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Resumen

Aquí, proponemos un protocolo para la diferenciación condrogénica de células madre pluripotentes inducidas por humanos derivadas de células mononucleares de sangre del cordón umbilical.

Resumen

El cartílago articular humano carece de la capacidad de repararse. Por lo tanto, la degeneración del cartílago no se trata por tratamientos curativos sino por tratamientos conservadores. Actualmente, se están haciendo esfuerzos para regenerar el cartílago dañado con condrocitos expandidos ex vivo o células madre mesenquimales derivadas de médula ósea (BMSCs). Sin embargo, la viabilidad limitada y la inestabilidad de estas células limitan su aplicación en la reconstrucción del cartílago. Las células madre pluripotentes inducidas por el hombre (hiPSCs) han recibido atención científica como una nueva alternativa para aplicaciones regenerativas. Con ilimitada capacidad de auto-renovación y multipotencia, HiPSCs se han destacado como una nueva fuente de células de reemplazo para la reparación del cartílago. Sin embargo, la obtención de una gran cantidad de gránulos condrogénicos de alta calidad es un reto importante para su aplicación clínica. En este estudio, se utilizó el cuerpo embrioide (EB) derivado de las células de crecimiento para la diferenciación condrogénica. La condrogénesis exitosa fue confirmada por PCR yD con azul alciano, azul de toluidina y anticuerpos contra los tipos de colágeno I y II (COL1A1 y COL2A1, respectivamente). Proporcionamos un método detallado para la diferenciación de células madre mononucleares derivadas de células madre ipSCs (CBMC-hiPSCs) en chondrogenic pellets.

Introducción

El uso de hiPSCs representa una nueva estrategia para la detección de drogas y estudios mecánicos de diversas enfermedades. Desde una perspectiva regenerativa, hiPSCs son también una fuente potencial para la sustitución de los tejidos dañados que tienen capacidad de curación limitada, como el cartílago articular 1 , 2 .

La regeneración del cartílago articular nativo ha sido un reto durante varias décadas. El cartílago articular es un tejido suave y blanco que recubre el extremo de los huesos, protegiéndolos de la fricción. Sin embargo, tiene una capacidad regenerativa limitada cuando está dañada, lo que hace que la auto-reparación sea casi imposible. Por lo tanto, la investigación centrada en la regeneración del cartílago ha estado en curso durante varias décadas.

Anteriormente, la diferenciación in vitro en el linaje condrogénico se realizó generalmente con BMSCs o condrocitos nativos aislados de la articulación de la rodilla [ 3] . Debido tO su potencial condrogénico, las BMSC y los condrocitos nativos tienen numerosos méritos que apoyan su uso en la condrogénesis. Sin embargo, debido a su limitada expansión y fenotipo inestable, estas células enfrentan varias limitaciones en la reconstrucción de los defectos del cartílago articular. Bajo condiciones de cultivo in vitro , estas células tienden a perder sus propias características después de 3-4 pases, lo que finalmente afecta a sus capacidades de diferenciación [ 4] . Además, en el caso de condrocitos nativos, un daño adicional a la articulación de la rodilla es inevitable cuando se obtienen estas células.

A diferencia de BMSCs o condrocitos nativos, hiPSCs puede expandirse indefinidamente in vitro . Con las condiciones de cultivo adecuadas, los hiPSC tienen un gran potencial como fuente de reemplazo para la diferenciación condrogénica. Sin embargo, es un desafío para cambiar las características intrínsecas de hiPSCs [ 5] . Por otra parte, se necesitan varias complicaciones in vitroPs para dirigir el destino de hiPSCs a un tipo de célula específico. A pesar de estas complicaciones, el uso de los hiPSCs sigue siendo recomendable debido a su alta capacidad de auto-renovación y su capacidad para diferenciarse en las células objetivo, incluidos los condrocitos [ 6] .

La diferenciación condrogénica se realiza habitualmente con sistemas de cultivo tridimensionales, tales como el cultivo de pellets o el cultivo de micromasas, utilizando células progenitoras similares a MSC. Si se usan hiPSCs, el protocolo para generar células progenitoras tipo MSC difiere de los protocolos existentes. Algunos grupos utilizan cultura monocapa de hiPSCs para convertir directamente el fenotipo en MSC-como las células [ 7] . Sin embargo, la mayoría de los estudios utilizan EBs para generar células de crecimiento que se asemejan a MSCs 8 , 9 , 10 , 11 .

Se utilizan diversos tipos de factores de crecimiento para inducir el condrogeNesis Normalmente, las proteínas de la familia BMP y TGFβ se usan, solas o en combinación. La diferenciación también se ha inducido con otros factores, tales como GDF5, FGF2, y IGF1 12 , 13 , 14 , 15 . Se ha demostrado que TGFβ1 estimula la condrogénesis de una manera dependiente de la dosis en MSCs 16 . Comparado con el otro isotipo, TGFβ3, TGFβ1 induce condrogenesis mediante el aumento de la condensación de células mesenquimales pre-cartilage.TGFβ3 induce condrogenesis mediante el aumento significativo de la proliferación de células mesenquimales [ 17] . Sin embargo, TGFβ3 es utilizado con mayor frecuencia por los investigadores que TGFβ1 7 , 10 , 18 , 19 . BMP2 mejora la expresión de genes relacionados con los componentes de la matriz condrogénica en humanosCondrocitos articulares bajo condiciones in vitro 20 . BMP2 aumenta la expresión de genes críticos para la formación de cartílago en MSCs en combinación con TGF β proteínas [ 21] . También se ha demostrado que BMP2 sinérgicamente mejora el efecto de TGF β3 a través de las vías Smad y MAPK [ 22] .

En este estudio, CBMC-hiPSCs se agregaron en EBs utilizando medio EB en una placa de Petri de baja fijación. Las células de crecimiento se indujeron uniendo los EB a un plato recubierto de gelatina. La diferenciación condrogénica utilizando células de crecimiento se realizó por cultivo de pellets. El tratamiento con BMP2 y TGFβ3 condensó con éxito las células y indujo la acumulación de proteínas de la matriz extracelular (ECM) para la formación de gránulos condrogénicos. Este estudio sugiere un sencillo pero eficiente clondrogenic diferenciación protocolo utilizando CBMC-hiPSCs.

Protocolo

Este protocolo fue aprobado por la junta de revisión institucional de la Universidad Católica de Corea (KC12TISI0861). CBMCs utilizados para la reprogramación se obtuvieron directamente del Banco de Sangre de Cordón del Hospital St. Mary de Seúl.

1. Diferenciación condrogénica de iPSCs

  1. Generación CBMC-iPSC
    1. Generar CBMC-hiPSCs utilizando el protocolo mostrado en nuestro trabajo anterior 23 .
    2. Recoja las células de la sangre en un tubo cónico de 15 ml y cuente con un hemocitómetro.
    3. Preparar 3 x 105 células y centrifugarlas durante 5 min a 515 xg y RT. Desechar el sobrenadante por succión y resuspender las células en 0,5 ml de medio de células sanguíneas.
    4. Transferir las células a un pocillo de una placa de 24 pocillos sin recubrimiento y añadir la mezcla de virus Sendai, siguiendo las recomendaciones del fabricante.
    5. Centrifugar la placa durante 30 minutos a 1.150 xg y 30 ° C.
    6. En popaEr de centrifugación, incubar las células durante la noche (O / N) a 37 ° C en 5% de CO 2 .
    7. Al día siguiente, transfiera las células transducidas a un pocillo revestido con matriz. Centrifugar la placa a 1.150 xg durante 30 minutos a 30 ° C.
    8. Después de la centrifugación, se retira el sobrenadante, se añade 1 ml de medio iPSC y se mantienen las células O / N a 37ºC en CO _ { 2 } al 5%.
    9. Mantener las células unidas a 37 ° C y 5% de CO 2 . Cambie el medio diariamente, reemplazándolo con el medio fresco iPSC.
      NOTA: Las colonias aparecerán en el día 14-21 después de la transducción.
  2. EB generación
    1. Mantener los hiPSCs a 37 ° C y 5% de CO 2 . Cambie el medio diariamente, reemplazándolo con el medio Essential 8 (E8) fresco.
    2. Preparar 2 x 10 6 hiPSCs en un plato revestido con vitronectina de 100 mm en medio E8.
    3. Se retira el medio E8 del plato de cultivo y se lava con solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS).
    4. Añadir 1Ml de ácido etilendiaminotetraacético 1 mM (EDTA) e incubar a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 2 min.
    5. Cosecha de las células con 3 ml de medio E8 y transferirlos a un nuevo tubo cónico de 15 ml. Centrifugar las células a 250 xg a temperatura ambiente (RT) durante 2 min.
    6. Aspirar el sobrenadante sin alterar el sedimento celular y resuspender las células en 5 ml de medio E8.
    7. Contar las células utilizando un hemocitómetro y preparar 2 x 10 6 células para cada 100 mm placa de Petri. Resuspender las células preparadas en una mezcla de 10 ml de medio E8 y EB (1: 1) con 10 μM de inhibidor de la quinasa rho-asociada (ROCK).
    8. Incubar las células O / N para la agregación a 37 ° C y 5% de CO 2 .
    9. Al día siguiente, cosechar los EBs agregados por pipeteo. Centrifugar las células a 250 xg durante 1 min. Se retira el sobrenadante y se resuspende el EB en 10 ml de medio E8 fresco.
    10. Ampliar los EBs generados durante 5 días, realizando cambios diarios con fresH E8 medio. Para maduración adicional, cambiar el medio de cultivo al medio E7. Mantener los EB a 37 ° C y 5% de CO2 durante otros 5 días, realizando cambios medios diarios con medio E7 fresco.
      NOTA: El medio E7 es medio E8 sin FGF2.
  3. Inducción de células extraídas de EBs
    1. Añadir 6 ml de gelatina al 1% a un plato de 100 mm e incubar a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 30 min.
    2. Retire la gelatina y seque completamente el plato durante 2-3 horas antes de usarlo.
    3. Transfiera los EB a un tubo cónico de 50 ml. Deje que los EBs se asienten en el fondo del tubo cónico. Eliminar el sobrenadante sin alterar el EB.
    4. Resuspender los EBs en 10 ml de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con suero bovino fetal al 20% (FBS). Transfiera los EBs al plato recubierto de gelatina de 100 mm. Añadir 10 μ M ROCK inhibidor.
    5. Incubar y mantener las células a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 7 días. Cambiar de temaDium cada dos días sin añadir inhibidor de ROCK.
  4. Formación de gránulos condrogénicos
    1. Aspirar el medio de cultivo del plato y lavar las células tres veces con PBS.
    2. Aplicar 1 mL de EDTA 1 mM e incubar a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 2 min.
    3. Cosecha de las células utilizando 5 mL de DMEM con 20% FBS y transferirlos a un nuevo tubo cónico de 15 mL.
    4. Centrifugar las células durante 2 min a 250 xg y RT. Deseche el sobrenadante y resuspenda el sedimento en 10 ml de DMEM con FBS al 20%.
    5. Filtrar y descartar los grupos de células utilizando un tamiz de células de 40 μm y cosechar las células individuales. Contar las células individuales con un hemocitómetro.
    6. Centrifugar las células durante 2 min a 250 xg y RT. Eliminar el sobrenadante y sembrar 3 x 10 5 células por gránulo en un tubo cónico de 15 mL con 300 μl de medio de diferenciación condrogénica (CDM).
    7. Para la formación de gránulos, centrifugar las células durante 5 min a680 xg y RT.
      NOTA: Los gránulos se mantienen en tubos cónicos de 15 mL durante la diferenciación de los gránulos condrogénicos.
    8. Incubar las células durante la noche a 37 ° C y 5% de CO 2 .
    9. Cambie el MDL cada 2-3 días. Dentro de 3 días, los gránulos mostrarán morfologías esferoidales aplanadas. Mantener los gránulos durante 21 días a 37 ° C y 5% de CO 2 .

2. Caracterización de los gránulos condrogénicos por tinción

  1. Incorporación condrogénica
    1. Antes de empotrar, preparar y fundir la parafina a 58 ° C.
    2. Fijar los pellets en 1 mL de paraformaldehído al 4% durante 2 h a RT en un tubo de 1,5 mL.
      Precaución: Paraformaldehído es altamente tóxico. Evite el contacto con los ojos, la piel o las membranas mucosas. Minimizar la exposición y evitar la inhalación mientras se prepara.
    3. Coloque una capa de gasa sobre el cassette y transfiera los gránulos fijos usando una pipeta. Cubrir el pellet doblando thColoque la gasa y cierre la tapa del cassette.
    4. Inicie la deshidratación en 100 ml de etanol al 70% (EtOH) dos veces, 10 min cada uno. Deshidratar los gránulos a través de lavados secuenciales de 10 minutos en EtOH al 80% y al 95%.
    5. Transferir los gránulos a EtOH al 100% durante 10 min. Repetir tres veces con EtOH fresco.
    6. Para "limpiar", se cambia la solución por una mezcla 100: 1 de EtOH y xileno 1: 1, seguido de una mezcla 1: 2 de EtOH y xileno durante 10 min cada uno. Borrar el EtOH restante incubando los gránulos dos veces en 100% xileno, 10 min cada uno.
    7. Para la infiltración de parafina, incubar los pellets en xileno secuencial y mezclas de parafina. Realizar todo el proceso de infiltración de parafina a 58 ° C. Incubar los pellets en 100 ml de una mezcla 2: 1 de xileno y parafina durante 30 min.
    8. Se cambia la solución por 100 ml de una mezcla 1: 1 de xileno y parafina e incuba durante 30 min.
    9. Se cambia la solución por 100 ml de una mezcla 1: 2 de xileno y parafina y se incuba durante 30 min.
    10. Para la infiltración final, transferir los gránulos al primer baño de parafina al 100% e incubar durante 2 h.
    11. Transferir los gránulos al segundo baño de parafina al 100% e incubar O / N a 58 ° C.
    12. Al día siguiente, suavemente transferir los gránulos a un molde con una pinza. Agregue parafina al molde del dispensador de parafina. Solidificar la parafina durante 30 minutos a 4 ° C.
    13. Corte las secciones a 7 μm y transfiera las secciones sobre la diapositiva. Deje que los portaobjetos se sequen durante la noche y guarde los portaobjetos a RT hasta que estén listos para su uso.
  2. Preparación de la diapositiva
    1. Desparafinar los portaobjetos moviéndolos a través de 100 ml de EtOH al 100%, 90%, 80% y 70% secuencialmente durante 5 min cada uno.
    2. Coloque los portaobjetos en un frasco de vidrio y enjuague con agua del grifo durante 5 min.
  3. Tinción azul Alcian
    1. Incubar los portaobjetos en 50 ml de solución de azul alciano al 1% durante 30 min.
      NOE: El azul de Alcian se diluye en una solución de ácido acético al 3%. Ajustar el pH a 2,5 utilizando ácido acético.
    2. Coloque los portaobjetos en un frasco de vidrio y enjuague con agua del grifo durante 2 min.
    3. Enjuague los portaobjetos en agua desionizada (DW) y contraste con una solución nuclear de color rojo rápido durante 2 min.
    4. Coloque las diapositivas en un frasco de vidrio y enjuague con agua del grifo durante 1 minuto.
    5. 2.3.5) Proceda a deshidratar y montar los portaobjetos en el paso 2.6.
  4. Tinción con azul de toluidina
    1. Incubar los portaobjetos en 50 ml de solución de azul de toluidina durante 4 min.
    2. Coloque los portaobjetos en un frasco de vidrio y enjuague con agua del grifo durante 5 min.
    3. Proceda a deshidratar y montar los portaobjetos en el paso 2.6.
  5. Tinción inmunohistoquímica
    1. Incubar las diapositivas en H 2 O 2 al 3% durante 15 min para bloquear la peroxidasa endógena.
    2. Aplicar 200 μl de anticuerpo primario (anti-COL1A1 y -COL2A1) diluido 1: 100 en tris-bu(TBS) conteniendo 1% de albúmina de suero bovino (BSA) y 5% de suero normal de cabra (NGS) a los portaobjetos e incubar O / N a 4 ° C.
    3. Al día siguiente, coloque los portaobjetos en un frasco de vidrio y lávelos con 50 mL de TBS conteniendo 0,1% de polisorbato 20 (TBST) tres veces durante 5 min cada uno.
    4. Aplicar 200 μl de anticuerpo secundario (anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo, diluido 1: 200 en TBS que contiene BSA al 1% y NGS al 5%) a las placas e incubar a RT durante 40 min.
    5. Colocar los portaobjetos en un frasco de vidrio y lavarlos tres veces con 50 mL, 5 min cada uno.
    6. Para la amplificación de la señal, aplique la solución de estreptavidina conjugada con HRP a los portaobjetos e incube durante 10 min.
    7. Colocar los portaobjetos en un frasco de vidrio y lavarlos tres veces con 50 mL, 5 min cada uno.
    8. Mezclar la solución de sustrato DAB-peroxidasa, aplicar 200 μL de solución a cada diapositiva e incubar durante 1 min.
    9. Coloque los portaobjetos en un frasco de vidrio y enjuague con agua del grifo durante 5 min.
    10. ContracolorCon hematoxilina de Mayer durante 1 min.
    11. Lave las diapositivas con DW.
    12. Proceda a deshidratar y montar los portaobjetos en el paso 2.6.
  6. Deshidratación y montaje
    1. Deshidrate los portaobjetos moviéndolos secuencialmente a través de 100 mL de EtOH al 70%, 80%, 90% y 100%, cada 30 segundos.
    2. Sumerja los portaobjetos en dos cambios de xileno durante 1 minuto cada uno.
    3. Agregue 50 μl de solución de montaje a los cubreobjetos y coloque los portaobjetos en la parte superior.

Resultados

En este estudio, hemos generado gránulos condrogénicos de CBMC-hiPSCs por inducir las células de extracción de EBs. La diferenciación condrogénica se indujo utilizando CBMC-HiPSCs con confirmada alta pluripotencia [ 11] . Un esquema simple de nuestro protocolo se muestra en la Figura 1A . Antes de la diferenciación, las colonias de iPSC se expandieron ( Figura 1B ). Los iPSCs ampliado se ensamblaro...

Discusión

Este protocolo generó con éxito HiPSCs de CBMCs. Se reprogramaron CBMCs a hiPSCs utilizando un vector viral Sendai que contiene Yamanaka factores [ 24] . Tres casos se utilizaron en la diferenciación, y todos los experimentos generados con éxito chondrogenic pellets utilizando este protocolo. Numerosos estudios han informado de protocolos para la diferenciación de hiPSCs en condrocitos 25 , 26 , 27 ...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por una subvención del proyecto de I + D de Tecnología Sanitaria de Corea, Ministerio de Salud, Bienestar y Asuntos Familiares, República de Corea (HI16C2177).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Plasticware
100 mm DishTPP93100
6-well PlateTPP92006
50 mL Cornical TubeSPL50050
15 mL Cornical TubeSPL50015
10 mL Disposable PipetteFalcon7551
5 mL Disposable PipetteFalcon7543
12-well PlateTPP92012
NameCompanyCatalog NumberDescription
E8 Medium Materials
DMEM/F12, HEPESLife Technologies11330-057E8 Medium (500 mL)
Sodium BicarbonateLife Technologies25080-094E8 Medium (Conc.: 543 μg/mL)
Sodium SeleniteSigma AldrichS5261E8 Medium  (Conc.: 14 ng/mL)
Human TransfferinSigma AldrichT3705E8 Medium (Conc.: 10.7 μg/mL)
Basic FGF2Peprotech100-18BE8 Medium  (Conc.: 100 ng/mL)
Human InsulinLife Technologies12585-014E8 Medium (Conc.: 20 μg/mL)
Human TGFβ1Peprotech100-21E8 Medium (Conc.: 2 ng/mL)
Ascorbic AcidSigma AldrichA8960E8 Medium  (Conc.: 64 μg/mL)
DPBSLife Technologies14190-144
VitronectinLife TechnologiesA14700
ROCK InhibitorSigma AldrichY0503
NameCompanyCatalog NumberDescription
Quality Control Materials
18 mm Cover GlassSuperiorHSU-0111580
4% ParaformaldyhydeTech & InnovationBPP-9004
Triton X-100BIOSESANG9002-93-1
Bovine Serum AlbuminVector LabSP-5050
Anti-SSEA4 AntibodyMilliporeMAB4304
Anti-Oct4 AntibodySanta CruzSC9081
Anti-TRA-1-60 AntibodyMilliporeMAB4360
Anti-Sox2 AntibodyBiolegend630801
Anti-TRA-1-81 AntibodyMilliporeMAB4381
Anti-Klf4 AntibodyAbcamab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibodyMolecular ProbeA11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibodyMolecular ProbeA11037
DAPIMolecular ProbeD1306
Prolong gold antifade reagentInvitrogenP36934
4% ParaformaldyhydeTech & InnovationBPP-9004
Tween 20BIOSESANGT1027
Bovine Serum AlbuminVector LabSP-5050
Anti-Collagen II antibodyabcam ab347121:100
Alcian blueSigma AldrichA3157-10G
Fast Green FCFSigma AldrichF7252-25G
Safranin OSigma Aldrich090m0039v
Nuclear fast redAmericanmastertechSTNFR100 
xyleneDuksan115 
EthanolDuksan64-17-5
Mayer's hematoxylin solutionwako pure chemical industriesLAK7534
DAPVECTOR LABORATORIESSK-4100
Slide Glass, CoatedHyun Il Lab-MateHMA-S9914
TrizolInvitrogen15596-018
ChloroformSigma Aldrich366919
IsoprypylalcoholMillipore109634
EthanolDuksan64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kitThermo ScientficK1622
NameCompanyCatalog NumberDescription
Chondrogenic Differentiation Materials
DMEMLife Technologies11885Chondrogenic media component (500 mL)
Penicilin StreptomycinLife TechnologiesP4333Chondrogenic media component (Conc.: 1%)
Ascorbic AcidSigma AldrichA8960Chondrogenic media component (Conc.: 64 μg/mL) 
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)Life Technologies11140-050Chondrogenic media component (Conc.: 100 mM)
rhBMP-2R&D355-BM-050Chondrogenic media component (Conc.:100 ng/ml)
Recombinant Hman TGF-beta3R&D243-B3-002Chondrogenic media component (Conc.:10 ng/ml)
KnockOut Serum ReplacementLife Technologies10828-028Chondrogenic media component (Conc.: 1%)
ITS+ PremixBD354352Chondrogenic media component (Conc.: 1%)
Dexamethasone-Water Soluble Sigma AldrichD2915-100MGChondrogenic media component (Conc.:10-7 M)
GlutaMAX SupplementLife Technologies35050-061Chondrogenic media component (Conc.: 1%)
Sodium pyruvate solutionSigma AldrichS8636Chondrogenic media component (Conc.: 1%)
L-ProlineSigma AldrichP5607-25GChondrogenic media component (40 μg/ml)

Referencias

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