Láser Doppler: Una herramienta para medir islote pancreático AMPc Microvascular en Vivo

Resumen

Islote pancreático microvascular AMPc regula la distribución de sangre del islote y mantiene la función fisiológica de las células β del islote. Este protocolo describe el uso de un monitor Doppler láser para determinar el estado funcional del islote pancreático AMPc microvascular en vivo y para evaluar las contribuciones de la microcirculación de islotes pancreáticos para enfermedades relacionadas con el páncreas.

Resumen

Como un estado funcional de la microcirculación, AMPc microvascular es importante para el suministro de oxígeno y nutrientes y la eliminación de dióxido de carbono y productos de desecho. La debilitación de la vasomoción microvascular podría ser un paso crucial en el desarrollo de enfermedades relacionadas con la microcirculación. Además, los islotes pancreáticos altamente vascularizado está adaptado para apoyar la función endocrina. En este sentido, parece posible inferir que el estado funcional de islotes pancreáticos microvascular AMPc podría afectar la función de islotes pancreáticos. Analizar los cambios patológicos de la situación funcional de AMPc microvascular islote pancreático puede ser una estrategia factible para determinar las contribuciones que la microcirculación de islote pancreático hace relacionados con enfermedades, como diabetes mellitus, pancreatitis, etcetera. Por lo tanto, este protocolo describe el uso de un monitor de flujo de sangre Doppler de láser para determinar el estado funcional del islote pancreático AMPc microvascular y establecer los parámetros (incluida la perfusión de la sangre media, amplitud, frecuencia y relativa velocidad de AMPc microvascular del islote pancreático) para la evaluación del estado funcional microcirculación. En un modelo de ratón diabético inducida, observamos un estado funcional deterioro de AMPc microvascular del islote pancreático. En conclusión, este enfoque para la evaluación de islote pancreático AMPc microvascular en vivo puede revelar mecanismos relativos a las enfermedades del islote pancreático.

Introducción

Como un parámetro del estado funcional de la microcirculación, AMPc microvascular asume la responsabilidad de la entrega y el intercambio de oxígeno, nutrientes y hormonas y es fundamental para la eliminación de productos metabólicos, tales como dióxido de carbono y residuos celulares ¹. microvascular AMPc también regula la distribución del flujo sanguíneo y la perfusión del tejido, afectando microcirculatoria local de la presión arterial y respuestas a los inflamación, que puede inducir edema en muchas enfermedades. Por lo tanto, es extremadamente importante para mantener la función fisiológica de órganos^2,3,4, tejidos y células componentes AMPc microvascular. La debilitación de la vasomoción microvascular podría ser uno de los pasos clave en el desarrollo de enfermedades relacionadas con la microcirculación⁵.

Láser Doppler fue inicialmente desarrollado para la observación y cuantificación en el ámbito de la microcirculación investigación⁶. Esta técnica, junto con otros enfoques técnicos (p. ej., láser de punto⁷, oxígeno transcutáneo, etcetera), ha sido considerada como el estándar de oro para evaluar el flujo sanguíneo en la microcirculación. La justificación que la perfusión de sangre de la microcirculación local (es decir, los capilares, arteriolas, vénulas, etc.) puede ser determinada por el aparato equipado con láser Doppler, se basa en el principio de Doppler shift. La longitud de onda y frecuencia de la emisión estimulada de luz cambian cuando partículas ligeras encuentran movimiento glóbulos en microvasos, o permanecen sin cambios. Por lo tanto, en la microcirculación, el número y la velocidad de las células sanguíneas son los factores claves relativos a la magnitud y la distribución de frecuencias de la luz cambió de puesto de Doppler, mientras que la dirección del flujo sanguíneo microvascular es irrelevante. Utilizando diferentes métodos, se han utilizado una variedad de tejidos para estudios micro circulatorio, incluyendo los entresijos y dorsal plicometro cámaras de ratones, ratas, hámsteres e incluso los seres humanos⁸. Sin embargo, en el protocolo actual, nos centramos en el funcional estado de AMPc microvascular del islote pancreático, que es evaluada usando láser Doppler y un sistema de parámetro de evaluación hecha en casa.

Microcirculación del islote pancreático se compone principalmente de microvasos del islote pancreático y exhibe características distintivas. Una red capilar de islote pancreático muestra una densidad cinco veces mayores que la red capilar de su contraparte exocrine⁹. Proporcionar un conducto para el suministro de entrada de la glucosa y la insulina difusión, células endoteliales del islote suministrar oxígeno a las células metabólicamente activas en islote las células β. Además, también emergentes evidencia demuestra que islote microvessels están involucrados no sólo en la regulación de la expresión de gene de la insulina y la supervivencia de la célula β, sino también en que afectan a la función de las células β; promover la proliferación de células β; y producir un número de crecimiento y angiogénicos sustancias vasoactivas, factores de¹⁰. Por lo tanto, en este sentido, se infiere que el estado funcional de islotes pancreáticos microvascular AMPc puede afectar la función de las células β del islote y conseguir implicado en la patogenia de enfermedades como la pancreatitis aguda, crónica, diabetes y otras enfermedades relacionadas con el páncreas.

Analizando los cambios patológicos del estado funcional del islote pancreático microvascular AMPc podría ser una estrategia factible para determinar las contribuciones de la microcirculación de islotes pancreáticos para las enfermedades antes mencionadas. Un procedimiento detallado paso a paso que describe el enfoque para determinar islotes pancreáticos AMPc microvascular en vivo ofrecen aquí. Las medidas típicas de entonces se muestran en los Resultados de representante. Finalmente, los beneficios y limitaciones del método se destacan en la discusión, junto con más aplicaciones.

Protocolo

Todos los experimentos en animales fueron ejecutados en cumplimiento de todas las directrices pertinentes, regulaciones y agencias reguladoras. El presente Protocolo se demostró fue realizado bajo la dirección y aprobación de la Instituto de microcirculación Animal ética Comité (IMAEC) en el colegio médico Unión de Pekín (PUMC).

1. los animales

1. Antes del inicio del experimento, mantener tres ratones BALB/c por jaula, con temperatura controlada (24 ± 1 ° C) y humedad (55 ± 5%), en un ciclo de luz-oscuridad de 12 h. Permitir que los ratones libre acceso a agua y comida regular.
2. Dividir los ratones, al azar, un grupo de no diabéticas control y un grupo diabético. Con precisión pesan cada ratón individual y calcular el volumen de inyección utilizando la masa corporal de cada ratón.
3. Rápidamente los ratones durante 4 horas antes de la inyección del streptozotocin (STZ) y proporcionar agua normal como normal experimental día 1.
4. Preparación de buffer de citrato de sodio de 0.1 M a pH 4.3. Poner 1 mL de la solución en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y envuelva el tubo de microcentrífuga en papel de aluminio para evitar la exposición a la luz.
5. Disolver el STZ en tampón de citrato de sodio (pH 4.3) a una concentración final de trabajo de 5 mg/mL antes de su uso.
6. Dar a los ratones de las inyecciones intraperitoneales de grupo diabético de STZ a dosis de 40 mg/kg utilizando una jeringa de 1 mL y una aguja de 25 G. Inyectar a los ratones del control no diabético con el mismo volumen de buffer de citrato de sodio (pH 4.3).
7. Vuelva a colocar los ratones en las jaulas y proporcionarles alimento regular y 10% en agua y sacarosa.
8. Repita los pasos 1.3-1.7 días experimentales 2 a 5 (es decir, el próximo 4 días consecutivos).
9. Reemplazar el agua de 10% de sacarosa con agua corriente después de la última inyección de STZ.
10. Rápidamente los ratones por 6 horas, pero les da libre acceso al agua y mida sus niveles de glucosa en sangre nueve días más tarde (experimental 14). Recoger una muestra de sangre de la vena de la cola para confirmar hiperglucemia utilizando un sistema de monitoreo de glucosa de sangre.
    Nota: Ratones con sangre glucosa niveles > 200 mg / dL se consideran diabetes.

2. preparación del instrumento

1. Limpie las superficies ópticas de la punta de prueba y conector de la sonda del aparato Doppler laser con un paño suave no abrasivo para eliminar polvo o partículas. Enchufe el cable en el puerto del instrumento (figura 1A).
2. Montar el soporte de calibración permitiendo el flujo estándar de estar en equilibrio térmico con un entorno experimental (temperatura ambiente, generalmente por 30 min). Agite el flujo estándar suavemente durante 10 s y deje descansar por 2 minutos.
3. Coloque el contenedor estándar de flujo en medio de la base de calibración. Ajuste la abrazadera a la altura máxima y fije la sonda en la abrazadera que apunta hacia abajo en el contenedor. Asegúrese de que el estándar de flujo está correctamente colocado debajo de la sonda.
4. Lentamente mueva la sonda hacia abajo hasta que la punta esté correctamente sumergida en el estándar de flujo. Seleccione y presione "calibración" en el laser Doppler aparato y elegir el canal de trabajo que la sonda está conectada a. Ejecute el programa de calibración hasta que aparezca un aviso de "Calibración exitosa" en la pantalla del laser Doppler aparato.
5. Asegure la sonda con los titulares de la sonda. Asegure manualmente la sonda para evitar el movimiento.
6. Mantener la sala experimental a temperatura constante (24 ± 1 ° C) y humedad (~ 50-60%).
7. Apague cualquier luz externa (por ejemplo, lámparas fluorescentes y punto) antes de realizar el experimento para evitar el cambio inducido por la luz externo.

3. preparación de los animales

1. Autoclave el quirúrgico instrumentos y déjelos enfriar a temperatura ambiente antes de usar.
2. Dar a los ratones 10 min para aclimatarse al ambiente experimental antes de detectar AMPc microvascular islote pancreático por láser Doppler.
3. Llene una jeringa de 1 mL con 1 mL de pentobarbital sódico de 3%. Inyecte la solución de pentobarbital sódico (75 mg/kg i.p.) para anestesiar los ratones.
4. Cubrir los ojos del ratón con una gasa médica previamente humedecido para evitar la sequedad.
5. Asegúrese de que el ratón pierde totalmente la conciencia y ya no responde a la cola o retropié pellizca con fórceps. Monitor de la anestesia durante todo el evento anestésico e intraoperatoria cada 15 minutos mantener la anestesia complementando con el 10% del volumen inicial de la inyección de la solución de pentobarbital cuando sea necesario.
6. Coloque una almohadilla de calefacción con una capa de semi aislamiento debajo del animal y colocar el animal en posición supina y traslado a la estación de trabajo del laser Doppler aparato. Fijar el ratón a la plataforma de trabajo con cinta quirúrgica.
7. Torunda la piel abdominal de ratón con betadine y luego el etanol del 75% se utiliza para limpiar la zona abdominal limpia.
8. Inyectar por vía subcutánea 2% lidocaine/0.5% bupivacaína mezcla (50/50).  Cortar un ~ 3 cm-orificio de diámetro en el centro de una esponja de Gasa. Cubren la región abdominal con la esponja de la gasa.
9. Levante la piel abdominal con pinzas y hacer una incisión vertical inicial a lo largo de la línea media del abdomen usando una tijera bisturí o la piel.
10. Sujete el músculo subyacente con pinzas e incisión para entrar en la cavidad abdominal. No dañar cualquier órgano. Plegar la piel y el músculo subyacente del pecho a la cavidad abdominal. Exponer suavemente el cuerpo del páncreas y el bazo usando un par de pinzas de punta Roma.

4. adquisición de datos para el análisis

1. Ejecutar el software del aparato Doppler láser haciendo clic en "Archivo" → "Nuevo" para crear un nuevo archivo de medición. Para configurar a los monitores conectados, en la pestaña "General", establecer la duración de vigilancia realizar "gratis." Utilizar los valores predeterminados de fábrica para la ficha de "Monitor LDF" haga clic en "Siguiente".
2. Configurar la pantalla de gráfico en el "configuración cuadro de diálogo visualización." Seleccionar los canales de "Velocidad de flujo, Conc," marcando las respectivas casillas. Seleccione los siguientes parámetros: "Origen de datos para el canal" y "etiqueta, unidades y Color". Haga clic en "Siguiente".
3. Ingrese la información del usuario sobre el tema y la medida (es decir, nombre y número de tema, operador, control de tiempo, comentarios, etc.) en el "cuadro de diálogo de información archivo" y haga clic en "Siguiente" para finalizar la configuración de medida.
   Nota: Una ventana de medición se crea automáticamente por el software (figura 1B).
4. Avanzar manualmente el electrodo al páncreas. Asegúrese de que la distancia entre la sonda y páncreas tejido es dentro de 1 mm. Una distancia inadecuada da una lectura de flujo sanguíneo artificialmente aumentada o disminuida.
5. Haga clic en el icono de barra de herramientas de "Inicio" para iniciar la grabación de los datos de unidades (PU) de perfusión microvascular de la sangre. Recoge los datos de PU continuamente durante 1 minuto cada. Haga clic en "Stop" para detener la medición. Seleccione "Archivo" → "Guardar como" nombre y guarde el archivo de medición final.
6. Manualmente volver a colocar la sonda después de cada carrera para evitar efectos aditivos y el agotamiento localizado de contráctil y la capacidad de relajación. Repita los pasos 4.1-4.4 para cosechar datos de PU microvasculares múltiples puntos (es decir, tres puntos elegido al azar del tejido pancreático) para cada ratón. Medir los datos de la PU de una placa no reflexiva como un control de línea de base.
7. Cerca de la capa del músculo abdominal y la capa de la piel con una sutura. Colocar los animales en jaulas limpias después de los experimentos.
8. Mantener el animal caliente colocando la jaula de recuperación media-en la almohada.
   Nota: Preste atención al calor, higiene, fluido y consumo de alimentos y la infección. Administrar ratones con 2 mg/kg de carprofeno durante 48 h como tratamiento del dolor postoperatorio.  Realizar la eutanasia por inyección i.p. de pentobarbital sódico de 150 mg/kg cuando los ratones se observan en un estado de dolor o angustia que no puede ser aliviado.

5. cálculo de los parámetros de AMPc Microvascular

1. Utilice el comando "Exportar" del laser Doppler software para exportar el tiempo y los datos primarios de PU como archivo *.xlsx y abra el archivo en una hoja de cálculo.
2. Calcular la unidad de perfusión basal promedio (PU_b) (véase el paso 4.6).
3. Calcular el promedio perfusión de la sangre (PU_una) para 1 minuto de la medición como sigue: promedio de perfusión de la sangre (PU_un) = PU - PU_b (ecuación 1).
4. Calcular la frecuencia (ciclos/min) para cada 1 minuto de medición.
   Nota: La frecuencia de AMPc microvascular se define como el número de picos que se produjeron en una ola de AMPc microvascular por minuto.
5. Calcular la amplitud (ΔPU) para cada 1 minuto de medición.
   1. Calcular la amplitud de la vasomoción microvascular como la diferencia entre el máximo (PU_max) y mínimo (PU_min): amplitud (ΔPU) = PU_max - PU_min (ecuación 2).
6. Calcular la velocidad relativa (PU) para cada 1 minuto de medición.

Resultados

Una fotografía del láser de medición de AMPc microvascular Doppler aparato equipado con un diodo de láser de semiconductor se muestra en la figura 1A. Software de interfaz de usuario se presenta en la figura 1B. Usando el método mencionado anteriormente, los parámetros hemodinámicos de AMPc microvascular islote pancreático fueron detectados de ratones diabéticos y no diabéticos control. Una variedad de técnicas, incluy...

Discusión

En los casos que implican la disfunción microvascular (p. ej., diabetes, pancreatitis aguda, enfermedades microvasculares periféricas, etcetera), algunas enfermedades llevan a la reducción del flujo sanguíneo. Aparte de cambios en el flujo de sangre, hay indicadores importantes, como el AMPc microvascular, que reflejan el estado funcional de la microcirculación. El indicador específico, AMPc microvascular, se define generalmente como la oscilación del tono microvascular en lechos microvasculares....

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
MoorVMS-LDF2	Moor Instruments	GI80	PeriFlux 5000 (Perimed Inc.) can be used as an alternative apparatus to harvest data
MoorVMS-PC Software	Moor Instruments	GI80-1	Software of MoorVMS-LDF2
Calibration stand	Moor Instruments	GI-cal	Calibration tool
Calibration base	Moor Instruments	GI-cal	Calibration tool
Calibration flux standard	Moor Instruments	GI-cal	Calibration tool
One Touch UltraEasy glucometer	Johnson and Johnson	#1955685	Confirm hyperglycemia
One Touch UltraEasy strips	Johnson and Johnson	#1297006	Confirm hyperglycemia
Streptozotocin	Sigma-Aldrich	S0130	Dissolve in sodium citrate buffer (pH 4.3)
Pentobarbital sodium	Sigma-Aldrich	P3761	Working concentration 3 %
Ethanol	Sinopharm Inc.	200121	Working concentration 75 %
Sucrose	Amresco	335	Working concentration 10 %
Medical gauze	China Health Materials Co.	S-7112	Surgical
Blunt-nose forceps	Shang Hai Surgical Instruments Inc.	N-551	Surgical
Surgical tapes	3M Company	3664CU	Surgical
Gauze sponge	Fu Kang Sen Medical Device CO.	BB5447	Surgical
Scalpel	Yu Lin Surgical Instruments Inc.	175C	Surgical
Skin scissor	Carent	255-17	Surgical
Suture	Ning Bo Surgical Instruments Inc.	3325-77	Surgical
Syringe and 25-G needle	MISAWA Inc.	3731-2011	Scale: 1 ml