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  • Divulgaciones
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  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Este protocolo proporciona un análisis de las subpoblaciones de macrófagos en el sistema nervioso central del ratón adulto mediante citometría de flujo y es útil para el estudio de múltiples marcadores expresados ​​por estas células.

Resumen

Numerosos estudios han demostrado el papel de las células inmunitarias, en particular los macrófagos, en las patologías del sistema nervioso central (SNC). Existen dos poblaciones principales de macrófagos en el SNC: (i) la microglia, que son los macrófagos residentes del SNC y se derivan de progenitores del saco vitelino durante la embriogénesis, y (ii) los macrófagos derivados de monocitos (MDM), que pueden infiltrarse El SNC durante la enfermedad y se derivan de progenitores de médula ósea. Los roles de cada subpoblación de macrófagos difieren dependiendo de la patología que se estudia. Además, no hay consenso sobre los marcadores histológicos o los criterios distintivos utilizados para estas subpoblaciones de macrófagos. Sin embargo, el análisis de los perfiles de expresión de los marcadores CD11b y CD45 mediante citometría de flujo nos permite distinguir la microglia (CD11b + CD45 med ) del MDM (CD11b + CD45 alto ). En este protocolo, mostramos que la centrifugación de gradiente de densidadY el análisis de citometría de flujo se puede utilizar para caracterizar estas subpoblaciones de macrófagos del SNC, y para estudiar varios marcadores de interés expresados ​​por estas células como hemos publicado recientemente. Por lo tanto, esta técnica puede ampliar nuestra comprensión de la función de los macrófagos en ratones modelos de enfermedades neurológicas y también se puede utilizar para evaluar los efectos de los medicamentos sobre estas células.

Introducción

Los microglios son los macrófagos residentes en el tejido parenquimatoso del sistema nervioso central (SNC). Ellos juegan dos funciones funcionales clave: la defensa inmune y el mantenimiento de la homeostasis del SNC. En contraste con el MDM, que se renuevan continuamente de las células madre hematopoyéticas en la médula ósea, las células microgliales se diferencian de las células progenitoras hematopoyéticas primitivas originadas en el saco vitelino (YS) que colonizaron el cerebro durante el desarrollo embrionario 1 , 2 , 3 . En los roedores, el factor de transcripción Myb desempeña un papel crucial en el desarrollo de todos los monocitos y macrófagos derivados de la médula ósea, pero para la microglia derivada de YS, este factor es dispensable y la diferenciación sigue dependiendo del factor de transcripción PU.1 4 .

En el SNC sano, microglia son células dinámicas que constantemente muestrean su ambiente, scaY detección de patógenos invasores o daño tisular 5 . La detección de tales señales inicia un camino para resolver la lesión. La microglia cambia rápidamente de una morfología ramificada a una ameboidea, seguida de fagocitosis y liberación de diversos mediadores, tales como citoquinas pro- o antiinflamatorias. Así, dependiendo de su microambiente, microglia activado puede adquirir un espectro de diferentes estados de cebado [ 6] .

La microglia afecta profundamente el desarrollo y progresión de muchos trastornos neurológicos. En los modelos de roedores de la enfermedad de Alzheimer (EA) 7 , la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) 8 , la esclerosis múltiple (EM) 9 o la enfermedad de Parkinson (PD) 10 , se demuestra que la microglia desempeña un doble papel, induciendo neurotoxicidad perjudicial o actuando De una manera neuroprotectora, que depende deN la enfermedad específica, la etapa de la enfermedad y si la enfermedad estaba influenciada por el compartimento inmunológico sistémico 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . La mayoría de las lesiones del SNC observadas en las enfermedades citadas anteriormente contienen una población heterogénea de células mieloides, incluyendo no sólo microglia parenquimatosa, sino también macrófagos perivasculares y meníngeos, así como MDM infiltrante al SNC. Estos tipos de células pueden contribuir de forma diferencial a los mecanismos fisiopatológicos relacionados con la lesión y la reparación 7 , 12 , 13 , 14 , 15 . El desafío actual para los investigadores que estudian estos modelos de enfermedad es establecer si los monocitos periféricos y los macrófagos se infiltran en el SNC y, en caso afirmativo, distAngustia la microglia residente de estas células. De hecho, las células microgliales son muy plásticas; Cuando se activan, las microglias vuelven a expresar los marcadores que suelen expresarse por monocitos periféricos y macrófagos. La cuestión, por lo tanto, se basa en la identificación de marcadores que pueden distinguir la microglia residente de los monocitos infiltrados y macrófagos.

La discriminación de estas poblaciones sobre rodajas de cerebro por aplicaciones inmunohistológicas es limitada debido a la falta de anticuerpos específicos. Sin embargo, el análisis de citometría de flujo es una técnica eficiente para evaluar la expresión de varios marcadores y para distinguir las poblaciones celulares (por ejemplo, linfocitos, macrófagos MDM CD11b + CD45 alto y microglia CD11b + CD45 med ), así como las subpoblaciones celulares 16 , 17 , 18 . Este protocolo describe los procedimientos para aislar elCélulas mononucleares del SNC de ratón en modelos de enfermedad neurológica utilizando una disociación enzimática optimizada de tejido y una centrifugación de gradiente de densidad; Así como un método para diferenciar las poblaciones de microglia y MDM en el SNC mediante citometría de flujo.

Otra aproximación es eliminar la mielina y purificar las células usando perlas magnéticas conjugadas con anticuerpos específicos 19 , 20 , 21 . La eliminación de mielina utilizando perlas magnéticas anti-mielina es más caro y afecta a la viabilidad y el rendimiento de las células aisladas [ 22] . Esta etapa y la siguiente separación inmunomagnética de la microglia, limitan los estudios adicionales de las poblaciones específicas de células inmunes 21 , 22 .

Estos procedimientos proporcionan una manera fácil de estudiar las subpoblaciones de macrófagos en el desarrollo de la enfermedad, yPara determinar los efectos de los fármacos o modificaciones genéticas en fenotipos de macrófagos y estados de activación.

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Protocolo

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en el Instituto ICM y por el Comité de Ética Animal de Darwin y están cubiertos por el protocolo 01407.02.

1. Preparación

  1. Preparar el cóctel de digestión en un tubo de 1,5 ml combinando lo siguiente para cada ratón: 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS); 123 mu l de enzima de digestión (ver tabla de materiales) a 13 wunsch / mL (solución madre), concentración final 1,6 wunsch / mL; Y 5 μl de DNasa I (ver tabla de materiales) a 100 mg / ml (solución madre), concentración final 0,5 mg / ml.

2. Perfusión y disección

  1. Euthanize los ratones con una dosis letal de pentobarbital (100 μ l a 400 mg / ml).
  2. Coloque al animal en decúbito supino y humedezca el cuerpo con etanol al 70%.
  3. Corte la piel ventral con unas tijeras finas justo debajo del proceso xifoide para exponer el cavit torácicoY.
  4. Hacer una incisión en el diafragma y cortar los aspectos laterales de la caja torácica con tijeras finas en una dirección caudal a rostral para exponer el corazón (y evitar el corte de otros órganos). Identificar el ventrículo izquierdo (LV) y la aurícula derecha (RA).
  5. Inserte un catéter de mariposa con una aguja de 25 G dentro del LV. Hacer una incisión en la RA con tijeras finas y al comienzo del flujo sanguíneo, iniciar la perfusión a 10 ml / min de flujo a través del LV con 20 ml de PBS para eliminar las células y la sangre de los vasos; La perfusión exitosa se observa por el blanqueamiento de los pulmones y el hígado a medida que la sangre se desplaza.
  6. Decapitar al animal con tijeras medianas. Disecar la columna vertebral con tijera fina y separarla del cuerpo mediante la excisión de la musculatura de la pared abdominal en el lado ventral de la columna vertebral y cortando la columna vertebral en la base de la cola.
  7. Inserte una jeringa de 10 ml que contenga PBS y una punta de pipeta montada de 200 μL en el lado lumbar deLa columna vertebral y enjuague la médula espinal en el lado cervical.
    NOTA: La punta de la pipeta de 200 μL se corta con tijeras en su extremo más ancho (aproximadamente 1 cm) y se inserta firmemente en una jeringa de 10 ml previamente llena de PBS.
  8. Retire la piel por encima del cráneo y use fórceps para exponer el cerebro. Insertar una hoja de tijera en la base del cráneo y cortar el cráneo después de la sutura sagital. Inserte una pinza pequeña en el corte y suavemente levante el cráneo. Diseccionar el cerebro de la cabeza del ratón y quitar el bulbo olfatorio y el cerebelo.
  9. Recoger el cerebro y la médula espinal en un tubo de 1,5 ml que contiene 1,128 ml de PBS con cóctel de digestión (de la etapa 1.1).

3. Disociación de células

  1. Corte finamente el cerebro y la médula espinal en el tubo de 1,5 ml (paso 2.9) en 1-2 mm 3 piezas con tijeras pequeñas ( Figura 1 ).
  2. Incubar el tubo de 1,5 ml que contiene los tejidos picados durante 30 min en una incubadoraA 37 ° C con 5% de CO 2 .
    NOTA: Prepare el gradiente de densidad en este paso.
  3. Añadir 20 μL de EDTA 0,5 M (solución madre), concentración final 10 mM, al tubo de 1,5 ml para detener la reacción enzimática.
  4. Hacer suavemente una suspensión de células pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 5 ml.
  5. Pasar la suspensión celular a través de una malla de nylon (tamaño de poro de 70 μm) en un tubo de 50 ml usando el émbolo de una jeringa de 10 ml.
  6. Lavar la malla de nylon con 20 ml de suero bovino fetal al 5% (FBS) -PBS.
  7. Centrifugar durante 7 min (300 xg) a temperatura ambiente (18 ° C). Desechar el sobrenadante por aspiración y pasar al siguiente paso. Tenga mucho cuidado al retirar el sobrenadante; No perturbe el gránulo, que puede ser aspirado fácilmente por la pipeta de aspiración.

4. Gradiente de densidad

  1. Preparar una solución madre del medio de gradiente de densidad añadiendo la cantidad apropiada de 10x PBS al medio de gradiente de densidad.
    NOTA: Agregue una parte 10X PBS a nueve densidad de gradiente de densidad de piezas.
  2. Diluir el medio de gradiente de densidad de reserva con 1x PBS para los diferentes porcentajes como se describe en la Tabla 1 .
  3. Resuspender el gránulo (del paso 3.7) con 4 ml de medio de gradiente de densidad al 30% y transferir a un tubo de 15 ml.
  4. Coloque una pipeta Pasteur en el fondo del tubo de 15 mL y lentamente subyacente 4 mL de medio de gradiente de densidad al 37%.
  5. Añadir 4 ml de medio de gradiente de densidad al 70%, como se ha descrito anteriormente.
  6. Centrifugar el gradiente durante 40 min (800 xg) a temperatura ambiente (18ºC). Asegúrese de que la centrífuga se detiene con un mínimo o ningún freno para que la interfase no se altere.
    NOTA: El tubo aparecerá estratificado. Las células acodadas en la interfase del gradiente de densidad del 70% al 37% son las células inmunes mononucleadas (subpoblaciones de microglia y macrófagos); Los niveles superiores son restos celulares y mielina, respectivamente ( Figura 2 ).
  7. Con una pipeta de transferencia, retire suavemente la capa de mielina.
  8. Recoger 3-4 mL de la interfase de gradiente de densidad 70-37% que contiene las células de las subpoblaciones de macrófagos en un tubo limpio de 15 mL.
  9. Lavar las células 3x con PBS, volumen total de 15 mL. Asegúrese de que el medio de gradiente de densidad que contiene las células se diluye al menos tres veces con PBS y se centrifuga durante 7 min (500 xg, 4 ° C) con el freno encendido.
  10. Resuspender el sedimento de células con 1 mL de PBS para el marcaje celular o para otros ensayos funcionales.

5. Etiquetado de células para citometría de flujo

  1. Transferir las células (paso 4.10) en un tubo de citometría de flujo.
  2. Añadir 1 μl de reactivo de tinción de células muertas fijables a cada muestra de células obtenida en el paso 4.10. Incubar durante 30 minutos en hielo, protegido de la luz.
  3. Lavar las células una vez con 2 ml de PBS y centrifugar durante 5 min (300 xg, 4 ° C).
  4. Retirar el sobrenadante, y resuspender el sedimento celular con400 mu l de PBS 1% de BSA, 0,1% de azida.
  5. Añadir 1 μg de anticuerpos CD16 / CD32 a 100 μl de las células para bloquear los receptores Fc. Incubar 10-15 min en hielo, protegido de la luz.
  6. Preparar la mezcla de anticuerpos primarios en PBS 1% de BSA, 0,1% de azida o PBS 1% de BSA, 0,1% de azida, 0,25% de saponina, para la permeabilización celular para la tinción intracelular.
  7. Añadir 100 μL de anticuerpos primarios mezclar (2x) e incubar durante 30 minutos en hielo, protegido de la luz.
    NOTA: Todos los anticuerpos deben ser titulados antes de realizar el experimento para asegurar resultados óptimos.
  8. Lavar las células con 2 ml de PBS y centrifugar durante 5 min (300 xg, 4 ° C). Repita este paso tres veces.
  9. Añadir 100 μl de un anticuerpo secundario si los anticuerpos primarios no están directamente conjugados con un fluoróforo, e incubar durante 30 minutos en hielo, protegido de la luz.
  10. Lavar las células con 2 ml de PBS y centrifugar durante 5 min a 300 xg a 4 ° C). Repita este paso tres veces.
  11. Arregla elCon 100 μl de PFA al 1% durante 15 minutos a temperatura ambiente, protegido de la luz.
    NOTA: Precaución: El PFA es tóxico. Utilizar en una campana extractora y usar equipo de protección personal.
  12. Lavar las células con 2 ml de PBS y centrifugar durante 5 min a 300 xg a 4 ° C. Repita este paso tres veces.
  13. Resuspender el sedimento de células con 200 μ l de PBS y proceder a la citometría de flujo de adquisición y análisis. Siga la estrategia de apertura en la Figura 3 .

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Resultados

Después de la centrifugación de gradiente de densidad y tinción de anticuerpos, las células se adquirieron en un citómetro de flujo y se analizaron usando una estrategia de bloqueo morfológico como sigue. Se definió una primera puerta en la zona de dispersión hacia delante (FSC-A) de trama de puntos frente a la altura dispersada hacia delante (FSC-H) para discriminar células individuales de dobletes ( figura 3A ). Las células individuales ...

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Discusión

Se ha demostrado que la microglia y el MDM tienen funciones y fenotipos diferentes en el SNC, por lo que la identificación y el análisis de estas subpoblaciones de macrófagos son esenciales para comprender mejor las enfermedades neurológicas 9 , 18 , 25 . El análisis de citometría de flujo utilizando dos marcadores (CD11b y CD45) permite distinguir entre cada subpoblación ( Figura 3C ). Esta...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Agencia Nacional para la Investigación (ANR-12-MALZ-0003-02-P2X7RAD), Association France Alzheimer y Bpifrance. Nuestro laboratorio cuenta también con el apoyo del Inserm, el CNRS, la Universidad Pierre et Marie-Curie y el programa "Investissements d'avenir" ANR-10-IAIHU-06 (IHU-A-ICM). Quisiéramos agradecer la ayuda del centro de cultivo celular CELIS.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
5 month-old MiceJanvierC57BL/6J
Liberase TL Research GradeSigma-Aldrich5401020001Digestion enzyme
Deoxyribonuclease I from bovine pancreasSigma-AldrichDN25
PercollGE Healthcare Life Sciences17-0891-01Density gradient medium
Cell Strainer size 70 µm NylonCorning731751
Venofix 25 GBRAUN4056370
Piston syringe 10 mLTerumoSS+10ES1
Pasteur pipette 230 mmDustcher20420
1.5 mL tubeEppendorf0030 123.328
15 mL tubeTPP91015
50 mL tubeTPP91050
5 mL polystyrene round bottom tubeBD Falcon352054
D-PBS (1x) without Ca2+/Mg2+Thermo Fisher Scientific14190-094
D-PBS (10x) without Ca2+/Mg2+Thermo Fisher Scientific14200-067
Fetal bovine serumThermo Fisher Scientific10270-106
EDTASigma-AldrichE4884
Bovine Serum Albumin solution 30%Sigma-AldrichA7284
Paraformaldehyde 32% SolutionElectron Microscopy Sciences15714-SCaution -Toxic
SaponinSigma-AldrichS2002
Sodium AzideSigma-Aldrich47036
PerCPCy5.5 Rat anti-mouse CD11b (clone M1/70)eBioscience45-0112
Rat IgG2b K Isotype Control PerCP-Cyanine5.5eBioscience45-4031
BV421 Rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11)BD Biosciences563890
BV421 Rat IgG2b, κ Isotype Control RUOBD Biosciences562603
Rabbit anti-mouse TMEM119 (clone28 - 3)Abcamab209064
AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgGLife TechnologiesA31573
Anti-Mouse CD16/CD32 PurifiedeBioscience14-0161Mouse Fc Block
Fixable Dead Cell Stain KitsInvitrogenL34969
Mouse CCR2 APC-conjugated AntibodyR&DFAB5538A
Rat IgG2B APC-conjugated Isotype ControlR&DIC013A
Mouse CX3CR1 PE-conjugated AntibodyR&DFAB5825P
Goat IgG PE-conjugated AntibodyR&DIC108P
CentrifugeEppendorf5804R
Cell analyzerBD BiosciencesBD FACSVERSE
Data Analysis SoftwareFlowJo LLCFlowJo
Fine scissorsF.S.T14090-11
Standard Pattern ForcepsF.S.T11000-13
Mayo ScissorsF.S.T14010-15
Dumont #5 ForcepsF.S.T11251-20

Referencias

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