Modelos Experimentales para Estudiar la Neuroprotección del Acondicionamiento Acido Contra la Isquemia Cerebral

Resumen

El postcondicionamiento ácido protege contra la isquemia cerebral. Aquí presentamos dos modelos para ejecutar APC. Se consiguen respectivamente transfiriendo rebanadas corticostriatales a un tampón ácido después de la privación de oxígeno-glucosa in vitro e inhalando 20% de CO ₂ después de la oclusión de la arteria cerebral media in vivo .

Resumen

El accidente cerebrovascular es una de las principales causas de mortalidad e incapacidad en todo el mundo, con enfoques terapéuticos limitados. Como estrategia endógena para la neuroprotección, los tratamientos post-acondicionamiento han demostrado ser terapias prometedoras contra la isquemia cerebral. Sin embargo, procedimientos complicados y posibles problemas de seguridad limitan su aplicación clínica. Para superar estos inconvenientes, hemos desarrollado postcondicionamiento ácido (APC) como terapia para la isquemia cerebral focal experimental. APC se refiere al tratamiento de acidosis leve inhalando CO ₂ durante la reperfusión después de la isquemia. Aquí presentamos dos modelos para ejecutar APC in vitro e in vivo , respectivamente. El tratamiento de privación de oxígeno-glucosa (OGD) de ratones y la oclusión corticostriatal y oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) de ratones se emplearon para imitar la isquemia cerebral. APC se puede lograr simplemente transfiriendo las rebanadas de cerebro a un tampón ácido burbujeado con 20% de CO ₂ , or por los ratones inhalan 20% de _CO2. La APC mostró efectos protectores significativos contra la isquemia cerebral, como se refleja en la viabilidad de los tejidos y en el volumen del infarto cerebral.

Introducción

El derrame cerebral es una de las principales causas de mortalidad e incapacidad en todo el mundo. Grandes esfuerzos se han hecho para encontrar tratamientos eficaces para el accidente cerebrovascular en las últimas décadas, sin embargo, el logro es bastante insatisfactorio. El postcondicionamiento es un proceso manipulado por tensiones subtóxicas después de un episodio isquémico. El postcondicionamiento, incluyendo la isquemia, la hipoxia, la baja glucosa y el postcondicionamiento isquémico remoto, desencadenan mecanismos adaptativos endógenos y han demostrado ser terapias prometedoras contra la isquemia cerebral ^{1 , 2 , 3 , 4} . Sin embargo, el postcondicionamiento isquémico puede introducir lesiones adicionales. El postcondicionamiento isquémico remoto de las extremidades suele necesitar varios ciclos de 5 a 20 min de oclusión y reperfusión en las extremidades posteriores ipsilaterales o bilaterales ^{5 , 6 , 7} . ThPor lo tanto, estas manipulaciones posteriores al acondicionamiento son peligrosas o poco prácticas en la práctica clínica. Para superar estos inconvenientes, hemos desarrollado APC como una terapia para la isquemia cerebral focal en ratones [ ^8] . Inducido simplemente por la inhalación de 20% de CO ₂ , APC reduce significativamente la lesión cerebral isquémica de una manera más factible y más segura. Recientemente hemos demostrado que APC extiende la ventana de reperfusión, destacando la importancia de APC para la terapia de accidente cerebrovascular [ ^9] .

Aquí presentamos dos modelos experimentales para estudiar la neuroprotección de APC contra la isquemia cerebral. El primero es el modelo de privación de oxígeno-glucosa (OGD) en rodajas corticostriatales de ratones. La rápida preparación y transferencia de los cortes cerebrales en un entorno artificial, usualmente el líquido cefalorraquídeo artificial (ASCF), puede mantener la viabilidad celular y los circuitos neuronales, lo que hace posible el estudio de la función cerebral in vitro ^{10 , 11 . OGD en ASCF imita la isquemia cerebral e induce lesión isquémica [ 12 , 13 , 14] . Después de OGD, las rebanadas de cerebro se refrescan en ASCF regular (r-ASCF) para proporcionar reperfusión y luego se tratan con APC usando ácido ASCF burbujeado con 20% de CO ₂ . La porción corticostriatal mantiene la caracterización histológica intacta en comparación con las células cultivadas primarias.}

Para estudiar la función cerebral in vivo , se emplea el modelo de oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) del ratón. La arteria cerebral media se bloquea insertando un monofilamento amortiguado por la llama a través de la arteria carótida común. Como uno de los modelos de accidente cerebrovascular más ampliamente utilizados, el modelo MCAO muestra relevancia clínica y la aplicación de un monofilamento facilita la reperfusión. Simplemente mediante la inhalación de gases mezclados normoxic que contienen 20% de CO ₂ después del inicio del reperfusioN, la APC mostró efectos protectores significativos contra la isquemia cerebral indicada por volúmenes reducidos de infarto cerebral.

Protocolo

Todos los experimentos fueron aprobados por y conducidos de acuerdo con las directrices éticas del Comité de Experimentación Animal de la Universidad de Zhejiang y estaban en completo cumplimiento con los Institutos Nacionales de Guía de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Se hicieron esfuerzos para minimizar cualquier dolor o incomodidad, y se utilizó el número mínimo de animales.

1. OGD de cortes de Corticostriatal

1. Preparación de la solución:
   1. Preparar 1.000 ml r-ACSF (124 mmol / L, NaCl, 5 mmol / L de KCl, 1,25 mmol / L KH ₂ PO _4, 2 mmol / L MgSO _4, 26 mmol / L _{de NaHCO3,} 2 mmol / L de _CaCl2, 10 mmol / l de glucosa, pH final 7,4). Burbuja con 5% de CO ₂ y 95% de O ₂ durante todo el experimento.
   2. Preparar 200 ml ACSF libre de glucosa (gf-ACSF) que el anterior pero con exclusión de la glucosa, burbujeado con 5% de _CO2 y 95% de _N2. Burbuja de los gases durante 30 min antes de aplicar a brAin para reducir el contenido de oxígeno en la solución. Continúe burbujeando hasta que finalice el procedimiento de OGD.
   3. Preparar ACSF acídico (a-ACSF) equilibrando 200 ml de r-ACSF con 20% de CO ₂ y 80% de O ₂ . Burbujear los gases durante 30 minutos antes de aplicar a las rebanadas del cerebro para reducir el pH de la solución a pH 6,8 y continuar burbujeando hasta que el procedimiento APC esté terminado.
   4. Colocar tres porta-tejidos en r-ACSF, gf-ACSF, a-ACSF, respectivamente.
2. Preparación de la rebanada cerebral:
   Nota: Se utilizaron ratones C57B1 / 6J machos de 8 semanas de edad en este estudio. Los animales se alojaron bajo temperatura controlada (22 ± 2 ° C), con un período de 12 h luz-oscuridad ciclo y acceso a alimentos en pellets y agua.
   1. Sacrificar un ratón con una sobredosis de isoflurano en una cámara de inducción. Decapitar el ratón. Disecar el cerebro con pequeñas tijeras y fórceps. Quitar el cerebro con una espátula delgada y dejar caer con cuidado en un vaso de vidrio conR-ACSF fría en hielo equilibrada con 5% de CO ₂ y 95% de O ₂ .
      NOTA: Estos pasos deben hacerse lo más rápido pero meticulosamente posible.
   2. Mantenga el cerebro en el r-ACSF frío durante 5 min. Ajuste la presión del gas para evitar movimientos del cerebro.
   3. Coloque el pegamento de crioprecipitado en la placa de vibratomo en dos tiras. Ponga un pedazo de agarosa al 3% sobre la tira de pegamento lejos de la cuchilla para sostener el cerebro.
   4. Invertir una placa de Petri de 10 cm sobre hielo y luego poner un papel de filtro en el plato. Humedezca el papel de filtro con gotas de r-ACSF helado.
   5. Transferir el cerebro al papel de filtro con fórceps. Cortar el polo frontal y el cerebelo con cuchilla y fórceps.
      NOTA: Las secciones transversales deben ser lo más lisas posible y vertical a plano sagital.
   6. Coloque el resto del tejido cerebral verticalmente sobre la otra tira de pegamento y mantener el cerebro apoyado contra la agarosa. Agregue r-ACSF helado al depósito de corte paraSumerja el cerebro y agregue hielo al área del soporte de hielo. Mantenga el r-ACSF en el depósito burbujeado con 5% de CO ₂ y 95% de O ₂ .
   7. Levante el depósito y ajuste la posición de la afeitadora para colocar la afeitadora tan cerca del cerebro como sea posible y justo por encima del cerebro.
   8. Elija el modo "CONT" para dividir las secciones cerebrales continuamente. Ajuste el grosor de corte a 400 μm, la frecuencia de vibración a 6 - 8 y la velocidad a 3 - 4. Pulse el botón "start / stop" para iniciar el corte automático.
   9. Cortar la punta de una pipeta Pasteur de 3 ml para hacer una abertura que coincida con el tamaño de las rodajas de cerebro.
      NOTA: La abertura debe ser lo suficientemente grande para evitar daños adicionales a las rodajas del cerebro.
   10. Dibuje cinco rebanadas de cerebro una a una con la pipeta de punta de Pasteur y colóquelas en el soporte de tejido en r-ACSF helada burbujeando con 5% de CO ₂ y 95% de O ₂ . No recoja la primera rebanada producida. Ajustar la presión del gas para avoiD movimientos de las rodajas de cerebro.
       NOTA: Las rodajas de cerebro no deben cubrirse entre sí.
   11. Colocar las rodajas de cerebro con r-ACSF a temperatura ambiente durante 30 min y luego a 37 ° C en un baño de agua durante otros 10 min para recuperar las funciones sinápticas.
3. OGD y APC:
   1. Colocar gf-ACSF y a-ACSF en un baño de agua a 37 ° C y burbujear los tampones con los gases correspondientes como se mencionó anteriormente en 1.1.2 y 1.1.3 durante 30 min.
   2. Deje una porción en r-ACSF como un control. Transferir las otras cuatro rodajas de cerebro en el soporte de tejido con gf-ACSF precalentada cuidadosamente e incubar durante 15 min. Transferir las rodajas de nuevo en el titular del tejido en r-ACSF para lograr la reperfusión.
   3. Para estudiar la ventana de tiempo de APC, transfiera una porción directamente de gf-ACSF a-ACSF. Transferir los otros tres cortes a r-ACSF en un primer momento, y luego transferir dos de ellos al titular del tejido en un ACSF-5 y 15 minutos después de la reperfusión, respectivamente.
   4. IncubatE los dos cortes en a-ACSF durante 3 min y luego transferirlos de nuevo a r-ACSF. Incubar las tres rebanadas en r-ACSF durante 1 h más. Establezca las rebanadas restantes en r-ACSF como el grupo OGD.
   5. Para un estudio de respuesta a la dosis, transfiera los cuatro cortes al soporte de tejido en r-ACSF al principio después de OGD e incube durante 5 min. Luego deje una porción en r-ACSF como grupo OGD y transfiera los otros tres cortes a-ACSF. Incubar las rodajas en a-ACSF durante 1, 3 y 5 min, respectivamente, y luego transferirlos de nuevo a r-ACSF. Incubar las tres rebanadas en r-ACSF durante 1 h más.
4. Determinación de la viabilidad de la rebanada:
   1. Preparar una solución salina normal 0,25% de clorhidrato de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC). Añadir 1,25 g de polvo de TTC a 500 ml de solución salina normal.
      NOTA: Después de que el polvo se disuelva por completo, transfiera la solución en una placa de 24 pocillos (500 μL por pocillo) cubierta en papel de aluminio y guárdela a 4 ° C. TTC y tejido teñido con TTC son sen luzSión.
   2. Transfiera las rebanadas en una placa de 24 pocillos (una rebanada por pocillo) que contenga la solución de TTC y extienda la rebanada en la solución. Incubar las rebanadas en solución de TTC a 37 ° C en un baño de agua poco profunda durante 30 min.
   3. Transfiera las rebanadas en tubos de centrífuga limpios de 1,5 ml cubiertos de papel de aluminio y mida el peso seco de las rebanadas.
   4. Añadir etanol / dimetilsulfóxido (1: 1) en los tubos de centrífuga (v: w = 10: 1) para extraer el formazán. Incubar las rebanadas en etanol / sulfóxido de dimetilo a temperatura ambiente fuera de la luz durante 24 h.
   5. Añadir todo el etanol / sulfóxido de dimetilo en los tubos en una placa de 96 pocillos y medir la absorbancia a 490 nm mediante un lector de placas.
   6. Normalizar la absorbancia al peso seco de la rebanada y expresar la viabilidad como el porcentaje de la rebanada de control.

2. MCAO

1. Preparación:
   1. Desinfecte el banco de trabajo, la superficie del Doppler Laser FlowmetrY (LDF) y sus accesorios con alcohol etílico al 70%.
   2. Preparar instrumentos autoclavados: dos tijeras, 10 cm; Dos fórceps, 10 cm; Una pinza oftálmica, 11 cm; Una micro tijeras oftálmicas, 9 cm; Una pinza de microvasos, 1,8 cm; Oneneedle unidad, r 12,5 cm; Varias suturas quirúrgicas (△ 1/2 4 × 10); cotonetes.
   3. Prepare una jeringa (sin aguja) con solución salina para mantener un área de operación hidratada.
   4. Preparar el gas de anestesia (100% O ₂ + isoflurano).
2. Detección del flujo sanguíneo cerebral:
   1. Configure el instrumento LDF.
   2. Inyectar analgésicos intraperitonealmente en el ratón: metamizol 200 mg / kg, carprofeno 4 mg / kg y buprenorfina 0,1 mg / kg.
   3. Coloque el ratón en una cámara de inducción con isoflurano al 4% en oxígeno para anestesiarlo hasta que se detenga el movimiento espontáneo del cuerpo y de las vibrissas.
   4. Coloque el ratón en posición inclinada con la narizEl cono de la nariz y mantener el isoflurano al 1,5% para el procedimiento posterior.
   5. Aplique ungüento para ojos dexpantenol en ambos ojos.
   6. Desinfecte la cabeza con alcohol etílico al 70%.
   7. Haga una incisión cutánea paramediana derecha entre los ojos y las orejas usando un bisturí para exponer el bregma.
   8. Frote el cráneo con algodón estéril.
   9. Aplique una a dos gotas de pegamento quirúrgico en la superficie del cráneo.
   10. Coloque la punta de la sonda de fibra óptica 5 mm caudal al bregma y 6 mm lateral a la línea media.
   11. Comience a grabar el flujo sanguíneo en el software del ordenador. Espere hasta que se produzca una línea de base estable del flujo sanguíneo y luego aplique un catalizador de 20 μl sobre el pegamento para fijar la sonda.
       NOTA: Una línea de base ideal debe ser más de 500 flujos.
   12. Si la línea de base es inferior a 200 flujo, ajuste la posición finamente para obtener una línea de base adecuada. Mantenga la sonda unida al cráneo durante todo el experimento.
   13. Desinfecte la cabeza con iodophor afDe la sonda de fibra óptica.
3. MCAO:
   1. Colocar y fijar el ratón anestesiado (con sonda de LDF unida a su cráneo) en posición supina y mantener su temperatura corporal usando una lámpara de calor durante la cirugía. Desinfecte el cuello con alcohol etílico al 70%.
   2. Haga una incisión en la piel del paramédico en el cuello usando un bisturí; Blunt diseccionar los tejidos blandos con fórceps para exponer los vasos. Añadir una gota de solución salina a los tejidos expuestos para mantenerlos hidratados.
   3. Disecar la arteria carótida común del tejido circundante y el nervio vago usando fórceps oftálmicos. Tenga cuidado de no dañar el nervio vago. Desinfectar nuevamente la piel del cuello con iodóforo después de exponer la arteria carótida común.
   4. Coloque una pinza de microvasos en el extremo distal de la arteria carótida común y luego ate un nudo muerto con suturas de seda 6-0 en el extremo proximal. Coloque la abrazadera lo más proximal posible para operaciones posteriores. Asegúrese de que la longitud deEl recipiente entre la abrazadera y el nudo muerto es lo más largo posible para las operaciones posteriores.
   5. Hacer una sutura temporal proximal a la abrazadera atando un nudo suelto. Asegúrese de que hay suficiente espacio entre dos nudos para la inserción de monofilamento.
   6. Hacer una pequeña incisión longitudinal entre los dos nudos con micro tijeras oftálmicas. Asegúrese de que la incisión esté tan cerca del nudo muerto como sea posible para operaciones posteriores. Tenga cuidado de no cortar el recipiente.
   7. Insertar un monofilamento de 12 mm de punta en el borde de la incisión para entrar en el lumen de la arteria y avanzar unos pocos mm. Apriete el nudo suelto alrededor de la punta del monofilamento y luego retire la abrazadera.
   8. Avance el filamento dentro de la arteria carótida interna (10 mm para ocluir la arteria cerebral media) con fórceps oftálmicos hasta que el software LDF muestre una disminución pronunciada (> 80% de reducción del flujo sanguíneo basal) en el flujo sanguíneo. Registre el tiempo de inicio de la oclusión.
      NOTA: La configuración del instrumento LDFDescrito en la sección 2.2.
   9. Ocultar la arteria cerebral media durante 1 h. Cortar la sonda LDF y poner los ratones en una incubadora de 30 ° C durante la duración de la oclusión.
4. Reperfusión y APC:
   1. Reanestesiar los animales con isoflurano como se describe arriba 55 min después del tiempo de inicio de la oclusión. Colocar y fijar los ratones en posición supina. Abra la incisión del cuello y vuelva a exponer la arteria carótida común.
   2. Retire suavemente el filamento con pinzas oftálmicas después del período de oclusión para lograr la reperfusión y convertir la sutura temporal en una permanente mediante el apriete del nudo.
   3. Para el tratamiento de la acidosis, cambiar el gas inhalado por el cono de la nariz a los gases de mezcla que contienen 20% de CO ₂ , 20% de O ₂ y 60% de N ₂ durante 5 min a 5, 50 o 100 min después de la reperfusión. Cierre la incisión con una sutura quirúrgica interrumpida.
   4. Coloque los ratones en una jaula térmica de 30 ° C hasta que los ratones recuperen la concienciaY luego devolver los ratones a limpiar, jaulas individuales. Proporcionar ratones con una placa de Petri de agua y alimentos humedecidos. Vigilar a los ratones de cerca después de la cirugía por el dolor excesivo y la muerte.
5. Medición del volumen del infarto cerebral:
   1. Medir el volumen de infarto cerebral mediante el uso de tinción TTC 24 h después de la reperfusión.
   2. Preparar una solución de TTC al 0,25% como se mencionó en el paso 1.4.1 antes del tiempo de sacrificio designado. Transferir la solución en una placa de 24 pocillos (1 ml por pocillo) cubierta en papel de aluminio y almacenarla a 4 ° C.
      NOTA: El TTC y el tejido teñido con TTC son sensibles a la luz.
   3. A las 24 h después de la reperfusión, sacrificar al animal con una sobredosis de isoflurano en una cámara de inducción. Decapitar los ratones. Disecar los cerebros con pequeñas tijeras y fórceps. Examinar los puntos de sangre en el cerebro para excluir a los ratones que se sometieron a hemorragia subaracnoidea en el Círculo de Willis.
   4. Coloque el cerebro sobre una diapositiva de cristal limpia en un -20 ° C paquete de hielo. Coloque el cerebro y la diapositiva de cristal en un refrigerador de -20 ° C durante 5 minutos para hacer que el cerebro más fácil de rebanar.
   5. Saque el cerebro y el portaobjetos de vidrio de -20 ° C y vuelva a colocarlos en el paquete de hielo de -20 ° C. Disecar el polo frontal y el cerebelo con cuchilla y fórceps.
   6. Cortar las secciones del cerebro horizontalmente a un espesor de 1 mm con una hoja para producir 5 rebanadas. Transferir las rodajas en la placa de 24 pocillos que contiene solución TTC (1 rebanada por pocillo) con fórceps y estirar las rebanadas en la solución. Incubar las rebanadas en solución de TTC a 37 ° C en un baño de agua poco profunda durante 30 min.
   7. Aspirar la solución TTC. Añadir formaldehído al 10% (1 ml por pocillo) e incubar a temperatura ambiente durante 30 min. Coloque las rebanadas en el orden en que fueron cortadas sobre una hoja de celofán y escanear los segmentos en la cámara de imágenes fotográficas.
   8. Analizar el tamaño del infarto como un porcentaje de la porción entera del cerebro usando el software de análisis ImageJLass = "xref"> 8 basado en la identificación visual; Véase la figura 2 (izquierda).

Resultados

En el modelo de corte corticostriatal descrito anteriormente, la viabilidad de la corteza corticostriatal se cuantificó por ensayo de TTC a 1 h después de la reperfusión. La conversión de TTC se calculó normalizando la absorción a 490 nm a la porción de control. De acuerdo con la conversión de TTC, APC protegido contra OGD inducida por lesión de reperfusión en un tiempo de inicio y la duración dependiente de manera. En detalle, tanto 1 y 3 min de tratamiento de la acidosis mej...

Discusión

Aquí presentamos dos modelos experimentales para estudiar la neuroprotección de APC contra la isquemia cerebral. En las rebanadas cerebrales, la APC se logra incubando ratones con rebanadas corticostriatales en tampón ácido burbujeado con 20% de CO ₂ después del inicio de la reperfusión, mientras que en el modelo MCAO, la APC se consigue inhalando 20% de CO ₂ a ratones después de la reperfusión. Ambos modelos reflejan la neuroprotección de APC contra la isquemia cerebral. La protección fu...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium chloride	Sigma	S5886
Potassium chloride	Sigma	P5405
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P9791
Magnesium sulfate	Sigma	M2643
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761
Calcium chloride dihydrate	Sigma	C5080
D-(+)-Glucose	Sigma	G7021
Vibratome	Leica	VT1000 S
2,3,5-triphenyltetrazolium hydrochloride	Sigma	T8877
Absolute Ethanol	Aladdin Industrial Corporation	E111993
Dimethyl sulfoxide	Sigma	D8418
Laser Doppler Flowmetry	Moor Instruments Ltd	Model Moor VMS-LDF2
Diethyl ether anhydrous	Sinopharm Chemical Reagent Corporation	80059618
Trichloroacetaldehycle hydrate	Sinopharm Chemical Reagent Corporation	30037517
10% Formalin	Aladdin Industrial Corporation	F111936
24-well plates	Jet Biofil	TCP-010-024