Preparação da amostra para identificação de espectrometria de massa-baseada das regiões de ligação de RNA

Resumo

Descreveremos um protocolo para identificar proteínas RNA-obrigatórias e mapear suas regiões de ligação de RNA em células vivas, usando photocrosslinking UV-mediada e espectrometria de massa.

Resumo

RNA não-codificante desempenham papéis importantes em diversos processos nucleares, incluindo a regulação da expressão gênica, estrutura da cromatina e reparação do DNA. Na maioria dos casos, a ação de RNA não-codificante é mediada por proteínas que por sua vez, cujas funções são regulamentadas por essas interações com RNA não-codificante. Consistente com este, um número crescente de proteínas envolvidas em funções nucleares têm sido relatado para vincular o RNA e em alguns casos as regiões de RNA-ligação destas proteínas foram mapeadas, muitas vezes através de métodos laboriosos, baseado no candidato.

Aqui, nós relatamos um protocolo detalhado para realizar uma identificação imparcial elevado-throughput, proteoma-largo de RNA-proteínas e suas regiões de RNA-obrigatórias. A metodologia baseia-se na incorporação de uma uridina fotorreativas analógica no RNA celular, seguido de reticulação de RNA-proteína mediada por UV e análises de espectrometria de massa para revelar o RNA-quitosana péptidos dentro do proteoma. Embora nós descrevemos o procedimento para as células estaminais embrionárias de rato, o protocolo deve ser facilmente adaptado a uma variedade de culturas de células.

Introdução

O objetivo do método RBR-ID é identificar novas proteínas RNA-obrigatórias (RBPs) e mapear as regiões de RNA-obrigatórias (RBRs) com resolução de peptídeo-nível para facilitar o design de mutantes de RNA-obrigatórias e a investigação da biológicas e bioquímicas funções de interações proteína-RNA.

O RNA é único entre biomoléculas pode atuar como um mensageiro carregando informação genética e também dobrar em estruturas tridimensionais complexas com funções bioquímicas mais parecidas com as de proteínas^1,2. Um corpo crescente de evidências sugere que o RNA não-codificante (ncRNAs) desempenhar um papel importante em diversos genes vias regulamentares e epigenéticas^3,4,5 e, normalmente, essas funções reguladoras são mediadas em concerto com proteínas que interagem especificamente com um determinado RNA. De particular importância, um conjunto de proteínas de interação foi recentemente identificado para o ncRNA longo intensamente estudada (lncRNA) Xist, fornecendo insights valiosos sobre como este lncRNA Medeia a inativação do cromossomo x em células femininas^{6,7 ,8}. Notavelmente, várias destas proteínas Xist-interagindo não contêm qualquer de domínios de RNA-ligação canônica⁹, e, portanto, sua atividade RNA-ligação não poderia ser previsto em silico com base em sua sequência primária sozinha. Considerando que milhares de lncRNAs são expressos em qualquer determinada célula¹⁰, é razoável supor que muitos deles podem agir através de interações com o ainda a ser descoberto proteínas RNA-obrigatórias (RBPs). Uma estratégia experimental para identificar essas novela RBPs, portanto, iria facilitar grandemente a tarefa de dissecar a função biológica de ncRNAs.

Tentativas anteriores para identificar RBPs empiricamente têm invocado polyA + RNA seleção acoplada a espectrometria de massa (MS)^{11,12,13,14,15}. Embora estas experiências adicionado muitas proteínas à lista do RBPs putativos, por design, que só podiam detectar proteínas vinculadas a polyadenylated transcrições. No entanto, a maioria dos RNAs pequeno e muitos lncRNAs não são polyadenylated. ^{16 , 17} e suas proteínas de interação teria provavelmente sido perdidas nesses experimentos. Um estudo recente da proteína-proteína interactome bancos de dados para identificar as proteínas que co purificado com vários conhecidos RBPs e mostraram que esses parceiros RBP recorrentes eram mais prováveis de possuir RNA-obrigatórias atividades¹⁸aplicada aprendizado de máquina. No entanto, essa abordagem baseia-se na mineração de bancos de dados existentes de grande interação e só podemos identificar as proteínas que podem ser co purificadas em condições não-desnaturação com conhecidos RBPs, excluindo assim a partir da análise, insolúvel, membrana-incorporado e escassa proteínas.

A identificação de uma proteína como uma bona fide RBP muitas vezes não produz automaticamente informações sobre a função biológica e/ou bioquímica da interação da proteína-RNA. Para resolver este ponto, é geralmente desejável para identificar os proteína domínio amino-ácido resíduos e envolvidos na interação, para que os mutantes específicos podem ser projetados para testar a função de ligação de RNA no contexto de cada novela RBP^{19, 20}. esforços anteriores do nosso grupo e outros usaram fragmentos de proteína recombinante e exclusão mutantes para identificar RNA vinculação regiões (RBRs)^19,20,21,22; no entanto, tais abordagens são trabalhosas e incompatível com as análises de alta produtividade. Mais recentemente, um estudo descreveu uma estratégia experimental para mapear as atividades de RNA-obrigatórias em uma moda de alta produtividade usando espectrometria de massa²³; no entanto, esta abordagem baseou-se em uma seleção duplo polyA + RNA e assim, carregava as mesmas limitações que as abordagens de identificação RBP descritas acima.

Desenvolvemos uma técnica, denominada RNA vinculação região identificação (RBR-ID), que explora a proteína-RNA photocrosslinking e espectrometria de massa quantitativa para identificar proteínas e regiões da proteína interagindo com RNA em células vivas sem fazer suposição sobre o estatuto de poliadenilação RNA, incluindo assim RBPs vinculado a polyA-RNAs²⁴. Além disso, esse método depende exclusivamente de reticulação e tem sem requisitos na solubilidade de proteínas ou acessibilidade e, portanto, é adequado para mapear as atividades de RNA-obrigatórias dentro membranas (por exemplo, o envelope nuclear) ou compartimentos pouco solúvel ( por exemplo, a matriz nuclear). Descrevemos as etapas experimentais para executar RBR-ID para os núcleos de células estaminais embrionárias de rato (mESCs), mas com pequenas modificações este protocolo deve ser apropriado para uma variedade de tipos de células, desde que eles eficientemente podem incorporar 4SU da cultura médio.

Protocolo

1. cultura e expansão de mESCs

Nota: as células estaminais embrionárias de rato são fáceis de cultura e pode ser expandidas rapidamente para os grandes números exigidos pelo bioquímicas experiências graças a seu tempo de ciclagem rápida. MESCs saudáveis dobrar a cada 12 h.

1. MESCs expandir para o número desejado em placas gelatinizadas no mESC médio (veja abaixo) em uma incubadora de cultura de tecidos mantido a 37 ° C, 5% de CO ₂, e > 95% de umidade.
   Nota: Suficiente placas devem estar preparadas para 3-5 repetições biológicas para o + 4SU amostra e controle a - 4SU. Uma placa de 10 cm (ou seja, 5 milhões de células) é mais do que suficiente para replicar cada biológico.
2. o meio de mESCs é composto por Dulbecco ' s modificado águia ' meio de s (DMEM) suplementado com 15% soro bovino fetal (FBS), 2 mM L-glutamina, 0.5 x penicilina/estreptomicina, 1 x não aminoácidos essenciais, 100 µM beta-Mercaptoetanol, 1.000 U /mL leucemia inibitório fator (LIF), 3 µM CHIR99021, 1 µM PD0325901.
3. Antes de passagem mESCs, prepare o número desejado de placas de 10 cm.
   1. Adicionar 4 mL de 0.1% de gelatina em água, certificando-se de que toda a superfície da placa é coberta; incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente (RT); remover a solução de gelatina.
4. Passagem de células quando atingirem 10 milhões de células por prato, tipicamente ~ 48 h após a inoculação.
   Nota: Como mESCs crescer em colônias densas, placas nunca poderão alcançar confluência de 100%, como observado por linhas de células que crescem em monocamadas (por exemplo, HEK293 ou células 3T3). Uma placa de mESC deve ser passada quando ~ 50% confluente e definitivamente antes o meio fica amarela.
   1. Para separar as células, lavar pratos com culturas densas mESC uma vez em 1 x solução salina tampão fosfato (PBS) suplementada com 2 mM de EDTA, em seguida, adicionar tripsina 0,05% dissolvida em DMEM e retornar placa a incubadora por 5 min (37 ° C, 5% de CO ₂, e > 95% umidade).
   2. Retirar a placa da incubadora e ressuspender as células com igual volume de DMEM pipetando subindo e descendo vigorosamente várias vezes.
   3. Contar células usando hemocytometer e certifique-se de que as células formam uma suspensão de célula única (ou seja, sem clusters), centrifugar célula mistura 500 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Remover o sobrenadante e ressuspender células em 1-2 mL DMEM.
   4. Inocular as células em uma densidade de 10.000 células/cm ² no meio de mESC (ou seja, ~ 800.000 células por placa de 10 cm) usando as placas revestidas gelatina preparadas na etapa 1.3.1.

2. Ligação cruzada de proteínas – interações RNA nas células ao vivo

Nota: reticulação de RNA-proteína é mediada pelo ribonucleoside foto-ativável analógico 4-thiouridine (4SU). 4SU tem um máximo de absorbância mais tempo do que endógenos nucleotídeos e só pode ser incorporada do RNA; Portanto, o intermediário-comprimento de onda UVB pode ser usado para seletivamente crosslink RNA proteínas ^{25 , 26}. Tratamento de UVB de células tratadas 4SU leva a ligações covalentes cruzadas entre 4SU contendo RNA e aminoácidos, com uma preferência relatado por Tyr, Trp, Met, Lys e Cys ²⁷.

1. MESCs expandir para o número necessário de placas de 10 cm, como descrito no passo 1.
   Nota: Suficiente placas devem estar preparadas para 3-5 repetições biológicas para o + 4SU amostra e controle a - 4SU. Uma placa de 10 cm (ou seja, 5 milhões de células) é suficiente para cada biológico replicar.
2. Antes que as chapas atinjam a confluência, adicionar 4SU diretamente em meio a uma concentração final de 500 µM. deixe - 4SU pratos de controle não tratados.
3. Placas de agitar suavemente para distribuir o 4SU homogênea em toda a mídia. Devolvê-los para a mesma cultura de tecidos incubadora para 2h (37 ° C, 5% de CO ₂, e > 95% de umidade).
4. Placas de transferência para um balde de gelo e descarte o meio.
5. Lavar a placa suavemente com 5 mL de PBS gelado.
   Nota: Lave suavemente ou células podem desanexar.
6. Adicionar 2 mL de placas geladas de PBS e lugar sem tampas em um agente reticulante equipado com lâmpadas emissoras de UVB (312 nm). A irradiação de placas em uma configuração de energia de 1 J/cm ².
   Nota: É fundamental que tampas plásticas são removidas ou pode proteger as células de luz UV e evitar reticulação.
7. Recolher pilhas usando levantadores de célula e transferir para PBS gelado em tubos cónicos. Centrifugar a 2.000 x g por 5 min, 4 ° C.
8. Remover o sobrenadante e ressuspender células em 5 mL PBS gelado com 2 mM EDTA e 0,2 mM phenylmethylsulfonyl flúor (PMSF).
9. Contagem de células usando um hemocytometer. Esperar 5-10 e 10 milhões de células das placas de 10 cm e 15 cm, respectivamente.
10. Centrifugar 2.000 x g por 5 min, 4 ° C.
    Nota: Células peletizadas podem ser imediatamente usadas para a etapa 3 ou pode ser congelado em nitrogênio líquido e armazenados a-80 ° C indefinidamente. Este é um potencial ponto de parar.

3. Isolamento dos núcleos

Nota: núcleos são isolados para remover proteínas citoplasmáticas e aumentar a cobertura de proteínas nucleares. Esta etapa pode ser substituída por outras formas de fracionamento celular para estudar RBPs em diferentes compartimentos celulares.

1. Preparar gelo frio Buffer (10 mM Tris-HCl pH 7,9, 4 ° C, 1,5 mM de MgCl ₂, 10 mM KCl). Use pelo menos 2,5 mL por 10 milhões de células (como contou na etapa 2.9) para a extração.
   Nota: As existências de tampão A (por exemplo, uma garrafa de 500 mL) podem ser preparadas com antecedência e armazenadas a 4 ° C por 6 meses.
   1. Antes da utilização, adicionar 0,5 mM ditiotreitol (DTT) e 0,2 mM PMSF ao montante desejado (2,5 mL por 10 milhões de células) do buffer gelada r.
2. Lavar as células usando 2 mL de tampão A por 10 milhões de células. Girar a 2.500 x g por 5 min a 4 ° C.
3. Discard sobrenadante, adicionar tampão A suplementado com 0,2% de um detergente não iônico, não-desnaturação, tais como octil-fenoxi-polyethoxy-etanol (veja a Tabela de materiais), 500 µ l por 10 milhões de células. Gire por 5 min a 4 ° C.
4. Centrifugar a 2.500 x g, durante 5 min.
5. Remover o sobrenadante; a pelota compreende núcleos intactos desprovido de citoplasma.
   Nota: Núcleos podem ser usados imediatamente para a etapa 4 ou congelado em nitrogênio líquido e armazenados a-80 ° C indefinidamente. Este é um potencial ponto de parar.

4. Lise dos núcleos

Nota: núcleos de quitosana lysed em um buffer de espectrometria de massa compatível com a liberação de proteínas e complexos de RNA-proteína.

1. Adicionar tampão de lise (9 M de ureia, 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 24 ° C), 200 µ l por 10 milhões de células. Proceda à sonicação para distorcer usando um 1/8 de cromatina " sonda no ajuste de amplitude de 50% para s. 5-10
2. Spin a 12.000 x g por 5 min e coletar 175 µ l do sobrenadante para evitar a pelota.
   Nota: 100 µ l será usado para as próximas etapas de RBR-ID e os restantes 75 µ-l de lisado pode ser armazenado a-80 ° C para uso posterior e/ou análise ocidental do borrão.
Concentração de proteína medida através do ensaio de Bradford ou semelhante técnica ²⁸ de
3. . Diluir a concentração de proteína nas diferentes amostras de 1 mg/mL ou a menor concentração de amostra usando quantidades apropriadas de Lise.
   Nota: Os núcleos de 10 milhões de mESCs esperar 100-200 µ g de proteína.

5. Digestão do trypsin

Nota: as proteínas são digeridas para gerar peptídeos suitable para análise de espectrometria de massa de baixo para cima (MS).

1. DTT adicionar solução para nuclear lisado (5mm final); incubar durante 1 h em RT.
2. Adicionar o iodoacetamide do estoque fresco (14 mM final); incubar durante 30 min à RT no escuro.
3. Dilua o lisado com 5 vezes o volume de 50 milímetros NH ₄ HCO ₃
4. Adicionar tripsina (proteína µ g: tripsina µ g = 200:1); incubar a 37 ° C durante a noite.

6. Dessalinização de peptídeos

1. preparar uma ponta do palco sob medida por exemplo.
   1. 6.1.1. Coloque um disco de material de extração C18 de fase sólida na parte inferior de uma ponta de pipeta de 200 µ l.
   2. Adicionar 50 µ l de oligo R3 invertida resina fase em cima do disco C18. Coloque a ponta do palco dentro adaptador de centrifugação e a ponta de lugar com adaptador dentro de um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
   3. Adicione 100 µ l 100% acetonitrila dicas para lavar. Centrifugar a 1000 x g por 1 min remover o solvente.
   4. Equilíbrio com 50 µ l 0,1% ácido trifluoroacético (TFA). Centrifugar a 1000 x g por 1 min.
2. Adicionar 100% de ácido fórmico a amostra de proteína digerida para diminuir o pH a 2-3.
   Nota: Isto deve exigir ~ 5 µ l / 1 mL da amostra diluída do peptide, mas pH deve ser medido e mais fórmico ácido adicionado se necessário.
3. Amostra de carga na ponta do palco sob medida, centrifugar a 1000 x g por 1 min, até que todos da amostra passa a dica.
4. Lavagem vinculado peptídeos com 50 µ l 0,1% TFA. Centrifugar a 1000 x g por 1 min.
5. Eluir peptídeos pela adição de tampão de eluição 50 µ l (75% acetonitrila, 0.025% TFA) a ponta do palco e centrifugar a 1000 x g por 1 min forçar o tampão de eluição fora da ponta.
6. Secar a amostra utilizando uma centrífuga vácuo fixado em 150 x g e 1-3-kPa para 1 h.
   Nota: Peptídeos secos podem ser armazenados a-80 ° C indefinidamente. Este é um potencial ponto de parar.

7. Remoção do RNA de quitosana

Nota: tratar de peptídeos com nuclease remover quitosana RNA.

1. Resuspenda o pellet em 50 µ l 2 x buffer de nuclease (100mm NH ₄ HCO ₃, 4 mM MgCl ₂).
Concentração
2. peptídeo medida utilizando absorbância em 280 nm, supondo que 1 mg/mL de peptídeos para um um ₂₈₀ de 1.
   Nota: A concentração esperada é de 1 mg/mL.
3. Ajustar todas as amostras de 1 mg/mL ou para a menor concentração usando 2x buffer de nuclease.
4. Preparar uma mistura de mestre de 50 µ l de H ₂ O + nuclease de alta pureza de 1 µ l (≥ 250 U) (consulte a Tabela de materiais) por exemplo.
5. Levar 50 µ l de amostra do peptide e adicionar 50 µ l de H ₂ O + nuclease mestre mistura.
6. Incubar a 37 ° C por 1 h. seguir para realizar a espectrometria de massa.
   Nota: Os peptídeos estão agora prontos para espectrometria de massa. Podem ser analisados imediatamente ou armazenados a-80 ° C indefinidamente. Este é um potencial ponto de parar.

8. Nano de cromatografia líquida, espectrometria de massa e processamento de dados Raw

Nota: porque 4SU-reticulação altera a massa do peptide, seus íons não contam para a intensidade do peptide não-quitosana durante o LC-MS/MS, que, portanto, parece ser diminuiu a reticulação. O grau e a consistência desta diminuição reflecte o grau de reticulação de RNA-proteína para cada peptídeo ²⁴.

1. HPLC preparar amortecedores da seguinte forma: 0,1% de ácido fórmico em água de qualidade para HPLC (tampão A); 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila grau CLAE (Buffer B).
2. Se um nano-HPLC estiver disponível, conecte uma nano-coluna com as seguintes especificações: diâmetro interno 75 µm; embalado com partículas C18-AQ; comprimento 20-25 cm.
   Nota: Se o HPLC disponível é executado em taxas de fluxo maiores utilize um tamanho de coluna adequada para a taxa de fluxo indicado. Cromatografia de fluxo maior diminui a sensibilidade.
Programa de
3. o método HPLC como segue: fluxo taxa de 250-300 nL/min; gradiente de 2 a 28% tampão B em 120 min, de 28 a 80 B para o próximos 5 min e isocrática 80% B durante 10 min.
   Nota: Se não tiver um carregamento de amostra prévia de equilibração coluna automatizado, a HPLC iniciar o programa com 10 min a 0% B antes de carregar a amostra.
4. o método de aquisição de MS para realizar aquisição de dados dependentes (DDA) como experimentos de proteomics espingarda padrão do programa. O ciclo de dever de instrumento deve alternar análises completas de MS com tandem MS scans (ou MS/MS) dos sinais mais intensos. Use as configurações ideais para proteômica MS funciona.
   Nota: Para resultados confiantes, uso de instrumentos que podem executar pelo menos a MS completa varredura em modo de alta resolução (por exemplo, orbitrap, tempo-de-voo). Para quantificação exacta, certifique-se que intervalos entre análises completas de MS não são mais do que 3 ciclos mais s. podem impedir a definição precisa dos cromatogramas de íons extraídos.
5. 1-2 µ g de amostra para a coluna HPLC de carregar e executar o método de HPLC-MS/MS, conforme programado. Para cada biológico replicar realizar pelo menos duas pistas independentes e tratá-los como técnicas repetições.
6. Depois de MS, importar os arquivos raw para um pacote de software de proteômica para identificação de espectros de MS/MS e quantificação de peptídeo através de cromatografia iônica extraídos. Recomendamos os pacotes de software que podem executar alinhamento cromatográfico de múltiplas MS é executado (veja a Tabela de materiais) ^{29 , 30}.
7. Se a opção está disponível na suíte de software, permitem " correspondência entre execuções " antes de iniciar o processamento de dados.
8. Quando a análise estiver concluída, exportar a lista de peptídeo juntamente com os valores de quantificação.

Resultados

A Figura 1 mostra o fluxo de trabalho RBR-ID. Devido a reticulação relativamente baixa eficiência dessa técnica, é muito importante levar em consideração tanto a nível de esgotamento e a consistência do efeito observado (P -valor) através de réplicas biológicas. A Figura 2 mostra uma trama de vulcão de resultado RBR-ID. Peptídeos que sobrepostas domínio de motivo (RRM) de reconhecimento de RNA mostram nív...

Discussão

Descreveremos um protocolo experimental pormenorizado para executar RBR-ID em mESCs e, com modificações apropriadas, em qualquer célula que pode incorporar 4SU em RNA. Outros tipos de células podem exigir a otimização da abordagem para garantir um suficiente sinal à relação de ruído. Além disso, enquanto o protocolo descrito neste documento concentra-se no exame do RBPs nucleares, a tecnologia de RBR-ID deve ser facilmente adaptada para diferentes compartimentos celulares, como o citoplasma ou organelas espec?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
KnockOut DMEM	Fisher Scientific	10829018
Fetal bovine serum, qualified, US origin	Fisher Scientific	26140079
L-Glutamine solution 200 mM	Sigma	G7513
Penicillin-Streptomycin solution	Sigma	P0781
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×)	Sigma	M7145
2-Mercaptoethanol	Sigma	M3148
ESGRO Leukemia Inhibitory Factor (LIF)	EMD Millipore	ESG1106
CHIR99021	Tocris	4423
PD0325901	Sigma	PZ0162
Gelatin solution,2% in water	Sigma	G1393
4-thiouridine	Sigma	T4509	50 mM stock in water
Spectrolinker XL-1500	Fisher Scientific	11-992-90
Phenylmethanesulfonyl fluoride	Sigma	78830
IGEPAL CO-630	Sigma	542334	Commercial form of octyl-phenoxy-polyethoxy-ethanol detergent
Iodoacetamide	Sigma	I6125
Trypsin, sequencing grade	Promega	V5111
Empore solid phase extraction disk	3M	66883
OLIGO R3 Reversed - Phase Resin	Fisher Scientific	1133903
Benzonase	Sigma	E8263	High purity nuclease
Sonic Dismembrator Model 100	Fisher Scientific	discontinued	updated with FB505110
HPLC grade acetonitrile	Fisher Chemical	A955-4
HPLC grade water	Fisher Scientific	W6 4
TFA	Fisher Scientific	A11650
Ammonium Bicarbonate	Sigma	A6141
Acetic Acid	Sigma	49199
Formic Acid	Sigma	F0507
ReproSil-Pur 18-AQ	Dr. Maisch GmbH HPLC	r13.aq.0003	Packing material for HPLC column
Capillary for nano columns (75 µm)	Molex	1068150017
MaxQuant software	Max Planck Institute for Biochemistry		Can perform chromatographic alignment of multiple MS runs