pompa B Conc. 95
5.5 pompe Pompa B Conc. 95
5.6 pompe Pompa B Conc. 5
7 controllore Stop

Tabella 1: Condizioni di eluizione del gradiente di cromatografia liquida

  1. Creare un elenco di batch inclusoStandard, QC e campioni di urina.
  2. Avviare il lotto mediante l'iniezione dei campioni preparati (12 μL).

5. Identificazione del picco, integrazione e processo dei dati

  1. Controlla l'acquisizione e l'elaborazione dei dati utilizzando il software.
  2. Identificare e integrare picchi 3-NT e IS per tutti i campioni.
  3. Stabilire una curva standard con l'intervallo di 10-2.500 pg / mL per la quantitativa 3-NT mediante regressione lineare del rapporto di area di picco di 3-NT e IS rispetto alla concentrazione nominale 3-NT con un fattore di ponderazione di 1 / x.
  4. Quantifica tutti i campioni utilizzando la curva standard.
  5. Determinare se i campioni di QC cadono nell'intervallo stabilito.
  6. Convertire le concentrazioni rilevate di campioni di urina ai risultati finali nell'unità di nM o nmol / mmol Cr.

Risultati

La figura 1 illustra che 3-NT è completamente cromatograficamente separato da altri analoghi strutturali simili di tirosina sotto la condizione LC ottimizzata, che elimina le interferenze co-eluenti dovute a questi composti eccessivamente eccessivi e quindi aumenta il grado di selettività del dosaggio. Inoltre, l'eluizione di gradiente con 0,01% di HCOOH come additivo in MA e metanolo ad una velocità di flusso di 0,45 ml / min consente un'eluzione...

Discussione

Le variazioni sostanziali delle concentrazioni precedentemente riportate in letteratura per i campioni di urina umana libera 3-NT endogene rivelano problemi metodologici associati ai dosaggi disponibili 8 , 9 , 10 , 11 . La precisa determinazione del basso livello basale di 3-NT nelle urine umane rimane un compito impegnativo che richiede particolari precauzioni per la preparazione del campion...

Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.

Riconoscimenti

Gli autori avrebbero riconosciuto Scott Howard e Abigail Marinack per il sostegno generale e il coordinamento di questo lavoro.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
3-Nitro-L-tyrosineSigmaN7389-5g
3-Nitro-L-tyrosine-13C9Sigma652296-5.0mg
Mass Spec Gold UrineGolden West BiologicalsMSG 5000-1L
Oasis MCX 96-well µElution plateWaters186001830BA
2mL 96 well collection platePhenomenex  AH0-7194
96 positive processorWaters 186005521
LC-MS Ultra CHROMASOLV methanol  Sigma14262-2L
LC-MS Ultra CHROMASOLV waterSigma14263-2L
Formic acid for mass spectrometrySigma94318-50ML-F
Ammonium hydroxide solutionSigma338818-1L
Ultra PFP propyl columnsRestek9179362
5500 Triple quadAB Sciex /Contact manufacture for more detail
UFLC-XRShimadzu /Contact manufacture for more detail
Integra 400 Plus Roche/Urinary Creatinine Jaffé Gen 2 method
LCMS certified 12 x 32mm screw neck vialWaters600000751CV
LCGC certified 12 x 32mm screw neck total recovery vialWaters186000384C
5 mL transport tubePhenixTT-3205
50 mL Centrifuge tubeCrystalgen 23-2263
15 mL Centrifuge tubeCrystalgen 23-2266
eLine electronic pipetteSartorius730391
Microfuge centrifuge Beckman CoulterA46474
OHAUS balance  Kennedy Scales, inc.735
Vortex mixer Bernstead ThermolyneM16715

Riferimenti

  1. Dalle-Donne, I., Rossi, R., Colombo, R., Giustarini, D., Milzani, A. Biomarkers of oxidative damage in human disease. Clin. Chem. 52 (4), 601-623 (2006).
  2. Pacher, P., Beckman, J. S., Liaudet, L. Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease. Physiol. Rev. 87 (1), 315-424 (2007).
  3. Baraldi, E., et al. 3-Nitrotyrosine, a marker of nitrosative stress, is increased in breath condensate of allergic asthmatic children. Allergy. 61 (1), 90-96 (2006).
  4. Ischiropoulos, H., Beckman, J. S. Oxidative stress and nitration in neurodegeneration: Cause, effect, or association?. J. Clin. Invest. 111 (2), 163-169 (2003).
  5. Butterfield, D. A., et al. Elevated levels of 3-nitrotyrosine in brain from subjects with amnestic mild cognitive impairment: implications for the role of nitration in the progression of Alzheimer's disease. Brain Res. 1148, 243-248 (2007).
  6. Hui, Y., et al. A simple and robust LC-MS/MS method for quantification of free 3-nitrotyrosine in human plasma from patients receiving on-pump CABG surgery. Electrophoresis. 33 (4), 697-704 (2012).
  7. Kato, Y., et al. Quantification of modified tyrosines in healthy and diabetic human urine using liquid chromatography/tandem mass spectrometry. J. Clin. Biochem. Nutr. 44 (1), 67-78 (2009).
  8. Duncan, M. W. A review of approaches to the analysis of 3-nitrotyrosine. Amino acids. 25 (3-4), 351-361 (2003).
  9. Ryberg, H., Caidahl, K. Chromatographic and mass spectrometric methods for quantitative determination of 3-nitrotyrosine in biological samples and their application to human samples. J. Chromatogr. B. 851 (1-2), 160-171 (2007).
  10. Tsikas, D. Analytical methods for 3-nitrotyrosine quantification in biological samples: the unique role of tandem mass spectrometry. Amino acids. 42 (1), 45-63 (2012).
  11. Tsikas, D., Duncan, M. W. Mass spectrometry and 3-nitrotyrosine: strategies, controversies, and our current perspective. Mass Spectrom. Rev. 33 (4), 237-276 (2014).
  12. Iwasaki, Y., et al. Comparison of fluorescence reagents for simultaneous determination of hydroxylated phenylalanine and nitrated tyrosine by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection. Biomed. Chromatogr. 26 (1), 41-50 (2012).
  13. Saravanabhavan, G., Blais, E., Vincent, R., Kumarathasan, P. A high performance liquid chromatography-electrochemical array method for the measurement of oxidative/nitrative changes in human urine. J. Chromatogr. A. 1217 (19), 3269-3274 (2010).
  14. Mergola, L., Scorrano, S., Del Sole, ., Lazzoi, R., R, M., Vasapollo, G. Developments in the synthesis of a water compatible molecularly imprinted polymer as artificial receptor for detection of 3-nitro-L-tyrosine in neurological diseases. Biosens. Bioelectron. 40 (1), 336-341 (2013).
  15. Schwedhelm, E., Tsikas, D., Gutzki, F. M., Frolich, J. C. Gas chromatographic-tandem mass spectrometric quantification of free 3-nitrotyrosine in human plasma at the basal state. Anal. Biochem. 276 (2), 195-203 (1999).
  16. Tsikas, D., Mitschke, A., Suchy, M. T., Gutzki, F. M., Stichtenoth, D. O. Determination of 3-nitrotyrosine in human urine at the basal state by gas chromatography-tandem mass spectrometry and evaluation of the excretion after oral intake. J. Chromatogr. B. 827 (1), 146-156 (2005).
  17. Marvin, L. F., et al. Quantification of o,o'-dityrosine, o-nitrotyrosine, and o-tyrosine in cat urine samples by LC/electrospray ionization-MS/MS using isotope dilution. Anal. Chem. 75 (2), 261-267 (2003).
  18. Orhan, H., Vermeulen, N. P., Tump, C., Zappey, H., Meerman, J. H. Simultaneous determination of tyrosine, phenylalanine and deoxyguanosine oxidation products by liquid chromatography-tandem mass spectrometry as non-invasive biomarkers for oxidative damage. J. Chromatogr. B. 799 (2), 245-254 (2004).
  19. Chen, H. J. C., Chiu, W. L. Simultaneous detection and quantification of 3-nitrotyrosine and 3-bromotyrosine in human urine by stable isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry. Toxicol. Lett. 181 (1), 31-39 (2008).
  20. Marc, D. T., Ailts, J. W., Campeau, D. C. A., Bull, M. J., Olson, K. L. Neurotransmitters excreted in the urine as biomarkers of nervous system activity: validity and clinical applicability. Neurosci. Biobehav. Rev. 35 (3), 635-644 (2011).
  21. Li, X. G., Li, S., Wynveen, P., Mork, K., Kellermann, G. Development and validation of a specific and sensitive LC-MS/MS method for quantification of urinary catecholamines and application in biological variation studies. Anal. Bioanal. Chem. 406 (28), 7287-7297 (2014).
  22. Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. Pre-analytical and analytical validations and clinical applications of a miniaturized, simple and cost-effective solid phase extraction combined with LC-MS/MS for the simultaneous determination of catecholamines and metanephrines in spot urine samples. Talanta. 159, 238-247 (2016).
  23. Chao, M. R., et al. Simultaneous detection of 3-nitrotyrosine and 3-nitro-4-hydroxyphenylacetic acid in human urine by online SPE LC-MS/MS and their association with oxidative and methylated DNA lesions. Chem. Res. Toxicol. 28 (5), 997-1006 (2015).
  24. Radabaugh, M. R., Nemirovskiy, O. V., Misko, T. P., Aggarwal, P., Mathews, W. R. Immunoaffinity liquid chromatography-tandem mass spectrometry detection of nitrotyrosine in biological fluids development of a clinically translatable biomarker. Anal. Biochem. 380 (1), 68-76 (2008).
  25. Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. Tailored 96-well µElution solid-phase extraction combined with UFLC-MS/MS: a significantly improved approach for determination of free 3-nitrotyrosine in human urine. Anal. Bioanal. Chem. 407 (25), 7703-7712 (2015).
  26. . Roche Creatinine Jaffé Gen.2, package insert 2011-11, V7 Available from: https://usdiagnostics.roche.com/products/06407137190/PARAM2083/overlay.html (2011)
  27. Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. A novel mixed-mode solid phase extraction coupled with LC-MS/MS for the re-evaluation of free 3-nitrotyrosine in human plasma as an oxidative stress biomarker. Talanta. 140, 45-51 (2015).
  28. Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. An integrated liquid chromatography-tandem mass spectrometry approach for the ultra-sensitive determination of catecholamines in human peripheral blood mononuclear cells to assess neural-immune communication. J. Chromatogr. A. 1449, 54-61 (2016).

Ristampe e Autorizzazioni

Richiedi autorizzazione per utilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi Autorizzazione

Esplora altri articoli

LC MS MSestrazione a fase solida SPEbiomarker non invasivostress ossidativourinasensibilitselettivit chimicanumero 1253 Nitrotirosina 3 NT

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Riservatezza

Condizioni di utilizzo

Politiche

Contattaci

SUGGERISCI JOVE ALLA BIBLIOTECA

Newsletter di JoVE

Ricerca

Didattica

Autori

Personale delle biblioteche

CHI SIAMO

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati