Preparación de muestras para identificación basada en espectrometría de masa de regiones de unión de ARN

Resumen

Se describe un protocolo para identificar proteínas RNA-que atan y mapa de sus regiones de unión de ARN en células vivas usando photocrosslinking mediada por la UV y espectrometría de masas.

Resumen

RNAs noncoding desempeñan papeles importantes en varios procesos nucleares, incluyendo la regulación de la expresión génica, estructura de la cromatina y la reparación del ADN. En la mayoría de los casos, la acción de noncoding RNAs está mediada por proteínas cuyas funciones están reguladas a su vez por estas interacciones con RNAs noncoding. De acuerdo con esto, un número creciente de proteínas involucradas en funciones nucleares se ha divulgado para enlazar RNA y en algunos casos las regiones de unión de ARN de estas proteínas se ha asignado, a menudo a través de métodos laboriosos, basado en el candidato.

Aquí, Divulgamos un protocolo detallado para realizar una alto rendimiento, todo el proteoma identificación imparcial de sus regiones de unión de ARN y proteínas RNA-que atan. La metodología se basa en la incorporación de un análogo en el ARN celular, seguido por reticulación UV-mediado proteína-RNA y los análisis de espectrometría de masas para revelar RNA-reticulado péptidos en el proteoma de uridina fotoreactivos. Aunque Describimos el procedimiento de células madre embrionarias de ratón, el protocolo debe adaptarse fácilmente a una variedad de células cultivadas.

Introducción

El propósito del método RBR-ID es identificar nuevas proteínas de unión a RNA (restrictivas) y mapa de sus regiones de unión a RNA (RBRs) con resolución de péptido-niveles para facilitar el diseño de los mutantes de unión de ARN y la investigación de los biológicos y bioquímicos funciones de las interacciones proteína-RNA.

ARN es único entre biomoléculas como puede actuar como un mensajero lleva la información genética y también doblar en estructuras tridimensionales complejas con funciones bioquímicas más similares a los de las proteínas^1,2. Un cuerpo creciente de evidencia sugiere que RNAs noncoding (ncRNAs) desempeñan papeles importantes en varios genes vías reguladoras y epigenéticos^3,4,5 y, por lo general, estas funciones reguladoras son mediadas en concierto con proteínas que interaccionan específicamente con un determinado RNA. De particular relevancia un conjunto de proteínas de interacción fue identificado recientemente para el ncRNA largo intensamente estudiado (lncRNA) Xist, proporcionando información valiosa sobre cómo este lncRNA interviene en la inactivación del cromosoma x en las células femeninas^{6,7 ,8}. En particular, varias de estas proteínas interactúan Xist no contienen ningún canónica de dominios RNA-que ata⁹, y por lo tanto su actividad de unión de ARN no podía ser predicha en silico basado en su secuencia primaria solamente. Teniendo en cuenta que miles de lncRNAs se expresan en cualquier célula dada¹⁰, es razonable asumir que muchos de ellos pueden actuar vía interacciones con todo ser descubierto proteínas RNA-que atan (restrictivas). Una estrategia experimental para identificar estas nuevas prácticas comerciales restrictivas, por tanto, facilitaría enormemente la tarea de la función biológica de ncRNAs de disección.

Los intentos anteriores para identificar empíricamente restrictivas han dependido de polyA + RNA selección acoplada a espectrometría de masas (MS)^{11,12,13,14,15}. Aunque estos experimentos muchas proteínas ha añadido a la lista de supuestas prácticas comerciales restrictivas, por diseño podría sólo detectan las proteínas a las transcripciones de la cofia. Sin embargo, más pequeño RNAs y muchos lncRNAs no son contra. ^{16 , 17} y sus proteínas interactuantes probablemente habría sido perdidas en estos experimentos. Un estudio reciente aplicado aprendizaje automático a las bases de datos del interactoma de proteínas para identificar proteínas que co purificaron con múltiples prácticas comerciales restrictivas conocidas y demostró que estos socios recurrentes de la RBP tenían más probabilidades de poseer actividades de unión de ARN¹⁸. Sin embargo, este enfoque se basa en la minería de bases de datos existentes de gran interacción y sólo puede identificar proteínas que pueden ser co purificadas en condiciones no desnaturalizantes con prácticas comerciales restrictivas conocidas, excluyendo así a partir del análisis insoluble, embebido en la membrana y escaseado proteínas.

La identificación de una proteína como un bona fide las prácticas comerciales restrictivas a menudo no producen automáticamente información sobre la función biológica o bioquímica de la interacción proteína-RNA. Para abordar este punto, es típicamente conveniente para identificar las proteína dominio y aminoácido residuos implicados en la interacción que mutantes específicos pueden ser diseñados para probar la función de enlace de RNA en el contexto de cada novela RBP^{19, 20}. los esfuerzos anteriores de nuestro grupo y otros han utilizado fragmentos de la proteína recombinante y mutantes de la canceladura identificar RNA binding regiones (RBRs)^19,20,21,22; sin embargo, estos enfoques son intensivas e incompatible con el análisis de alto rendimiento. Más recientemente, un estudio describe una estrategia experimental para actividades de unión de ARN en forma de alto rendimiento usando spectrometry total²³; sin embargo, este enfoque se basó en una selección doble polyA + RNA y llevó así a las mismas limitaciones que los enfoques de identificación de las prácticas comerciales restrictivas descritas anteriormente.

Hemos desarrollado una técnica, denominada RNA enlace región identificación RBR-, que explota a proteína-RNA photocrosslinking y cuantitativo espectrometría de masas para identificar las proteínas y las regiones de la proteína interacción con RNA en células vivas sin hacer hipótesis sobre el estado de poliadenilación del RNA, así como prácticas comerciales restrictivas obligado a polyA-RNAs²⁴. Además, este método se basa exclusivamente en la reticulación tiene ninguÌ n requisito en la solubilidad de la proteína o accesibilidad y es así conveniente para las actividades de unión de ARN dentro de las membranas (por ejemplo, la envoltura nuclear) o compartimentos poco solubles ( por ejemplo, la matriz nuclear). Describimos los pasos experimentales para realizar identificación de RBR para los núcleos de células madre embrionarias de ratón (troncales) pero con pequeñas modificaciones este protocolo debe ser conveniente para una variedad de tipos celulares, que pueden incorporar eficientemente 4SU de la cultura medio.

Protocolo

1. cultura y ampliación de troncales

Nota: las células madre embrionarias del ratón son fáciles de cultura y puede ampliarse rápidamente a los números grandes requeridos experimentos bioquímicos gracias a su rápido tiempo de ciclismo. Troncales saludables doble cada 12 h.

1. Expandir troncales para el número deseado de placas gelatinizadas en mESC medio (véase abajo) en una incubadora de cultivo de tejidos se mantiene a 37 ° C, 5% CO ₂, y > humedad de 95%.
   Nota: Suficiente placas deberían estar preparadas para 3-5 repeticiones biológicas para la + 4SU muestra y control - 4SU. Una placa de 10 cm (es decir, 5 millones de células) es más que suficiente para cada repetición biológica.
2. El medio para troncales se compone de Dulbecco ' s modificado Eagle ' medio s (DMEM) suplementado con 15% suero bovino fetal (FBS), 2 mM L-glutamina, 0,5 x 1 x no esenciales aminoácidos, penicilina/estreptomicina, 100 μm beta-mercaptoetanol, 1.000 U / ml factor inhibidor de leucemia (LIF), μm 3 CHIR99021, 1 μm PD0325901.
3. Antes pases troncales, prepare el número de placas de 10 cm.
   1. Añadir 4 mL de 0.1% de gelatina en agua, asegurándose de que se cubre toda la superficie de la placa; incubar 10 min a temperatura ambiente (RT); retirar gelatina solución.
4. Células de paso al llegar a 10 millones de células por placa, típicamente ~ 48 h después de la inoculación.
   Nota: Como troncales crecen en colonias densas, las placas nunca debe llegar a confluencia 100% como observado en líneas celulares que crecen en monocapas (e.g. HEK293 o las células 3T3). Una placa mESC debe ser pasada al ~ 50% confluente y definitivamente antes del medio se vuelve amarillo.
   1. Para separar las células, lavar las placas con cultivos densos mESC una vez en el 1 x de tampón fosfato salino (PBS) suplementada con 2 mM EDTA, añada 0.05% tripsina disuelto en DMEM y devolver plancha a incubadora durante 5 minutos (37 ° C, 5% CO ₂, y > 95% humedad).
   2. Extraiga la placa de la incubadora y resuspender las células con un volumen igual de DMEM mediante pipeteo arriba y abajo con fuerza varias veces.
   3. Contar las células mediante hemocitómetro y asegurarse de que las células forman una suspensión unicelular (es decir, no hay racimos), luego centrifugar células mezcla 500 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en 1-2 mL DMEM.
   4. Inocular células a una densidad de 10.000 células/cm ² en medio de la mESC (es decir, ~ 800.000 células por placa de 10 cm) mediante las placas recubiertas de gelatina preparadas en el paso 1.3.1.

2. La reticulación de proteínas – interacciones ARN en las células en vivo

Nota: ARN-proteína reticulación está mediada por la foto-activatable ribonucleósido análogo 4-thiouridine (4SU). 4SU tiene un largo máximo de absorbancia que endógeno nucleótidos y sólo puede ser incorporado en el RNA; por lo tanto UVB de longitud de onda intermedia permite selectivamente reticulación RNA a las proteínas ^{25 , 26}. Tratamiento UVB de células tratadas con 4SU conduce a reticulaciones covalentes entre 4SU que contiene ARN y aminoácidos, con una preferencia divulgada por Tyr, Trp, Lys, Met y Cys ²⁷.

1. Troncales de expandir al número requerido de placas de 10 cm como se describe en el paso 1.
   Nota: Suficiente placas deberían estar preparadas para 3-5 repeticiones biológicas para la + 4SU muestra y control - 4SU. Una placa de 10 cm (es decir, 5 millones de células) es suficiente para cada repetición biológica.
2. Antes de que las placas alcanzan confluencia, añadir 4SU directamente en medio a una concentración final de 500 μm. deja - 4SU platos de control sin tratamiento.
3. Placas de agitar suavemente para distribuir el 4SU homogéneo en todo el medio. Volver a la misma incubadora de cultivo de tejidos para 2 h (37 ° C, 5% CO ₂, y > 95% de humedad).
4. Transferencia de placas a un cubo de hielo y deseche el medio.
5. Lavar la placa con 5 mL de PBS helado.
   Nota: Enjuague suavemente o podrían separar células.
6. Añadir 2 mL de helado placas PBS y lugar sin las tapas en un crosslinker equipado con lámparas de emisión de UVB (312 nm). Irradian las placas en una configuración de energía de 1 J/cm ².
   Nota: Es crítico que se quitan las tapas plásticas o podrían proteger las células de la luz UV y evitar la reticulación.
7. Recoger las células mediante elevadores celular y traslado a PBS helado en tubos cónicos. Centrifugar a 2.000 x g durante 5 min, 4 ° C.
8. Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en 5 mL PBS helada con 2 mM EDTA y 0,2 mM phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF).
9. Cuenta las células usando un hemocitómetro. Esperar 5-10 y 10 millones de células de las placas de 10 cm y 15 cm respectivamente.
10. Centrifugar a 2.000 x g durante 5 min, 4 ° C.
    Nota: Concentrados de células pueden utilizarse inmediatamente para el paso 3 o pueden ser flash-congeladas en nitrógeno líquido y almacenados a-80 ° C indefinidamente. Este es un potencial punto de parada.

3. Aislamiento de núcleos

Nota: los núcleos son aislados para eliminar proteínas citoplasmáticas y aumentar la cobertura de las proteínas nucleares. Este paso puede ser reemplazado con otras formas de fraccionamiento celular para el estudio de prácticas comerciales restrictivas en compartimentos celulares diferentes.

1. Preparar helado Buffer (10 mM Tris-HCl pH 7.9, de 4 ° C, 1,5 mM de MgCl ₂, 10 m m KCl). Use por lo menos 2,5 mL por 10 millones de células (como cuentan en el paso 2.9) para la extracción de.
   Nota: Existencias de búfer A (por ejemplo, una botella de 500 mL) se pueden preparar con antelación y almacenar a 4 ° C por 6 meses.
   1. Antes de usar Añadir 0,5 mM Ditiotreitol (DTT) y 0,2 mM PMSF para la cantidad deseada (2,5 mL por 10 millones de células) de búfer helada A.
2. Lavar las células con 2 mL de Buffer A por 10 millones de células. Vuelta a 2.500 x g durante 5 min a 4 ° C.
3. Descartar sobrenadante, agregar Buffer suplementado con 0.2% de un detergente no iónico, no desnaturalizantes, como el octil-fenoxi-polyethoxy-etanol A 500 μl (ver la Tabla de materiales), por 10 millones de células. Gira por 5 min a 4 ° C.
4. Centrifugar a 2.500 x g durante 5 min.
5. Eliminar el sobrenadante, el sedimento compone de núcleos intactos sin citoplasma.
   Nota: Los núcleos pueden utilizar inmediatamente para el paso 4 o flash-congeladas en nitrógeno líquido y almacenados a-80 ° C indefinidamente. Este es un potencial punto de parada.

4. Lisis de núcleos

Nota: reticulado núcleos son lisis en un búfer de espectrometría de masa-compatible para liberar las proteínas y complejos ARN-proteína.

1. Añadir el tampón de lisis (9 M de urea, 100 mM Tris-HCl pH 8.0, de 24 ° C), 200 μL por 10 millones de células. Someter a ultrasonidos para distorsionar la cromatina con un 1/8 " sonda en ajuste de amplitud del 50% para el 5-10 s.
2. Vuelta a 12.000 x g durante 5 minutos y cobrar 175 μl de sobrenadante para evitar que los pellets de.
   Nota: 100 μl se utilizará para los próximos pasos de RBR-ID y el restante 75 μl de lisado puede ser almacenado a-80 ° C para uso posterior o mancha blanca /negra occidental análisis.
3. Concentración de la proteína medida mediante el ensayo de Bradford o similar técnica ²⁸. Diluir la concentración de proteína en las diferentes muestras a 1 mg/mL o la concentración más baja de la muestra utilizando cantidades adecuadas de tampón de lisis.
   Nota: De los núcleos de troncales 10 millones cuentan con 100-200 μg de proteína.

5. Digestión de tripsina

Nota: las proteínas son digeridas para generar péptidos suitable para el análisis de abajo a arriba, espectrometría de masas (MS).

1. TDT añadir solución nuclear lisado (5 mm final); incubar durante 1 h a TA.
2. Añadir Yodoacetamida de acción fresca (14 mM final); incubar por 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
3. Diluir lisado con volumen 5 veces de 50 mM NH ₄ HCO ₃
4. Añadir tripsina (μg proteína: μg tripsina = 200:1); incubar a 37 ° C durante la noche.

6. La desalación de péptidos

1. preparar una punta de etapa por encargo por ejemplo.
   1. 6.1.1. Coloque un disco de material de extracción C18 de fase sólida en la parte inferior de una pipeta de 200 μl.
   2. Añadir 50 μl de oligo R3 invertida resina de fase en la parte superior del disco de C18. Coloque la punta del escenario en centrifugación adaptador y la punta del lugar con el adaptador dentro de un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
   3. Agregar 100 μl 100% acetonitrilo en consejos para lavar. Centrifugar a 1000 x g durante 1 min eliminar el disolvente.
   4. Equilibrar con 50 μl 0.1% de ácido trifluoroacético (TFA). Centrifugar a 1000 x g durante 1 minuto
2. Agregar 100% de ácido fórmico a la muestra digerida la proteína para disminuir el pH a 2-3.
   Nota: Esto debe requerir ~ 5 μL 1 mL de muestra diluida péptido, pero pH deberá ser medido y más fórmico ácido añadido si es necesario.
3. Muestra de la carga en punta de etapa por encargo, centrifugar a 1000 x g durante 1 minuto hasta que todos de la muestra pasa a través de la punta.
4. Lavado obligado péptidos con 50 μl 0.1% TFA. Centrifugar a 1000 x g durante 1 minuto
5. Eluir péptidos mediante la adición de 50 μl de tampón de elución (75% acetonitrilo, 0.025% TFA) a punta del escenario y centrifugar a 1000 x g durante 1 min forzar el buffer de elución de la punta.
6. Seco de la muestra utilizando una centrífuga de vacío a 150 x g y 1-3 kPa para 1 h.
   Nota: Péptidos secas pueden almacenarse a-80 ° C indefinidamente. Este es un potencial punto de parada.

7. Extracción de ARN de reticulado

Nota: tratar de péptidos con nucleasa para eliminar RNA reticulado.

1. Resuspender el precipitado en 50 μl de 2 x de buffer de nucleasa (100 mM NH ₄ HCO ₃, 4 mM de MgCl ₂).
2. Péptido medida concentración usando la absorbancia a 280 nm suponiendo que 1 mg/mL de péptidos para una A ₂₈₀ de 1.
   Nota: La concentración esperada es 1 mg/mL.
3. Ajustar todas las muestras a 1 mg/mL y la concentración más baja con 2 x de buffer de nucleasa.
4. Preparar una mezcla maestra de 50 μl de H ₂ O + nucleasa de alta pureza de 1 μl (≥ 250 U) (consulte la Tabla de materiales) por ejemplo.
5. 50 μl de muestra del péptido y añadir 50 μl de H ₂ O + nucleasa master mix.
6. Incubar a 37 ° C por 1 h. proceda realizar espectrometría de masas.
   Nota: Los péptidos están ahora listos para espectrometría de masas. Pueden ser analizadas inmediatamente o almacenadas a-80 ° C indefinidamente. Este es un potencial punto de parada.

8. Nano de la cromatografía líquida espectrometría de masas y procesamiento de datos crudos

Nota: porque 4SU-reticulación cambia la masa del péptido, sus iones no cuentan para la intensidad del péptido no reticulado en LC-MS/MS, por lo tanto, que parece ser disminuido por el entrecruzamiento. El grado y la consistencia de esta disminución refleja el grado de reticulación de proteínas-RNA para cada péptido ²⁴.

1. HPLC preparar buffers como sigue: 0,1% de ácido fórmico en agua grado HPLC (tampón A), el ácido fórmico 0,1% en acetonitrilo grado HPLC (tampón B).
2. Si un nano-HPLC está disponible, conecte una nano-columna con las siguientes especificaciones: diámetro interno 75 μm; lleno de partículas de C18-AQ; longitud 20-25 cm.
   Nota: Si ejecuta el HPLC disponible a tasas de flujo más altas use un tamaño de columna adecuado para el caudal indicado. Cromatografía de flujo más alta disminuye sensibilidad.
3. Programar el método HPLC como sigue: tarifa 250-300 nL/min de flujo, gradiente de 2 a 28% de tampón B en 120 min, del 28 al 80% B para los próximos 5 minutos e isocrática 80% B durante 10 minutos
   Nota: Si el HPLC no tiene una columna automatizado equilibrado muestra previa de carga, inicie el programa con 10 min a 0% B antes de cargar la muestra.
4. Programar el método de adquisición de MS para realizar adquisición de datos dependientes (DDA) como experimentos de proteomics de la escopeta estándar. El ciclo de trabajo del instrumento debe alternar exploraciones de MS completas con tandem MS exploraciones (o MS/MS) de las señales más intensas. Utilice la configuración óptima para proteómica MS funciona.
   Nota: Para obtener resultados seguros, instrumentos de uso que pueden realizar por lo menos el MS completo de barrido en modo de alta resolución (e.g. orbitrap, tiempo de vuelo). Para la cuantificación precisa, asegúrese de que intervalos entre búsquedas completas de MS ya no son de 3 ciclos de trabajo más s. podrían impedir la definición exacta de los cromatogramas de iones extraídos.
5. 1-2 μg de muestra en la columna HPLC y ejecutar el método de HPLC-MS/MS como programado. Para cada repetición biológica realizar al menos dos carreras independientes y tratarlos como técnicos repeticiones.
6. Después de MS, importar los archivos sin procesar en un paquete de software de proteómica para la identificación de espectros MS/MS y péptido cuantificación mediante cromatografía de iones extraídos. Recomendamos los paquetes de software que pueden realizar la alineación cromatográfica de múltiples MS funciona (véase la Tabla de materiales) ^{29 , 30}.
7. Si la opción está disponible en el paquete de software, habilitar " partido entre carreras " antes de comenzar el procesamiento de datos.
8. Una vez finalizado el análisis, exportar la lista de péptidos junto con los valores de cuantificación.

Resultados

La figura 1 muestra el flujo de trabajo de RBR-ID. Debido a la reticulación relativamente baja eficiencia de esta técnica, es muy importante a tener en cuenta el nivel de agotamiento y la consistencia del efecto observado (P -valor) a través de réplicas biológicas. La figura 2 muestra una parcela de volcán de resultado RBR-ID. Péptidos que traslapó dominio de adorno (RRM) de reconocimiento de RNA Mostrar nivel de...

Discusión

Se describe un protocolo experimental detallado para realizar la identificación de RBR en troncales y, con modificaciones apropiadas, en cualquier célula que puede incorporar 4SU RNA. Otros tipos de células pueden requerir optimización del enfoque para asegurar una suficiente relación señal a ruido. Además, mientras que el protocolo descrito aquí se centra en el examen de prácticas comerciales restrictivas nucleares, la tecnología de RBR-ID debe ser fácilmente adaptable a diferentes compartimentos celulares, c...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
KnockOut DMEM	Fisher Scientific	10829018
Fetal bovine serum, qualified, US origin	Fisher Scientific	26140079
L-Glutamine solution 200 mM	Sigma	G7513
Penicillin-Streptomycin solution	Sigma	P0781
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×)	Sigma	M7145
2-Mercaptoethanol	Sigma	M3148
ESGRO Leukemia Inhibitory Factor (LIF)	EMD Millipore	ESG1106
CHIR99021	Tocris	4423
PD0325901	Sigma	PZ0162
Gelatin solution,2% in water	Sigma	G1393
4-thiouridine	Sigma	T4509	50 mM stock in water
Spectrolinker XL-1500	Fisher Scientific	11-992-90
Phenylmethanesulfonyl fluoride	Sigma	78830
IGEPAL CO-630	Sigma	542334	Commercial form of octyl-phenoxy-polyethoxy-ethanol detergent
Iodoacetamide	Sigma	I6125
Trypsin, sequencing grade	Promega	V5111
Empore solid phase extraction disk	3M	66883
OLIGO R3 Reversed - Phase Resin	Fisher Scientific	1133903
Benzonase	Sigma	E8263	High purity nuclease
Sonic Dismembrator Model 100	Fisher Scientific	discontinued	updated with FB505110
HPLC grade acetonitrile	Fisher Chemical	A955-4
HPLC grade water	Fisher Scientific	W6 4
TFA	Fisher Scientific	A11650
Ammonium Bicarbonate	Sigma	A6141
Acetic Acid	Sigma	49199
Formic Acid	Sigma	F0507
ReproSil-Pur 18-AQ	Dr. Maisch GmbH HPLC	r13.aq.0003	Packing material for HPLC column
Capillary for nano columns (75 µm)	Molex	1068150017
MaxQuant software	Max Planck Institute for Biochemistry		Can perform chromatographic alignment of multiple MS runs