Modelos experimentais para estudar a neuroproteção do pós-condicionamento ácido contra a isquemia cerebral

Resumo

O pós-condicionamento ácido protege contra a isquemia cerebral. Aqui apresentamos dois modelos para executar a APC. Eles são obtidos, respectivamente, transferindo fatias corticostriatais para o tampão ácido após a privação de oxigênio-glicose in vitro e pela inalação de 20% de CO ₂ após a oclusão da artéria cerebral média in vivo .

Resumo

O acidente vascular cerebral é uma das principais causas de mortalidade e incapacidade em todo o mundo, com abordagens terapêuticas limitadas. Como uma estratégia endógena para a neuroproteção, os tratamentos pós-condicionamento provaram ser terapias promissoras contra a isquemia cerebral. No entanto, procedimentos complicados e possíveis problemas de segurança limitam sua aplicação clínica. Para superar estas desvantagens, desenvolvemos pós-condicionamento ácido (APC) como terapia para isquemia cerebral focal experimental. APC refere-se ao tratamento de acidose leve por inalação de CO ₂ durante a reperfusão após isquemia. Aqui apresentamos dois modelos para executar APC in vitro e in vivo , respectivamente. O tratamento de privação de oxigênio-glicose (OGD) de camundongos e a oclusão corticostriatal e oclusão da artéria cerebral média (MCAO) de camundongos foram empregados para imitar a isquemia cerebral. APC pode ser simplesmente conseguido através da transferência de fatias de cérebro para tampão ácido borbulhado com 20% de CO ₂ , oR por camundongos que inalam 20% de CO ₂ . A APC mostrou efeitos protetores significativos contra a isquemia cerebral, como reflete a viabilidade do tecido e o volume do infarto cerebral.

Introdução

O acidente vascular cerebral é uma das principais causas de mortalidade e incapacidade em todo o mundo. Grandes esforços foram feitos para encontrar tratamentos efetivos para AVC nas últimas décadas, no entanto, a conquista é bastante insatisfatória. O pós-condicionamento é um processo manipulado por tensões subtoxicas após um episódio isquêmico. O pós-condicionamento, incluindo o pós-condicionamento isquêmico, hipóxico, baixo teor de glicose e remoto, desencadeia mecanismos adaptativos endógenos e provou ser terapias promissoras contra a isquemia cerebral ^{1 , 2 , 3 , 4} . Contudo, o pós-condicionamento isquêmico pode introduzir lesões adicionais. O pós-condicionamento isquêmico remoto dos membros geralmente precisa de vários ciclos de 5 a 20 min de oclusão e reperfusão nos membros traseiros ipsilaterais ou bilaterais ^{5 , 6 , 7} . ºPortanto, essas manipulações pós-condicionamento são perigosas ou impraticáveis ​​na prática clínica. Para superar essas desvantagens, desenvolvemos APC como terapia para isquemia cerebral focal em camundongos ⁸ . Induzido simplesmente por inalação de 20% de CO ₂ , APC reduz significativamente a lesão cerebral isquêmica de uma maneira mais viável e segura. Recentemente, provamos que a APC estende a janela de reperfusão, destacando o significado da APC para terapia de AVC ⁹ .

Aqui apresentamos dois modelos experimentais para estudar a neuroproteção de APC contra isquemia cerebral. O primeiro é o modelo de privação de oxigênio-glicose (OGD) em fatias corticostriatais de camundongos. A rápida preparação e transferência das fatias do cérebro para um ambiente artificial, geralmente fluido cerebrospinal artificial (ASCF), pode manter a viabilidade celular e circuitos neuronais, o que possibilita o estudo da função cerebral in vitro ^{10 11 . OGD em ASCF imita a isquemia cerebral e induz a lesão isquêmica 12 , 13 , 14 . Após OGD, as fatias de cérebro são atualizadas em ASCF (r-ASCF) regulares para fornecer reperfusão e depois tratadas com APC usando ASCF ácido borbulhou com 20% de CO ₂ . A fatia corticostriatal mantém a caracterização histológica intacta em comparação com células primárias cultivadas.}

Para estudar a função cerebral in vivo , emprega-se o modelo de oclusão da artéria cerebral média (MCAO) do mouse. A artéria cerebral média é bloqueada pela inserção de um monofilamento inflamado através da artéria carótida comum. Como um dos modelos de AVC mais amplamente utilizados, o modelo MCAO mostra relevância clínica e a aplicação de um monofilamento torna mais fácil a reperfusão. Simplesmente pela inalação de gases mistos normoxicos contendo 20% de CO ₂ após o início do reperfusioN, a APC mostrou efeitos protetores significativos contra a isquemia cerebral indicada por volumes reduzidos de infarto cerebral.

Protocolo

Todos os experimentos foram aprovados e conduzidos de acordo com as diretrizes éticas do Comitê de Experimentação Animal da Universidade de Zhejiang e estavam em completa conformidade com os Institutos Nacionais de Guia de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Foram feitos esforços para minimizar qualquer dor ou desconforto, e o número mínimo de animais foi usado.

1. OGD de fatias Corticostriatal

1. Preparação da solução:
   1. Preparar 1000 ml de r-ACSF (124 mmol / L, NaCl, 5 mmol / L de KCl, 1,25 mmol / L KH ₂ PO _4, 2 mmol / L de _MgSO4, 26 mmol / L _NaHCO3, 2 mmol / L de CaCl _2, 10 mmol / L de glicose, pH final 7,4). Bolha com 5% de CO ₂ e 95% de O ₂ ao longo da experiência.
   2. Preparar 200 mL ACSF sem glicose (GF-ACSF) como acima mas excluindo a glucose, borbulhar com 5% de CO ₂ e 95% de _N2. Bolha os gases por 30 min antes de aplicar para brEm fatias para reduzir o teor de oxigênio na solução. Continue borbulhando até o procedimento OGD terminar.
   3. Prepare ácida ACSF (a-ACSF) equilibrando 200 ml de r-ACSF com 20% de CO ₂ e 80% de O _2. Bolha os gases durante 30 minutos antes de aplicar a fatias do cérebro para reduzir o pH da solução para pH 6.8 e continuar borbulhando até o procedimento APC terminar.
   4. Coloque três suportes de tecido em r-ACSF, gf-ACSF, a-ACSF, respectivamente.
2. Preparação da fatia do cérebro:
   Nota: foram utilizados camundongos C57Bl / 6J de oito semanas de idade neste estudo. Os animais foram alojados sob temperatura controlada (22 ± 2 ° C), com um período de ciclo de luz-escuro de 12 h e acesso a alimentos e água com sedimentos.
   1. Sacrifique um mouse com uma overdose de isoflurano em uma câmara de indução. Decapite o mouse. Dissecesse o cérebro usando pequenas tesouras e fórceps. Remova o cérebro com uma espátula fina e coloque-o cuidadosamente em um copo de vidro comtenção gelada r-ACSF equilibrada com 5% de CO ₂ e 95% de O _2.
      NOTA: Estas etapas devem ser feitas de forma rápida, mas meticulosamente possível.
   2. Mantenha o cérebro no r-ACSF gelado por 5 min. Ajuste a pressão do gás para evitar movimentos do cérebro.
   3. Coloque cola de crioprecipitado na placa de vibração em duas tiras. Coloque um pedaço de agarose a 3% sobre a tira de cola para longe da lâmina para suportar o cérebro.
   4. Inverta uma placa de Petri de 10 cm sobre gelo e depois coloque um papel de filtro no prato. Humedecer o papel de filtro com gotas de r-ACSF geladas.
   5. Transfira o cérebro para o papel de filtro com fórceps. Corte o poste frontal e o cerebelo com lâmina e pinça.
      NOTA: As seções transversais devem ser tão lisas quanto possível e vertical para o plano sagital.
   6. Coloque o tecido cerebral restante verticalmente sobre a outra tira de cola e mantenha o cérebro encostado à agarose. Adicione o r-ACSF gelado ao reservatório de corte paraMergulhe o cérebro e adicione gelo na área do suporte de gelo. Manter o r-ACSF no reservatório borbulhar com 5% de CO ₂ e 95% de O _2.
   7. Levante o reservatório e ajuste a posição da navalha para colocar a navalha tão perto do cérebro quanto possível e logo acima do cérebro.
   8. Escolha o modo "CONT" para cortar as seções do cérebro continuamente. Defina a espessura de corte para 400 μm, a freqüência de vibração para 6 a 8 e a velocidade para 3 - 4. Pressione o botão "iniciar / parar" para iniciar o corte automático.
   9. Corte a ponta de uma pipeta Pasteur de 3 mL para fazer uma abertura correspondente ao tamanho das fatias do cérebro.
      NOTA: A abertura deve ser grande o suficiente para evitar danos adicionais nas fatias do cérebro.
   10. Extrair cinco fatias de cérebro de um por um, com a pipeta de ponta-cutPasteur e colocá-los no suporte do tecido em gelada r-ACSF borbulhar com 5% de CO ₂ e O ₂ 95%. Não colete a primeira fatia produzida. Ajuste a pressão do gás para avoiD movimentos das fatias do cérebro.
       NOTA: As fatias do cérebro não devem cobrir uma a outra.
   11. Coloque fatias de cérebro com r-ACSF à temperatura ambiente durante 30 min e depois a 37 ° C em banho-maria por mais 10 min para recuperar funções sinápticas.
3. OGD e APC:
   1. Coloque gf-ACSF e a-ACSF em um banho-maria a 37 ° C e borbulhe os tampões com os gases correspondentes, conforme mencionado acima em 1.1.2 e 1.1.3 durante 30 min.
   2. Deixe uma fatia no r-ACSF como um controle. Transfira as outras quatro fatias de cérebro no suporte de tecido com gf-ACSF pré-aquecido com cuidado e incube durante 15 min. Transfira as fatias de volta para o suporte de tecido em r-ACSF para obter reperfusão.
   3. Para estudar a janela de tempo da APC, transfira uma fatia diretamente de gf-ACSF para a-ACSF. Transfira as outras três fatias para o r-ACSF em primeiro lugar, e depois transfira duas delas para o suporte de tecido em a-ACSF 5 e 15 min após a reperfusão, respectivamente.
   4. IncubatE as duas fatias em a-ACSF por 3 min e depois transferi-las de volta para r-ACSF. Incube as três fatias em r-ACSF por mais 1 h. Defina as restantes fatias no r-ACSF como o grupo OGD.
   5. Para um estudo de resposta à dose, transferir as quatro fatias para o suporte de tecido em r-ACSF no início após OGD e incubar durante 5 min. Em seguida, deixe uma fatia no r-ACSF como o grupo OGD e transfira as outras três fatias para a-ACSF. Incubar as fatias em a-ACSF por 1, 3 e 5 min, respectivamente, e depois transferi-las para r-ACSF. Incube as três fatias em r-ACSF por mais 1 h.
4. Determinação da viabilidade da fatia:
   1. Preparar 0,25% de solução salina normal de cloridrato de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC). Adicione 1,25 g de pó de TTC a 500 ml de solução salina normal.
      NOTA: Depois que o pó se dissolver completamente, transfira a solução para uma placa de 24 poços (500 μL por poço) coberta de papel alumínio e guarde-a a 4 ° C. TTC e tecido corado com TTC são light senSitive.
   2. Transfira as fatias para uma placa de 24 poços (uma fatia por poço) contendo solução de TTC e estique a fatia na solução. Incubar as fatias na solução de TTC a 37 ° C num banho de água pouco profunda durante 30 min.
   3. Transfira as fatias para limpar os tubos de centrífuga de 1,5 mL cobertos com papel alumínio e medir o peso seco das fatias.
   4. Adicionar etanol / sulfóxido de dimetilo (1: 1) nos tubos da centrífuga (v: w = 10: 1) para extrair o formazan. Incubar as fatias em etanol / dimetilsulfóxido à temperatura ambiente longe da luz durante 24 h.
   5. Adicione todo o etanol / sulfóxido de dimetilo nos tubos em uma placa de 96 poços e mede a absorvância a 490 nm por um leitor de placas.
   6. Normalize a absorvância para o peso seco da fatia e viabilidade expressa como a porcentagem da fatia de controle.

2. MCAO

1. Preparação:
   1. Desinfecte o banco de trabalho, a superfície do Doppler Laser FlowmetrY (LDF) e seus acessórios com 70% de álcool etílico.
   2. Preparar instrumentos autoclavados: duas tesouras, 10 cm; Duas fórceps, 10 cm; Uma pinça oftálmica, 11 cm; Uma tesoura micro oftálmica, 9 cm; Uma braçadeira de microvento, 1,8 cm; Oneneedle drive, r 12,5 cm; Várias suturas cirúrgicas (△ 1/2 4 × 10); cotonetes.
   3. Prepare uma seringa (sem agulha) com solução salina para manter uma área de operação hidratada.
   4. Prepare o gás de anestesia (100% O ₂ + isoflurano).
2. Detecção do fluxo sanguíneo cerebral:
   1. Configure o instrumento LDF.
   2. Injete analgésicos por via intraperitoneal no mouse: metamizol 200 mg / kg, carprofen 4 mg / kg e buprenorfina 0,1 mg / kg.
   3. Coloque o mouse em uma câmara de indução com 4% de isoflurano em oxigênio para anestesiar até que o movimento espontâneo do corpo e a vibração parem.
   4. Coloque o mouse em posição inclinada com o nariz encaixado naE cone de nariz e manter isoflurano a 1,5% para o procedimento subseqüente.
   5. Aplique pomada de dexpantenol em ambos os olhos.
   6. Desinfecte a cabeça com 70% de álcool etílico.
   7. Faça uma incisão da pele paramediana direita entre olhos e ouvidos usando um bisturi para expor o bregma.
   8. Esfregue o crânio com algodão estéril.
   9. Aplique uma a duas gotas de cola cirúrgica na superfície do crânio.
   10. Coloque a ponta da sonda de fibra óptica de 5 mm caudal para a bregma e 6 mm lateral à linha média.
   11. Comece a gravar o fluxo sanguíneo no software do computador. Aguarde até ocorrer uma linha de base estável do fluxo sanguíneo e aplique um catalisador de 20 μL sobre a cola para consertar a sonda.
       NOTA: uma linha de base ideal deve ser mais de 500 fluxos.
   12. Se a linha de base for inferior a 200 fluxos, ajuste a posição finamente para obter uma linha de base adequada. Mantenha a sonda unida ao crânio durante a duração da experiência.
   13. Desinfecte a cabeça com iodophor afTer a sonda de fibra óptica anexada.
3. MCAO:
   1. Coloque e repare o mouse anestesiado (com a sonda LDF anexada ao crânio) em posição supina e mantenha a temperatura do corpo usando uma lâmpada de calor ao longo da cirurgia. Desinfecte o pescoço com 70% de álcool etílico.
   2. Faça uma incisão cutânea paramediana no pescoço usando um bisturi; Dissimulam os tecidos moles com fórceps para expor os vasos. Adicione uma gota de solução salina aos tecidos expostos para mantê-los hidratados.
   3. Dissecar a artéria carótida comum do tecido circundante e do nervo vago usando pinça oftálmica. Tenha cuidado para não danificar o nervo vago. Desinfecte novamente a pele do pescoço com iodóforo após exposição à artéria carótida comum.
   4. Coloque uma braçadeira de microvasos na extremidade distal da artéria carótida comum e, em seguida, amarre um nó morto com suturas de seda 6-0 na extremidade proximal. Coloque o grampo o mais proximamente possível para operações subsequentes. Certifique-se de que o comprimento deO recipiente entre o grampo eo nó morto é o maior tempo possível para as operações subsequentes.
   5. Faça uma sutura temporária proximal ao grampo, amarrando um nó solto. Certifique-se de que haja espaço suficiente entre dois nós para a inserção de monofilamentos.
   6. Faça uma pequena incisão longitudinal entre os dois nós com tesoura micro-oftálmica. Certifique-se de que a incisão seja tão próxima ao nó morto quanto possível para as operações subsequentes. Tenha cuidado para não cortar a embarcação.
   7. Insira um monofilamento com mola de 12 mm com a incisão para entrar no lúmen da artéria e avance-o alguns mm. Aperte o nó solto em torno da ponta do monofilamento e retire o grampo.
   8. Avance o filamento para a artéria carótida interna (10 mm para ocultar a artéria cerebral média) com pinça oftálmica até o software LDF mostrar um declínio acentuado (> redução de 80% no fluxo sanguíneo basal) no fluxo sanguíneo. Registre o tempo de início da oclusão.
      NOTA: a configuração do instrumento LDF éDescrito na seção 2.2.
   9. Ocultar a artéria cerebral média durante 1 h. Corte a sonda LDF e coloque os ratos em uma incubadora de 30 ° C durante o período de oclusão.
4. Reperfusão e APC:
   1. Re-anestesiar os animais com isoflurano como descrito acima 55 minutos após o início da oclusão. Coloque e repare ratos em posição supina. Abra a incisão do pescoço e reexponha a artéria carótida comum.
   2. Retire suavemente o filamento com pinça oftálmica após o período de oclusão para obter reperfusão e torne a sutura temporária em permanente, apertando o nó.
   3. Para o tratamento de acidose, mudar o gás inalado pelo cone de nariz para os gases de mistura contendo 20% de _CO2, 20% _{de O2} e 60% de N ₂ durante 5 min a 5, 50, ou 100 minutos após a reperfusão. Feche a incisão com uma sutura cirúrgica interrompida.
   4. Coloque ratos em uma gaiola de calor a 30 ° até que os ratos recuperem a consciênciaE depois devolver os ratos para limpar, gaiolas individuais. Forneça ratos com uma placa de Petri de água e alimentos umedecidos. Monitore os ratos de perto após a cirurgia por dor excessiva e morte.
5. Medição do volume do infarto do cérebro:
   1. Medir o volume do infarto cerebral usando TTC coloração 24 h após a reperfusão.
   2. Prepare a solução TTC de 0,25% como mencionado no passo 1.4.1 antes do tempo designado de sacrifício. Transfira a solução para uma placa de 24 poços (1 mL por poço) coberta de papel alumínio e guarde-a a 4 ° C.
      NOTA: TTC e tecido corado com TTC são sensíveis à luz.
   3. Às 24 h após a reperfusão, sacrificar o animal com uma overdose de isoflurano em uma câmara de indução. Decapite os ratos. Dissie os cérebros usando pequenas tesouras e fórceps. Examine os pontos de sangue nos cérebros para excluir os ratos submetidos a hemorragia subaracnóidea no círculo de Willis.
   4. Coloque o cérebro em um slide de vidro limpo em -20 ° C embalagem de gelo. Coloque o cérebro e o vidro deslize em um refrigerador de -20 ° C por 5 minutos para facilitar o corte do cérebro.
   5. Retire o cérebro eo vidro deslize de -20 ° C e coloque-os de volta no pacote de gelo de -20 ° C. Dissecar o pólo frontal e o cerebelo com lâmina e pinça.
   6. Corte as seções do cérebro horizontalmente até uma espessura de 1 mm com uma lâmina para produzir 5 fatias. Transfira as fatias para dentro da placa de 24 poços contendo solução TTC (1 fatia por poço) com fórceps e estique as fatias na solução. Incubar as fatias na solução de TTC a 37 ° C num banho de água pouco profunda durante 30 min.
   7. Aspirar a solução TTC. Adicione 10% de formaldeído (1 mL por poço) e incuba à temperatura ambiente durante 30 min. Coloque as fatias na ordem em que foram cortadas em uma folha de celofane e digitalizar os segmentos na imagem fotográfica fotográfica.
   8. Analise o tamanho do infarto como uma porcentagem de toda a fatia do cérebro usando o software de análise ImageJLass = "xref"> 8 com base na identificação visual; Veja a Figura 2 (esquerda).

Resultados

No modelo da fatia corticostriatal descrita acima, a viabilidade corticostriatal da fatia foi quantificada por meio de ensaio TTC às 1 h após a reperfusão. A conversão TTC foi calculada normalizando a absorção a 490 nm para a fatia de controle. De acordo com a conversão de TTC, a APC protegeu contra lesões de reperfusão induzidas por OGD de uma maneira dependente de tempo e de início. Em detalhes, tanto 1 quanto 3 minutos de tratamento de acidose melhoraram significativamente a...

Discussão

Aqui apresentamos dois modelos experimentais para estudar a neuroproteção de APC contra isquemia cerebral. Em fatias de cérebro, a APC é conseguida através da incubação de fatias corticostriatais de camundongos em tampão ácido borbulhado com 20% de CO ₂ após o início da reperfusão, enquanto que no modelo MCAO, a APC é conseguida inalando 20% de CO ₂ para ratos após reperfusão. Ambos os modelos refletem a neuroproteção da APC contra a isquemia cerebral. A proteção foi comparável ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium chloride	Sigma	S5886
Potassium chloride	Sigma	P5405
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P9791
Magnesium sulfate	Sigma	M2643
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761
Calcium chloride dihydrate	Sigma	C5080
D-(+)-Glucose	Sigma	G7021
Vibratome	Leica	VT1000 S
2,3,5-triphenyltetrazolium hydrochloride	Sigma	T8877
Absolute Ethanol	Aladdin Industrial Corporation	E111993
Dimethyl sulfoxide	Sigma	D8418
Laser Doppler Flowmetry	Moor Instruments Ltd	Model Moor VMS-LDF2
Diethyl ether anhydrous	Sinopharm Chemical Reagent Corporation	80059618
Trichloroacetaldehycle hydrate	Sinopharm Chemical Reagent Corporation	30037517
10% Formalin	Aladdin Industrial Corporation	F111936
24-well plates	Jet Biofil	TCP-010-024