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Resumo

Este protocolo fornece uma análise das subpopulações de macrófagos no sistema nervoso central do mouse adulto por citometria de fluxo e é útil para o estudo de marcadores múltiplos expressos por essas células.

Resumo

Numerosos estudos demonstraram o papel das células imunes, em particular dos macrófagos, nas patologias do sistema nervoso central (SNC). Existem duas populações principais de macrófagos no SNC: (i) a microglia, que são os macrófagos residentes do SNC e são derivadas de progenitores do saco vitelino durante a embriogênese, e (ii) os macrófagos derivados de monócitos (MDM), que podem infiltrar-se O SNC durante a doença e são derivados de progenitores da medula óssea. Os papéis de cada subpopulação de macrófagos diferem dependendo da patologia em estudo. Além disso, não há consenso sobre os marcadores histológicos ou os critérios distintivos utilizados para essas subpopulações de macrófagos. No entanto, a análise dos perfis de expressão dos marcadores CD11b e CD45 por citometria de fluxo nos permite distinguir a microglia (CD11b + CD45 med ) do MDM (CD11b + CD45 alta ). Neste protocolo, mostramos que a centrifugação com gradiente de densidadeE a análise de citometria de fluxo pode ser usada para caracterizar essas subpopulações de macrófagos do SNC e para estudar vários marcadores de interesse expressados ​​por essas células como publicamos recentemente. Assim, esta técnica pode aprofundar a nossa compreensão do papel dos macrófagos em modelos de ratos de doenças neurológicas e também pode ser usada para avaliar os efeitos de drogas nessas células.

Introdução

A microglia são os macrófagos residuais do tecido parenquimatoso do sistema nervoso central (SNC). Eles desempenham dois principais papéis funcionais: defesa imune e manutenção da homeostase do SNC. Em contraste com o MDM, que são renovados continuamente a partir das células estaminais hematopoiéticas na medula óssea, as células microgliais se diferenciam das células progenitoras hematopoiéticas primitivas originadas no saco vitelino (YS) que colonizaram o cérebro durante o desenvolvimento embrionário 1 , 2 , 3 . Em roedores, o fator de transcrição Myb desempenha um papel crucial no desenvolvimento de todos os monócitos e macrófagos derivados da medula óssea, mas para a microglia derivada de YS, esse fator é dispensável e a diferenciação continua dependente do fator de transcrição PU.1 4 .

No SNC saudável, a microglia é uma célula dinâmica que provoca constantemente o seu ambiente, a scaLevantamento e levantamento de patógenos invasores ou danos nos tecidos 5 . A detecção de tais sinais inicia um caminho para resolver a lesão. A microglia passa rapidamente de uma morfologia ramificada a uma amebaide, que é seguida de fagocitose e liberação de vários mediadores, como citoquinas pró ou anti-inflamatórias. Assim, dependendo do seu microambiente, a microglia ativada pode adquirir um espectro de estados de iniciação distintos 6 .

A microglia afeta profundamente o desenvolvimento e a progressão de muitos distúrbios neurológicos. Nos modelos de roedores da doença de Alzheimer (AD) 7 , esclerose lateral amiotrófica (ALS) 8 , esclerose múltipla (MS) 9 ou doença de Parkinson (PD) 10 , a microglia mostra um duplo papel, induzindo neurotoxicidade prejudicial ou agindo De forma neuroprotetiva, dependente deN a doença específica, o estágio da doença e se a doença foi influenciada pelo compartimento imune sistêmico 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . A maioria das lesões do SNC observadas nas doenças citadas acima contém uma população heterogênea de células mieloides, incluindo não apenas microglia parenquimatosa, mas também macrófagos perivasculares e meníngeos, bem como MDM infiltrante do SNC. Estes tipos de células podem contribuir diferencialmente para os mecanismos fisiopatológicos relacionados à lesão e reparação 7 , 12 , 13 , 14 , 15 . O desafio atual para os investigadores que estão estudando esses modelos de doenças é estabelecer se os monócitos periféricos e os macrófagos se infiltram no SNC e, em caso afirmativo, distriamChateie a microglia residente dessas células. Na verdade, as células microgliais são muito plásticas; Quando são ativados, os marcadores de re-expressões de microglia geralmente são expressos por monócitos e macrófagos periféricos. A questão, portanto, se baseia na identificação de marcadores que podem distinguir a microglia residente dos monócitos e macrófagos infiltrantes.

A discriminação dessas populações em fatias cerebrais por aplicações imuno-histológicas é limitada devido à falta de anticorpos específicos. No entanto, a análise de citometria de fluxo é uma técnica eficiente para avaliar a expressão de vários marcadores e para distinguir as populações celulares (por exemplo, linfócitos, macrófagos / MDM CD11b + CD45 alto e microglia CD11b + CD45 med ), bem como subpopulações celulares 16 , 17 , 18 . Este protocolo descreve os procedimentos para isolar oCélulas mononucleares do SNC de ratinho em modelos de doenças neurológicas usando uma dissociação de tecido enzimático otimizado e uma centrifugação com gradiente de densidade; Bem como, um método para diferenciar as populações de microglia e MDM no SNC usando citometria de fluxo.

Outra abordagem é eliminar a mielina e purificar as células usando esferas magnéticas conjugadas com anticorpos específicos 19 , 20 , 21 . A remoção de mielina usando esferas magnéticas anti-mielina é mais dispendiosa e afeta a viabilidade e o rendimento de células isoladas 22 . Este passo e a seguinte separação imunomagnética da microglia, limitam estudos adicionais de populações específicas de células imunes 21 , 22 .

Esses procedimentos fornecem uma maneira fácil de estudar as subpopulações dos macrófagos no desenvolvimento da doença ePara determinar os efeitos de medicamentos ou modificações de genes em fenótipos de macrófagos e estados de ativação.

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Protocolo

Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso Animal no Instituto ICM e pelo Comitê de Ética Francesa Darwin, e estão cobertos pelo protocolo 01407.02.

1. Preparação

  1. Prepare o cocktail de digestão em um tubo de 1,5 mL, combinando o seguinte para cada mouse: 1 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS); 123 μL de enzima de digestão (ver tabela de materiais) a 13 wunsch / mL (solução de reserva), concentração final 1,6 wunsch / mL; E 5 μL de DNase I (ver tabela de materiais) a 100 mg / mL (solução de reserva), concentração final 0,5 mg / mL.

2. Perfusão e dissecação

  1. Eutanizar os ratos com uma dose letal de pentobarbital (100 μL a 400 mg / mL).
  2. Coloque o animal na posição supina e molhe o corpo com 70% de etanol.
  3. Corte a pele ventral com tesoura fina logo abaixo do processo xifóide para expor a cavitação torácicaY.
  4. Faça uma incisão no diafragma e corte os aspectos laterais da caixa torácica com tesoura fina numa direção caudal a rostral para expor o coração (e evitar o corte de outros órgãos). Identifique o ventrículo esquerdo (LV) eo átrio direito (RA).
  5. Insira um cateter de borboleta com uma agulha de 25 G dentro do LV. Faça uma incisão na RA com tesoura fina e no início do fluxo sanguíneo, comece a perfusão a uma taxa de fluxo de 10 mL / min através do LV com 20 mL de PBS para remover células e sangue dos vasos; A perfusão bem sucedida é notada pelo branqueamento dos pulmões e pelo fígado à medida que o sangue é deslocado.
  6. Decapite o animal com uma tesoura média. Dissecar a coluna vertebral com tesoura fina e separá-la do corpo excitando a musculatura da parede abdominal no lado ventral da coluna vertebral e cortando a coluna vertebral na base da cauda.
  7. Insira uma seringa de 10 mL contendo PBS e uma ponta de pipeta montada de 200 μL no lado lombar deNa coluna vertebral e liberar a medula espinhal no lado cervical.
    NOTA: A ponta de pipeta de 200 μL é cortada com tesoura em sua extremidade mais larga (aproximadamente 1 cm) e firmemente inserida em uma seringa de 10 mL previamente preenchida com PBS.
  8. Remova a pele acima do crânio e use fórceps para expor o cérebro. Insira uma lâmina de tesoura na base do crânio e corte o crânio seguindo a sutura sagital. Insira pinças pequenas no corte e levante suavemente o crânio. Dissecte o cérebro da cabeça do mouse e remova o bulbo olfatório e o cerebelo.
  9. Recolher o cérebro ea medula espinhal em um tubo de 1,5 mL contendo 1.128 mL de PBS com cocktail de digestão (do passo 1.1).

3. Dissociação celular

  1. Corte finamente o cérebro e a medula espinhal no tubo de 1,5 mL (passo 2.9) em 1-2 mm 3 com pequenas tesouras ( Figura 1 ).
  2. Incubar o tubo de 1,5 mL contendo os tecidos triturados durante 30 min em uma incubaA 37 ° C com 5% de CO 2 .
    NOTA: Prepare o gradiente de densidade nesta etapa.
  3. Adicione 20 μL de EDTA 0,5 M (solução de reserva), concentração final de 10 mM, no tubo de 1,5 mL para parar a reação enzimática.
  4. Gentilmente faça uma suspensão de células por pipetagem para cima e para baixo com uma pipeta de 5 mL.
  5. Passe a suspensão celular através de uma malha de nylon (tamanho de poro de 70 μm) em um tubo de 50 mL usando o êmbolo de uma seringa de 10 mL.
  6. Lavar a malha de nylon com 20 mL de soro bovino fetal a 5% (FBS) -PBS.
  7. Centrífuga por 7 min (300 xg) à temperatura ambiente (18 ° C). Descarte o sobrenadante por aspiração e avance para o próximo passo. Seja extremamente cuidadoso ao remover o sobrenadante; Não perturbe o sedimento, que pode ser facilmente aspirado pela pipeta de aspiração.

4. Gradiente de densidade

  1. Prepare uma solução-mãe do meio de gradiente de densidade adicionando a quantidade apropriada de PBS 10x ao meio de gradiente de densidade.
    NOTA: Adicione uma peça de 10X PBS a meio de gradiente de densidade de nove partes.
  2. Diluir o meio de gradiente de densidade de estoque com 1x PBS para as diferentes porcentagens como descrito na Tabela 1 .
  3. Ressuspender a pastilha (do passo 3.7) com 4 mL de meio de gradiente de densidade a 30% e transferir para um tubo de 15 mL.
  4. Coloque uma pipeta Pasteur na parte inferior do tubo de 15 mL e aplique lentamente 4 mL de meio gradiente de densidade a 37%.
  5. Adicione 4 mL de meio de gradiente de densidade a 70%, como descrito acima.
  6. Centrifugue o gradiente por 40 min (800 xg) à temperatura ambiente (18 ° C). Certifique-se de que a centrífuga pára com um freio mínimo ou nenhum, de modo que a interfase não seja perturbada.
    NOTA: O tubo aparecerá estratificado. As células em camadas na interface de gradiente de densidade de 70% a 37% são as células imunes mononucleadas (subpopulações de microglia e macrófagos); Os níveis superiores são detritos celulares e mielina, respectivamente ( Figura 2 ).
  7. Usando uma pipeta de transferência, remova suavemente a camada de mielina.
  8. Coletar 3-4 mL da interfase de gradiente de densidade de 70-37% contendo as células das subpopulações de macrófagos em um tubo limpo de 15 mL.
  9. Lave as células 3x com PBS, volume total de 15 mL. Certifique-se de que o meio de gradiente de densidade que contém as células é diluído pelo menos três vezes com PBS e centrifugação por 7 minutos (500 xg, 4 ° C) com o freio "ligado".
  10. Ressuspender o sedimento celular com 1 mL de PBS para rotulagem celular ou para outros ensaios funcionais.

5. Etiquetado de células para a citometria de fluxo

  1. Transfira as células (passo 4.10) para um tubo de citometria de fluxo.
  2. Adicione 1 μL de reagente de mancha de células mortas fixável a cada amostra celular obtida no passo 4.10. Incube durante 30 min no gelo, protegido da luz.
  3. Lavar as células uma vez com 2 mL de PBS e centrifugar por 5 min (300 xg, 4 ° C).
  4. Remova o sobrenadante e ressuspenda o sedimento celular com400 μL de PBS 1% de BSA, 0,1% de azida.
  5. Adicione 1 μg de anticorpos CD16 / CD32 a 100 μL das células para bloquear os receptores Fc. Incube 10-15 minutos no gelo, protegido da luz.
  6. Prepare a mistura de anticorpo primário em PBS 1% de BSA, 0,1% de azida ou PBS 1% de BSA, 0,1% de azida, 0,25% de saponina, para permeabilização celular para coloração intracelular.
  7. Adicione 100 μL de mistura de anticorpos primários (2x) e incube durante 30 min em gelo, protegido da luz.
    NOTA: Todos os anticorpos devem ser titulados antes de realizar a experiência para garantir ótimos resultados.
  8. Lavar as células com 2 mL de PBS e centrifugar por 5 minutos (300 xg, 4 ° C). Repita este passo três vezes.
  9. Adicionar 100 μL de um anticorpo secundário se os anticorpos primários não estiverem diretamente conjugados com um fluoróforo e incubar durante 30 minutos em gelo, protegido da luz.
  10. Lavar as células com 2 mL de PBS e centrifugar durante 5 min a 300 xg a 4 ° C). Repita este passo três vezes.
  11. Conserte oCélulas com 100 μL de PFA a 1% durante 15 min a temperatura ambiente, protegidas da luz.
    NOTA: Atenção: o PFA é tóxico. Use em uma chaminé e use equipamento de proteção pessoal.
  12. Lavar as células com 2 mL de PBS e centrifugar durante 5 min a 300 xg a 4 ° C. Repita este passo três vezes.
  13. Ressuspender o sedimento celular com 200 μL de PBS e proceder à aquisição e análise de citometria de fluxo. Siga a estratégia de bloqueio na Figura 3 .

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Resultados

Após a centrifugação em gradiente de densidade e coloração de anticorpos, as células foram adquiridas em um citómetro de fluxo e analisadas utilizando uma estratégia de bloqueio morfológico como se segue. Um primeiro portão foi definido no quadro de pontos Forward-Scattered-Area (FSC-A) versus Forward-Scattered-Height (FSC-H) para discriminar células individuais de dupletos ( Figura 3A ). As células únicas foram então fechadas em FSC-A...

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Discussão

Demonstrou-se que a microglia eo MDM têm diferentes funções e fenótipos no SNC e, portanto, a identificação e análise dessas subpopulações de macrófagos são essenciais para melhor compreender as doenças neurológicas 9 , 18 , 25 . A análise de citometria de fluxo usando dois marcadores (CD11b e CD45) permite a distinção entre cada subpopulação ( Figura 3C ). Esta estratégia foi an...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por bolsas da Agence Nationale pour la Recherche (ANR-12-MALZ-0003-02-P2X7RAD), Association France Alzheimer e Bpifrance. O nosso laboratório também é apoiado pela Inserm, CNRS, Université Pierre et Marie-Curie e o programa "Investissements d'avenir" ANR-10-IAIHU-06 (IHU-A-ICM). Gostaríamos de agradecer a assistência das instalações centrais da cultura CELIS.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
5 month-old MiceJanvierC57BL/6J
Liberase TL Research GradeSigma-Aldrich5401020001Digestion enzyme
Deoxyribonuclease I from bovine pancreasSigma-AldrichDN25
PercollGE Healthcare Life Sciences17-0891-01Density gradient medium
Cell Strainer size 70 µm NylonCorning731751
Venofix 25 GBRAUN4056370
Piston syringe 10 mLTerumoSS+10ES1
Pasteur pipette 230 mmDustcher20420
1.5 mL tubeEppendorf0030 123.328
15 mL tubeTPP91015
50 mL tubeTPP91050
5 mL polystyrene round bottom tubeBD Falcon352054
D-PBS (1x) without Ca2+/Mg2+Thermo Fisher Scientific14190-094
D-PBS (10x) without Ca2+/Mg2+Thermo Fisher Scientific14200-067
Fetal bovine serumThermo Fisher Scientific10270-106
EDTASigma-AldrichE4884
Bovine Serum Albumin solution 30%Sigma-AldrichA7284
Paraformaldehyde 32% SolutionElectron Microscopy Sciences15714-SCaution -Toxic
SaponinSigma-AldrichS2002
Sodium AzideSigma-Aldrich47036
PerCPCy5.5 Rat anti-mouse CD11b (clone M1/70)eBioscience45-0112
Rat IgG2b K Isotype Control PerCP-Cyanine5.5eBioscience45-4031
BV421 Rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11)BD Biosciences563890
BV421 Rat IgG2b, κ Isotype Control RUOBD Biosciences562603
Rabbit anti-mouse TMEM119 (clone28 - 3)Abcamab209064
AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgGLife TechnologiesA31573
Anti-Mouse CD16/CD32 PurifiedeBioscience14-0161Mouse Fc Block
Fixable Dead Cell Stain KitsInvitrogenL34969
Mouse CCR2 APC-conjugated AntibodyR&DFAB5538A
Rat IgG2B APC-conjugated Isotype ControlR&DIC013A
Mouse CX3CR1 PE-conjugated AntibodyR&DFAB5825P
Goat IgG PE-conjugated AntibodyR&DIC108P
CentrifugeEppendorf5804R
Cell analyzerBD BiosciencesBD FACSVERSE
Data Analysis SoftwareFlowJo LLCFlowJo
Fine scissorsF.S.T14090-11
Standard Pattern ForcepsF.S.T11000-13
Mayo ScissorsF.S.T14010-15
Dumont #5 ForcepsF.S.T11251-20

Referências

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