Chondrogene Pelletbildung aus Cord Blut-induzierten induzierten pluripotenten Stammzellen

Zusammenfassung

Hier schlagen wir ein Protokoll für die chondrogene Differenzierung von Nervenblut mononuklearen Zell-abgeleiteten menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen vor.

Zusammenfassung

Der menschliche Knorpelknorpel fehlt die Fähigkeit, sich selbst zu reparieren. Knorpeldegeneration wird also nicht durch kurative, sondern durch konservative Behandlungen behandelt. Derzeit werden Anstrengungen unternommen, um beschädigten Knorpel mit ex vivo expandierten Chondrozyten oder Knochenmark-abgeleiteten mesenchymalen Stammzellen (BMSCs) zu regenerieren. Die eingeschränkte Lebensfähigkeit und Instabilität dieser Zellen begrenzen jedoch ihre Anwendung bei der Knorpelrekonstruktion. Menschliche induzierte pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) haben wissenschaftliche Aufmerksamkeit als neue Alternative für regenerative Anwendungen erhalten. Mit unbegrenzter Selbsterneuerungsfähigkeit und Multipotenz wurden hiPSCs als neue Ersatzzellenquelle für die Knorpelreparatur hervorgehoben. Allerdings ist die Erlangung einer hohen Menge an hochwertigen chondrogenen Pellets eine große Herausforderung für ihre klinische Anwendung. In dieser Studie verwendeten wir Embryoidkörper (EB) -geleitete Auswuchszellen für die chondrogene Differenzierung. Die erfolgreiche Chondrogenese wurde durch PCR undD-Färbung mit alcianblauem, Toluidinblau und Antikörpern gegen Kollagenarten I und II (COL1A1 bzw. COL2A1). Wir bieten eine detaillierte Methode zur Differenzierung von Nervenblutmononukleären Zellen-abgeleiteten iPSCs (CBMC-hiPSCs) in chondrogene Pellets.

Einleitung

Die Verwendung von hiPSCs stellt eine neue Strategie für Arzneimittel-Screening und mechanistische Studien verschiedener Krankheiten dar. Aus einer regenerativen Perspektive sind hiPSCs auch eine potentielle Quelle für den Ersatz von beschädigten Geweben, die eine begrenzte Heilfähigkeit aufweisen, wie z.B. Gelenkknorpel ^{1 , 2} .

Die Regeneration des nativen Knorpelknorpels ist seit Jahrzehnten eine Herausforderung. Gelenkknorpel ist ein weiches, weißes Gewebe, das das Ende der Knochen beschichtet und sie vor Reibung schützt. Allerdings hat es begrenzte regenerative Fähigkeit, wenn beschädigt, die Selbst-Reparatur fast unmöglich macht. Daher ist die Forschung über die Knorpelregeneration seit mehreren Jahrzehnten im Gange.

Bisher wurde in vitro die Differenzierung in die chondrogene Linie üblicherweise mit BMSCs oder nativen Chondrozyten durchgeführt, die aus dem Kniegelenk isoliert wurden ³ . Fällig tO ihr chondrogenes Potenzial, BMSCs und native Chondrozyten haben zahlreiche Verdienste, die ihre Verwendung in der Chondrogenese unterstützen. Wegen ihrer begrenzten Ausdehnung und ihres instabilen Phänotyps stehen diese Zellen jedoch vor einer Einschränkung bei der Rekonstruktion von Gelenkknorpeldefekten. Unter in vitro- Kulturbedingungen neigen diese Zellen dazu, ihre eigenen Eigenschaften nach 3-4 Passagen zu verlieren, was schließlich ihre Differenzierungsfähigkeit beeinflusst ⁴ . Auch bei nativen Chondrozyten ist bei der Gewinnung dieser Zellen eine zusätzliche Schädigung des Kniegelenks unvermeidlich.

Im Gegensatz zu BMSCs oder nativen Chondrozyten können sich hiPSCs in vitro unendlich erweitern. Mit den richtigen Kulturbedingungen haben hiPSCs ein großes Potenzial als Ersatzquelle für die chondrogene Differenzierung. Allerdings ist es schwierig, die intrinsischen Eigenschaften von hiPSCs ⁵ zu ändern. Darüber hinaus dauert es mehrere komplizierte in vitro stePs, um das Schicksal von hiPSCs auf einen bestimmten Zelltyp zu lenken. Trotz dieser Komplikationen wird die Verwendung von hiPSCs aufgrund ihrer hohen Selbsterneuerungsfähigkeiten und ihrer Fähigkeit, in zielgerichtete Zellen, einschließlich Chondrozyten, zu differenzieren, noch empfohlen.

Die chondrogene Differenzierung erfolgt üblicherweise mit dreidimensionalen Kultursystemen wie der Pelletkultur oder der Mikromassenkultur unter Verwendung von MSC-ähnlichen Progenitorzellen. Bei der Verwendung von hiPSCs unterscheidet sich das Protokoll zur Erstellung von MSC-ähnlichen Progenitorzellen von den vorhandenen Protokollen. Einige Gruppen verwenden eine Monolayer-Kultur von hiPSCs, um den Phänotyp direkt in MSC-ähnliche Zellen umzuwandeln ⁷ . Allerdings verwenden die meisten Studien EBs, um Auswuchszellen zu erzeugen, die den MSCs ^{8 , 9 , 10 , 11} ähneln.

Verschiedene Arten von Wachstumsfaktoren werden verwendet, um Chondroge zu induzierenNesis Normalerweise werden BMP- und TGF & bgr; -Familie-Proteine ​​allein oder in Kombination verwendet. Die Differenzierung wurde auch mit anderen Faktoren wie GDF5, FGF2 und IGF1 ^{12 , 13 , 14 , 15} induziert. Es wurde gezeigt, dass TGFβ1 die Chondrogenese dosisabhängig in MSCs ¹⁶ stimuliert. Im Vergleich zum anderen Isotyp induziert TGF & bgr; 3, TGF & bgr; 1 die Chondrogenese durch Erhöhung der Mortochymal-Zellkondensation vor dem Knorpel. TGF & bgr; 3 induziert die Chondrogenese durch signifikante Erhöhung der mesenchymalen Zellproliferation ¹⁷ . Allerdings wird TGFβ3 häufiger von Forschern als TGFβ1 ^{7 , 10 , 18 , 19} verwendet. BMP2 verstärkt die Expression von Genen, die mit den chondrogenen Matrixkomponenten im Menschen zusammenhängenArtikuläre Chondrozyten unter in vitro Bedingungen ²⁰ . BMP2 erhöht die Expression von Genen, die für die Knorpelbildung in MSCs in Kombination mit TGFβ-Proteinen kritisch sind. Es wurde auch gezeigt, dass BMP2 die Wirkung von TGF & bgr; 3 durch die Smad- und MAPK-Wege ²² synergistisch verstärkt.

In dieser Studie wurden CBMC-hiPSCs in EBs unter Verwendung von EB-Medium in einer Petrischale mit geringer Anlagerung aggregiert. Auswuchszellen wurden durch Anbringen der EBs an eine mit Gelatine beschichtete Schale induziert. Die chondrogene Differenzierung unter Verwendung von Auswuchszellen wurde durch Pelletkultur durchgeführt. Die Behandlung mit sowohl BMP2 als auch TGFβ3 kondensierte erfolgreich die Zellen und induzierte extrazelluläre Matrix (ECM) Protein-Akkumulation für die chondrogene Pelletbildung. Diese Studie schlägt ein einfaches, aber effizientes chondrogenes Differenzierungsprotokoll unter Verwendung von CBMC-hiPSCs vor.

Protokoll

Dieses Protokoll wurde vom institutionellen Überprüfungsausschuss der katholischen Universität von Korea (KC12TISI0861) genehmigt. CBMCs, die für die Umprogrammierung verwendet wurden, wurden direkt von der Cord Blood Bank des Seoul St. Mary's Hospital erhalten.

1. Chondrogene Differenzierung von iPSCs

1. CBMC-iPSC Generation
   1. Generiere CBMC-hiPSCs mit dem in unserer vorherigen Arbeit gezeigten Protokoll ²³ .
   2. Sammle die Blutzellen in einem 15 ml konischen Röhrchen und zähle sie mit einem Hämocytometer.
   3. 3 x 10 ⁵ Zellen vorbereiten und 5 min bei 515 xg und RT zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand durch Absaugen und resuspendieren die Zellen in 0,5 ml Blutzellmedium.
   4. Übertragen Sie die Zellen auf eine Vertiefung einer nicht beschichteten 24-Well-Platte und fügen Sie die Sendai-Virus-Mischung hinzu, nach den Empfehlungen des Herstellers.
   5. Zentrifugieren Sie die Platte für 30 min bei 1.150 xg und 30 ° C.
   6. AchternEr zentrifugieren, die Zellen über Nacht (O / N) bei 37 ° C in 5% CO ₂ inkubieren.
   7. Am nächsten Tag übertragen Sie die transduzierten Zellen in eine Matrix-beschichtete Quelle. Zentrifugieren Sie die Platte bei 1.150 xg für 30 min bei 30 ° C.
   8. Nach der Zentrifugation den Überstand entfernen, 1 ml iPSC-Medium zugeben und die Zellen O / N bei 37 ° C in 5% CO ₂ aufbewahren.
   9. Halten Sie die angehefteten Zellen bei 37 ° C und 5% CO ₂ . Ändern Sie das Medium täglich und ersetzen Sie es mit frischem iPSC-Medium.
      ANMERKUNG: Kolonien erscheinen am Tag 14-21 nach der Transduktion.
2. EB-Erzeugung
   1. Halten Sie die HIPSCs bei 37 ° C und 5% CO ₂ . Ändern Sie das Medium täglich und ersetzen Sie es mit frischem Essential 8 (E8) Medium.
   2. 2 x 10 ⁶ hiPSCs in einer vitronectinbeschichteten, 100-mm-Schale in E8-Medium vorbereiten.
   3. Das E8-Medium aus der Kulturschale nehmen und mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) waschen.
   4. Hinzufügen 1Ml 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) gelöst und bei 37 ° C und 5% CO ₂ für 2 min inkubiert.
   5. Die Zellen mit 3 ml E8-Medium ernten und in ein neues 15-ml-Kegelrohr überführen. Die Zellen bei 250 xg bei Raumtemperatur (RT) für 2 min zentrifugieren.
   6. Ansaugen des Überstandes, ohne das Zellpellet zu stören und die Zellen in 5 ml E8-Medium zu resuspendieren.
   7. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämocytometer und bereiten 2 x 10 ⁶ Zellen für jede 100 mm Petrischale vor. Die vorbereiteten Zellen in einer 10-ml-Mischung aus E8- und EB-Medium (1: 1) mit 10 μM Rho-assoziiertem Kinase (ROCK) -Inhibitor resuspendieren.
   8. Inkubieren der Zellen O / N für die Aggregation bei 37 ° C und 5% CO ₂ .
   9. Am nächsten Tag ernten Sie die aggregierten EBs durch Pipettieren. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 250 xg für 1 min. Den Überstand entfernen und die EBs in 10 ml frischem E8-Medium resuspendieren.
   10. Vergrößere die erzeugten EBs für 5 Tage, tägliche Änderungen mit fresH E8 mittel. Zur weiteren Reifung wechseln Sie das Kulturmedium auf E7-Medium. Halten Sie die EBs bei 37 ° C und 5% CO ₂ für weitere 5 Tage, wobei täglich mittlere Veränderungen mit frischem E7-Medium durchgeführt werden.
       HINWEIS: E7-Medium ist E8-Medium ohne FGF2.
3. Auswuchszell-Induktion von EBs
   1. Füge 6 ml 1% ige Gelatine zu einer 100-mm-Schale hinzu und inkubiere bei 37 ° C und 5% CO ₂ für 30 min.
   2. Entfernen Sie die Gelatine und trocknen Sie die Schale für 2-3 Stunden vor Gebrauch.
   3. Übertragen Sie die EBs auf ein 50-ml-Kegelrohr. Lassen Sie die EBs auf den Boden des konischen Rohres absetzen. Entfernen Sie den Überstand, ohne die EBs zu stören.
   4. Die EBs in 10 ml Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) mit 20% fötalem Rinderserum (FBS) resuspendieren. Übertragen Sie die EBs auf die Gelatine-beschichtete, 100-mm-Schale. 10 μM ROCK-Inhibitor hinzufügen.
   5. Inkubieren und pflegen die Zellen bei 37 ° C und 5% CO ₂ für 7 Tage. Ändere michDium jeden zweiten Tag ohne Zugabe von ROCK-Inhibitor.
4. Chondrogene Pelletbildung
   1. Das Kulturmedium aus der Schale einatmen und die Zellen dreimal mit PBS waschen.
   2. 1 ml 1 mM EDTA auftragen und bei 37 ° C und 5% CO ₂ für 2 min inkubieren.
   3. Die Zellen mit 5 ml DMEM mit 20% FBS ernten und in ein neues 15-ml-Kegelrohr überführen.
   4. Die Zellen für 2 min bei 250 xg und RT zentrifugieren. Den Überstand verwerfen und das Pellet in 10 ml DMEM mit 20% FBS resuspendieren.
   5. Filter und entsorgen Sie die Zellklumpen mit einem 40 μm Zellsieb und ernten Sie die einzelnen Zellen. Zähle die einzelnen Zellen mit einem Hämocytometer.
   6. Die Zellen für 2 min bei 250 xg und RT zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und säen Sie 3 x 10 ⁵ Zellen pro Pellet in einem 15 ml konischen Röhrchen mit 300 μl chondrogenem Differenzierungsmedium (CDM).
   7. Zur Pelletbildung zentrifugieren die Zellen für 5 min bei680 xg und RT.
      ANMERKUNG: Pellets werden in 15 ml konischen Rohren während der Differenzierung der chondrogenen Pellets gehalten.
   8. Inkubieren der Zellen über Nacht bei 37 ° C und 5% CO ₂ .
   9. Ändern Sie das CDM alle 2-3 Tage. Innerhalb von 3 Tagen werden Pellets abgeflachte, sphäroidische Morphologien aufweisen. Halten Sie die Pellets für 21 Tage bei 37 ° C und 5% CO ₂ .

2. Chondrogene Pelletcharakterisierung durch Färbung

1. Chondrogene Einbettung
   1. Vor dem Einbetten, Vorbereiten und Schmelzen von Paraffin bei 58 ° C.
   2. Fixieren Sie die Pellets in 1 ml 4% Paraformaldehyd für 2 h bei RT in einem 1,5 ml-Röhrchen.
      Achtung: Paraformaldehyd ist hochgiftig. Vermeiden Sie Kontakt mit Augen, Haut oder Schleimhäuten. Minimieren Sie die Belichtung und vermeiden Sie das Einatmen bei der Vorbereitung.
   3. Legen Sie eine Schicht Gaze auf die Kassette und übertragen Sie die festen Pellets mit einer Pipette. Decken Sie das Pellet durch FaltenE gauze und den Kassettendeckel schließen.
   4. Die Dehydratation in 100 ml 70% igem Ethanol (EtOH) zweimal, jeweils 10 min, einleiten. Dehydrieren der Pellets durch aufeinanderfolgende 10-minütige Waschungen in 80% und 95% EtOH.
   5. Übertragen Sie die Pellets auf 100% EtOH für 10 min. Wiederholen Sie dreimal mit frischem EtOH.
   6. Zur "Klärung" wird die Lösung für eine 100 ml, 1: 1 Mischung aus EtOH und Xylol ausgetauscht, gefolgt von einem 1: 2-Gemisch aus EtOH und Xylol für jeweils 10 min. Das restliche EtOH durch zweimaliges Inkubieren der Pellets in 100% Xylol, jeweils 10 min, abkühlen lassen.
   7. Zur Paraffininfiltration inkubieren die Pellets in aufeinanderfolgenden Xylol- und Paraffingemischen. Führen Sie den gesamten Paraffin-Infiltrationsprozess bei 58 ° C durch. Inkubieren Sie die Pellets in 100 ml einer 2: 1 Mischung aus Xylol und Paraffin für 30 min.
   8. Austausch der Lösung für 100 ml einer 1: 1 Mischung aus Xylol und Paraffin und inkubieren für 30 min.
   9. Austausch der Lösung für 100 ml einer 1: 2-Mischung aus Xylol und Paraffin und inkubieren für 30 min.
   10. Für die endgültige Infiltration, übertragen Sie die Pellets auf das erste Bad von 100% Paraffin und inkubieren für 2 h.
   11. Übertragen Sie die Pellets auf das zweite Bad von 100% Paraffin und inkubieren Sie O / N bei 58 ° C.
   12. Am nächsten Tag transportiere man die Pellets sanft mit einer Pinzette in eine Form. Fügen Sie Paraffin der Form aus dem Paraffinspender hinzu. Das Paraffin für 30 min bei 4 ° C festigen.
   13. Die Abschnitte auf 7 μm schneiden und die Abschnitte auf die Folie überführen. Lassen Sie die Objektträger über Nacht trocknen und lagern Sie die Folien auf RT, bis sie gebrauchsfertig sind.
2. Folienvorbereitung
   1. Deparaffinieren Sie die Objektträger, indem Sie sie durch 100 ml von 100%, 90%, 80% und 70% EtOH nacheinander für jeweils 5 min bewegen.
   2. Legen Sie die Objektträger in ein Glasgefäß und spülen Sie mit Leitungswasser für 5 min.
3. Alcian blaue Färbung
   1. Inkubieren Sie die Objektträger in 50 ml einer 1% alcianblauen Lösung für 30 min.
      NICHTE: Alcianblau wird in 3% iger Essigsäurelösung verdünnt. Den pH-Wert mit Acetinsäure auf 2,5 einstellen.
   2. Legen Sie die Objektträger in ein Glasglas und spülen Sie mit Leitungswasser für 2 min.
   3. Spülen Sie die Folien in deionisiertem Wasser (DW) und Gegenfärbung mit nuklearer schneller roter Lösung für 2 min.
   4. Legen Sie die Objektträger in ein Glasgefäß und spülen Sie mit Leitungswasser für 1 min.
   5. 2.3.5) Um die Folien in Schritt 2.6 zu dehydrieren und zu montieren,
4. Toluidin-Blau-Färbung
   1. Inkubieren von Objektträgern in 50 ml Toluidinblau-Lösung für 4 min.
   2. Legen Sie die Objektträger in ein Glasgefäß und spülen Sie mit Leitungswasser für 5 min.
   3. Fahren Sie mit der Entwässerung und Montage der Folien in Schritt 2.6 fort.
5. Immunhistochemische Färbung
   1. Inkubieren Sie die Objektträger in 3% H ₂ O ₂ für 15 min für endogene Peroxidase-Blockierung.
   2. Tragen Sie 200 μl Primärantikörper (anti-COL1A1 und -COL2A1), verdünnt 1: 100 in Tris-bu(TBS), enthaltend 1% Rinderserumalbumin (BSA) und 5% normales Ziegenserum (NGS) zu den Objektträgern und inkubieren O / N bei 4 ° C.
   3. Am nächsten Tag legen Sie die Objektträger in ein Glasgefäß und waschen sie mit 50 ml TBS, die 0,1% Polysorbat 20 (TBST) dreimal für jeweils 5 min enthält.
   4. Tragen Sie 200 μl Sekundärantikörper (Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper, verdünnt 1: 200 in TBS mit 1% BSA und 5% NGS) auf die Objektträger und inkubieren bei RT für 40 min.
   5. Legen Sie die Objektträger in ein Glasgefäß und waschen Sie sie dreimal mit 50 ml, jeweils 5 min.
   6. Zur Signalverstärkung die HRP-konjugierte Streptavidin-Lösung auf die Objektträger auftragen und 10 min inkubieren.
   7. Legen Sie die Objektträger in ein Glasgefäß und waschen Sie sie dreimal mit 50 ml, jeweils 5 min.
   8. Die DAB-Peroxidase-Substratlösung mischen, 200 μl Lösung auf jede Folie auftragen und 1 min inkubieren.
   9. Legen Sie die Objektträger in ein Glasgefäß und spülen Sie mit Leitungswasser für 5 min.
   10. GegenschlagMit Mayers Hämatoxylin für 1 min.
   11. Waschen Sie die Folien mit DW.
   12. Fahren Sie mit der Entwässerung und Montage der Folien in Schritt 2.6 fort.
6. Dehydrierung und Montage
   1. Dehydrieren Sie die Objektträger, indem Sie sie nacheinander durch 100 ml 70%, 80%, 90% und 100% EtOH, jeweils 30 s, bewegen.
   2. Tauchen Sie die Folien in zwei Änderungen von Xylol für jeweils 1 min.
   3. Fügen Sie 50 μl Montagelösung zu den Deckgläsern hinzu und legen Sie die Folien auf die Oberseite.

Ergebnisse

In dieser Studie erzeugten wir chondrogene Pellets aus CBMC-hiPSCs, indem sie Auswuchszellen aus EBs induzierten. Die chondrogene Differenzierung wurde mit CBMC-hiPSCs mit bestätigter hoher Pluripotenz induziert ¹¹ . Ein einfaches Schema unseres Protokolls ist in Fig. 1A gezeigt . Vor der Differenzierung wurden iPSC-Kolonien erweitert (Abbildung 1B ). Die erweiterten iPSCs wurden als EBs zusammengesetzt,...

Diskussion

Dieses Protokoll hat erfolgreich HIPSCs von CBMCs generiert. Wir programmierten CBMCs zu hiPSCs unter Verwendung eines Sendai Virusvektors, der Yamanaka Faktoren enthält ²⁴ . Drei Fälle wurden in der Differenzierung verwendet, und alle Experimente erzeugten erfolgreich chondrogene Pellets unter Verwendung dieses Protokolls. Zahlreiche Studien haben Protokolle für die Differenzierung von hiPSCs in Chondrozyten ^{25 , 26 ,}

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasticware
100 mm Dish	TPP	93100
6-well Plate	TPP	92006
50 mL Cornical Tube	SPL	50050
15 mL Cornical Tube	SPL	50015
10 mL Disposable Pipette	Falcon	7551
5 mL Disposable Pipette	Falcon	7543
12-well Plate	TPP	92012
Name	Company	Catalog Number	Description
E8 Medium Materials
DMEM/F12, HEPES	Life Technologies	11330-057	E8 Medium (500 mL)
Sodium Bicarbonate	Life Technologies	25080-094	E8 Medium (Conc.: 543 μg/mL)
Sodium Selenite	Sigma Aldrich	S5261	E8 Medium  (Conc.: 14 ng/mL)
Human Transfferin	Sigma Aldrich	T3705	E8 Medium (Conc.: 10.7 μg/mL)
Basic FGF2	Peprotech	100-18B	E8 Medium  (Conc.: 100 ng/mL)
Human Insulin	Life Technologies	12585-014	E8 Medium (Conc.: 20 μg/mL)
Human TGFβ1	Peprotech	100-21	E8 Medium (Conc.: 2 ng/mL)
Ascorbic Acid	Sigma Aldrich	A8960	E8 Medium  (Conc.: 64 μg/mL)
DPBS	Life Technologies	14190-144
Vitronectin	Life Technologies	A14700
ROCK Inhibitor	Sigma Aldrich	Y0503
Name	Company	Catalog Number	Description
Quality Control Materials
18 mm Cover Glass	Superior	HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde	Tech & Innovation	BPP-9004
Triton X-100	BIOSESANG	9002-93-1
Bovine Serum Albumin	Vector Lab	SP-5050
Anti-SSEA4 Antibody	Millipore	MAB4304
Anti-Oct4 Antibody	Santa Cruz	SC9081
Anti-TRA-1-60 Antibody	Millipore	MAB4360
Anti-Sox2 Antibody	Biolegend	630801
Anti-TRA-1-81 Antibody	Millipore	MAB4381
Anti-Klf4 Antibody	Abcam	ab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11037
DAPI	Molecular Probe	D1306
Prolong gold antifade reagent	Invitrogen	P36934
4% Paraformaldyhyde	Tech & Innovation	BPP-9004
Tween 20	BIOSESANG	T1027
Bovine Serum Albumin	Vector Lab	SP-5050
Anti-Collagen II antibody	abcam	ab34712	1:100
Alcian blue	Sigma Aldrich	A3157-10G
Fast Green FCF	Sigma Aldrich	F7252-25G
Safranin O	Sigma Aldrich	090m0039v
Nuclear fast red	Americanmastertech	STNFR100
xylene	Duksan	115
Ethanol	Duksan	64-17-5
Mayer's hematoxylin solution	wako pure chemical industries	LAK7534
DAP	VECTOR LABORATORIES	SK-4100
Slide Glass, Coated	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
Chloroform	Sigma Aldrich	366919
Isoprypylalcohol	Millipore	109634
Ethanol	Duksan	64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit	Thermo Scientfic	K1622
Name	Company	Catalog Number	Description
Chondrogenic Differentiation Materials
DMEM	Life Technologies	11885	Chondrogenic media component (500 mL)
Penicilin Streptomycin	Life Technologies	P4333	Chondrogenic media component (Conc.: 1%)
Ascorbic Acid	Sigma Aldrich	A8960	Chondrogenic media component (Conc.: 64 μg/mL)
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Life Technologies	11140-050	Chondrogenic media component (Conc.: 100 mM)
rhBMP-2	R&D	355-BM-050	Chondrogenic media component (Conc.:100 ng/ml)
Recombinant Hman TGF-beta3	R&D	243-B3-002	Chondrogenic media component (Conc.:10 ng/ml)
KnockOut Serum Replacement	Life Technologies	10828-028	Chondrogenic media component (Conc.: 1%)
ITS+ Premix	BD	354352	Chondrogenic media component (Conc.: 1%)
Dexamethasone-Water Soluble	Sigma Aldrich	D2915-100MG	Chondrogenic media component (Conc.:10-7 M)
GlutaMAX Supplement	Life Technologies	35050-061	Chondrogenic media component (Conc.: 1%)
Sodium pyruvate solution	Sigma Aldrich	S8636	Chondrogenic media component (Conc.: 1%)
L-Proline	Sigma Aldrich	P5607-25G	Chondrogenic media component (40 μg/ml)