Laser Doppler: Uma ferramenta para medir ilhota Pancreatic Microvascular Vasomotion In Vivo

Resumo

Ilhotas pancreáticas microvascular vasomotion regula distribuição de sangue ilhéu e mantém a função fisiológica das células β de ilhéu. Este protocolo descreve usando um monitor de laser Doppler para determinar o estado funcional das ilhotas pancreáticas vasomotion microvascular na vivo e avaliar as contribuições da microcirculação de ilhotas pancreáticas para doenças relacionadas com o pâncreas.

Resumo

Como um estado funcional da microcirculação, vasomotion microvascular é importante para a entrega de oxigênio e nutrientes e a remoção de dióxido de carbono e resíduos de produtos. A deficiência de vasomotion microvascular pode ser um passo crucial no desenvolvimento de doenças relacionadas com a microcirculação. Além disso, a ilhota pancreatic altamente vascularizada é adaptada para suportar a função endócrina. A este respeito, parece-me possível inferir que o estado funcional da ilhota pancreatic microvascular vasomotion pode afetar a função da ilhota pancreática. Analisar as alterações patológicas do estado funcional das ilhotas pancreáticas microvascular vasomotion pode ser uma estratégia viável para determinar as contribuições que microcirculação ilhota pancreatic faz a doenças relacionadas, tais como diabetes mellitus, pancreatite, etc. Portanto, este protocolo descreve como usar um monitor de fluxo do laser Doppler sangue para determinar o estado funcional da ilhota pancreatic microvascular vasomotion e para estabelecer parâmetros (incluindo a perfusão sanguínea média, amplitude, frequência e parente velocidade de ilhotas pancreáticas microvascular vasomotion) para avaliação do status funcional microcirculatory. Em um modelo do rato de diabéticos induzido por estreptozotocina, observamos um estado funcional prejudicado de ilhotas pancreáticas vasomotion microvascular. Em conclusão, esta abordagem para avaliar ilhota pancreatic vasomotion microvascular na vivo pode revelar os mecanismos relacionados com doenças de ilhotas pancreáticas.

Introdução

Como um parâmetro da situação funcional da microcirculação, microvascular vasomotion assume a responsabilidade para a entrega e a troca de oxigênio, nutrientes e hormônios e é fundamental para a remoção de produtos metabólicos, tais como o dióxido de carbono e resíduos de célula ¹. vasomotion microvascular também regula a distribuição do fluxo de sangue e perfusão do tecido, afectando assim a pressão de sangue microcirculatory local e respostas à inflamação, que pode induzir a edema em muitas doenças. Portanto, vasomotion microvascular é extremamente importante para manter a função fisiológica do componente de células, tecidos e órgãos,^2,3,4. A deficiência de vasomotion microvascular pode ser uma das principais etapas no desenvolvimento de doenças relacionadas com a microcirculação⁵.

Laser Doppler foi desenvolvido inicialmente para observação e quantificação no campo da microcirculação investigação⁶. Esta técnica, juntamente com outras abordagens técnicas (por exemplo, laser speckle⁷, oxigênio transcutâneo, etc.), tem sido considerada como o padrão ouro para avaliar o fluxo sanguíneo na microcirculação. A lógica que a perfusão sanguínea de microcirculação local (i.e., capilares, arteríolas, vênulas, etc) pode ser determinado pelos aparelhos equipados com laser Doppler, baseia-se o princípio de efeito Doppler. O comprimento de onda e a frequência da emissão estimulada de luz mudam quando partículas de luz encontram células do sangue em movimento em microvessels, ou permanecem inalterados. Portanto, na microcirculação, o número e a velocidade das células do sangue são os fatores-chave relacionados com a magnitude e a distribuição de frequência da luz Doppler-deslocados, enquanto a direção do fluxo sanguíneo microvascular é irrelevante. Usando métodos diferentes, uma variedade de tecidos têm sido utilizados para estudos microcirculatory, incluindo os mesenteries e dorsal câmaras dobras cutâneas de camundongos, ratos, hamsters e até mesmo os humanos⁸. No entanto, no actual protocolo, focalizamos o funcional status de ilhotas pancreáticas microvascular vasomotion, que é avaliada usando laser Doppler e um sistema de parâmetro de avaliação caseiro.

Microcirculação do pâncreas ilhéu é composta principalmente por microvessels de ilhotas pancreáticas e apresenta características distintivas. Uma rede capilar de ilhotas pancreáticas mostra uma densidade cinco vezes maior do que a rede capilar de sua contraparte exócrino⁹. Fornecendo um conduíte para a entrega da entrada de glicose e insulina divulgação, células endoteliais ilhéu entregam oxigênio às células metabolicamente ativas no Ilhéu células β. Além disso, também emergentes evidências demonstra que o ilhéu microvessels estão envolvidos não só na regulação da expressão do gene de insulina e células β-sobrevivência, mas também em afetar a função da célula β; promover a proliferação de células β; e produzir um número de angiogênico vasoativas, substâncias e fatores de crescimento¹⁰. Portanto, a este respeito, podemos concluir que o estado funcional da ilhota pancreatic microvascular vasomotion pode afetar a função de células β ilhéu e envolver-se na patogênese de doenças como a pancreatite aguda/crónica, diabetes e outros doenças relacionadas com o pâncreas.

Analisar as alterações patológicas do estado funcional das ilhotas pancreáticas microvascular vasomotion pode ser uma estratégia viável para determinar as contribuições da microcirculação de ilhotas pancreáticas para as doenças mencionadas acima. Um procedimento passo a passo detalhado descrevendo a abordagem para determinar ilhota pancreatic vasomotion microvascular na vivo fornecer aqui. Medições típicas então são mostradas nos Resultados de representante. Finalmente, os benefícios e limitações do método são destacadas na discussão, juntamente com outras aplicações.

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Protocolo

Todos os experimentos com animais foram executados em conformidade com todas as orientações pertinentes, regulamentos e órgãos reguladores. O presente protocolo sendo demonstrado foi realizado sob a orientação e aprovação do Instituto da microcirculação Animal ética Comissão (IMAEC) na faculdade médica da União (PUMC) a Pequim.

1. os animais

1. Antes do início do experimento, manter três camundongos BALB/c por gaiola, com temperatura controlada (24 ± 1 ° C) e umidade (55 ± 5%), sob um ciclo claro-escuro de 12-h. Permitir que os ratos livre acesso à água e comida normal.
2. Aleatoriamente, divida os ratos em um grupo controle de não-diabéticos e um grupo de diabético. Com precisão pesar cada rato individual e calcular o volume de injeção usando a massa corporal de cada rato.
3. Depressa os ratos por 4h antes da injeção de estreptozotocina (STZ) e fornecer água regular como normal no dia experimental 1.
4. Prepare o tampão de citrato de sódio 0,1 M em pH 4.3. Colocar 1 mL da solução num tubo de 1,5 mL microcentrifuga e enrolar o tubo microcentrifuga em papel de alumínio para evitar a exposição à luz.
5. Dissolva o STZ em tampão de citrato de sódio (pH 4,3) a uma concentração final de trabalho de 5 mg/mL antes da utilização.
6. Dê os ratos das injeções intraperitoneal grupo diabético de STZ na dose de 40 mg/kg, usando uma seringa de 1 mL e uma agulha 25-G. Injete os ratos do controle não-diabéticos com o mesmo volume de tampão citrato de sódio (pH 4,3).
7. Repor os ratos em jaulas e fornecê-los com 10% de sacarose água e comida normal.
8. Repita as etapas de 1,3-1,7 na experimentais dias 2 a 5 (ou seja, os próximos 4 dias consecutivos).
9. Substitua a água de 10% de sacarose com água normal após a última injecção de STZ.
10. Rápido, os ratos para 6 h, mas dar-lhes livre acesso à água e medir seus níveis de glicose do sangue, nove dias depois (experimental dia 14). Recolha uma amostra de sangue da veia cauda para confirmar a hiperglicemia usando um sistema de monitoramento de glicose de sangue.
    Nota: Os ratos com sangue os níveis de glicose > 200 mg / dL são considerados diabéticos.

2. preparação do instrumento

1. Limpe as superfícies ópticas da ponta da sonda e o conector da sonda do aparelho Doppler laser com um pano não abrasivo para remover qualquer poeira ou partículas. Conecte o cabo na porta do instrumento (figura 1A).
2. Monte o suporte de calibração, permitindo o fluxo padrão para estar em equilíbrio térmico com o ambiente experimental (temperatura ambiente, geralmente por 30 min). Agitar o fluxo padrão suavemente durante 10 s e deixá-lo descansar por 2 min.
3. Posicione o contêiner padrão de fluxo no meio da base de calibração. Ajustar a braçadeira para a altura máxima e fixar a sonda na mordaça tal que aponta para baixo para o recipiente. Certifique-se que o padrão de fluxo está corretamente posicionado debaixo da sonda.
4. Mova lentamente a sonda para baixo até que a ponta está submersa corretamente na norma de fluxo. Selecione e pressione "calibragem" do laser Doppler aparelhos e escolher o canal de trabalho que a sonda é conectada. Execute o programa de calibração até um aviso de "Calibração bem sucedida" é exibido na tela do laser Doppler aparelho.
5. Fixe a sonda utilizando suportes de sonda. Manualmente, fixe a sonda para evitar o movimento.
6. Manter a sala experimental, a temperatura constante (24 ± 1 ° C) e umidade (~ 50-60%).
7. Desligue qualquer luz externa (tais como lâmpadas fluorescentes e local) antes de realizar o experimento para evitar mudança induzida por luz externa.

3. preparação dos animais

1. Autoclave a cirúrgica instrumentos e deixe-as arrefecer à temperatura ambiente antes do uso.
2. Dê os ratos 10 min para aclimatar o ambiente experimental antes detectando ilhota pancreatic microvascular vasomotion pelo laser Doppler.
3. Encha uma seringa de 1 mL com 1 mL de 3% de pentobarbital de sódio. Injecte a solução de pentobarbital de sódio (75 mg/kg, i.p.) para anestesiar os ratos.
4. Cubra os olhos do rato com gaze médica pré-umedecidos para evitar ressecamento.
5. Garantir que o rato perde completamente a consciência e já não responde a cauda ou retropé pitadas com fórceps. Monitore a anestesia durante todo o evento anestésica e intra-operatório cada 15 min. manter a anestesia, completando com 10% do volume inicial de injeção da solução de pentobarbital quando necessário.
6. Coloque uma almofada de aquecimento com uma camada semi isolante abaixo do animal e coloque o animal em posição supina e transferi-lo para a estação de trabalho do laser Doppler aparelho. Corrigi o mouse para a plataforma de trabalho com fita cirúrgica.
7. Cotonete da pele abdominal do mouse com betadine e em seguida etanol 75% é usado para limpar a área abdominal limpo.
8. 2% lidocaine/0.5% bupivacaína (50/50) mistura Injecte por via subcutânea.  Cortar um ~ 3 cm-furo de diâmetro no centro de uma compressa de gaze. Cobrir a região abdominal com a compressa de gaze.
9. Levante a pele abdominal com fórceps e fazer uma incisão vertical inicial ao longo da linha mediana do abdômen, usando uma tesoura, bisturi ou pele.
10. Segure o músculo subjacente com fórceps e incise para entrar na cavidade abdominal. Não feri nenhum órgão. Dobre a pele e o músculo subjacente no peito para revelar o interior da cavidade abdominal. Delicadamente, expor o corpo do pâncreas e do baço, usando um par de pinças nariz sem corte.

4. dados aquisição para análise

1. Executar o software do aparelho laser Doppler clicando em "Arquivo" → "Novo" para criar um novo arquivo de medição. Para configurar os monitores conectados, sob a guia "Geral", configurar a monitoramento de duração para "Graça executar." Use o padrão de fábrica para a guia "LDF Monitor" clique em "Next".
2. Configurar o display gráfico em "Exibir caixa de diálogo configuração." Selecione os canais de "Velocidade de fluxo, Conc," verificando as respectivas caixas. Selecione os seguintes parâmetros: "Fonte de dados para o canal" e "rótulo, unidades e cor." Clique em "Next".
3. Inserir informações de usuário sobre o assunto e medição (i.e., nome e número de assunto, operador, monitoramento de tempo, comentários, etc.) no "arquivo caixa de diálogo informações" e clique em "Next" para concluir a configuração de medição.
   Nota: Uma janela de medição é criada automaticamente pelo software (figura 1B).
4. Manualmente, avança o eletrodo para o pâncreas. Certifique-se que a distância entre as sonda e pâncreas tecidos é dentro de 1 mm. Uma distância inadequada dá uma leitura do fluxo de sangue artificialmente aumentada ou diminuída.
5. Clique no ícone de barra de ferramentas "Iniciar" para começar a gravar os dados de unidades (PU) de perfusão microvascular sangue. Colete os dados de PU continuamente por 1 min cada execução. Clique em "Stop" para parar a medição. Selecione "Arquivo" → "Salvar como" ao nome e salve o arquivo de medições acabado.
6. Manualmente, reposicionar a sonda após cada corrida para evitar efeitos aditivos e a exaustão localizada de contrátil e capacidade de relaxamento. Repita as etapas de 4,1-4,4 para colher dados de PU microvasculares multi-ponto (ou seja, três pontos aleatoriamente escolhidos de tecido pancreático) para cada rato. Medir os dados do plutônio de uma placa não-reflexivo como um controle de linha de base.
7. Feche a camada muscular abdominal e a camada de pele com uma sutura. Coloque os animais em gaiolas limpas após os experimentos.
8. Manter o animal morno colocando a gaiola de recuperação meio-sobre a almofada de aquecimento.
   Nota: Preste atenção ao calor, higiene, fluido e ingestão de alimentos e infecção. Administra os ratos com 2 mg/kg de carprofeno por 48 h como dor pós-operatória.  Realizar eutanásia pela injeção i.p. de pentobarbital de sódio de 150 mg/kg, quando os ratos são observados em um estado de dor ou sofrimento que não pode ser aliviado.

5. calcular os parâmetros de Vasomotion Microvascular

1. Use o comando "Export" do laser Doppler software para exportar o tempo e dados brutos do plutônio como um arquivo *. xlsx e abra o arquivo em uma planilha.
2. Calcular a unidade de perfusão de base média (PU_b) (consulte a etapa 4.6).
3. Calcular a média de sangue da perfusão (PU_um) por 1 min de uma medição da seguinte forma: média de perfusão sanguínea (PU_um) = PU - PU_b (equação 1).
4. Calcule a frequência (ciclos/min), para cada 1 min de medição.
   Nota: A frequência de vasomotion microvascular é definida como o número de picos que ocorreu em uma onda de vasomotion microvascular por minuto.
5. Calcule a amplitude (ΔPU) para cada 1 min de medição.
   1. Calcular a amplitude de vasomotion microvascular como a diferença entre o máximo (PU_máx) e mínimo (PU_min): Amplitude (ΔPU) = PU_máx - PU_min (equação 2).
6. Calcule a velocidade relativa (PU) para cada 1 min de medição.

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Resultados

Uma fotografia do laser vasomotion microvascular medição Doppler aparelhos equipados com um diodo semicondutor é mostrada na figura 1A. Software de interface do usuário é apresentado na figura 1B. Usando o método acima mencionado, os parâmetros hemodinâmicos de ilhotas pancreáticas microvascular vasomotion foram detectados para controle de não-diabéticos e ratos diabéticos. Uma variedade de técnicas, incluindo laser ...

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Discussão

Nos casos que envolvem disfunção microvascular (por exemplo, diabetes, pancreatite aguda, doenças microvasculares periféricas, etc.), algumas doenças levam à redução do fluxo sanguíneo. Para além de alterações no fluxo sanguíneo, existem indicadores importantes, tais como vasomotion microvascular, que espelham o estado funcional da microcirculação. O indicador específico, vasomotion microvascular, geralmente é definido como a oscilação do Tom em camas microvasculares microvascular. O ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
MoorVMS-LDF2	Moor Instruments	GI80	PeriFlux 5000 (Perimed Inc.) can be used as an alternative apparatus to harvest data
MoorVMS-PC Software	Moor Instruments	GI80-1	Software of MoorVMS-LDF2
Calibration stand	Moor Instruments	GI-cal	Calibration tool
Calibration base	Moor Instruments	GI-cal	Calibration tool
Calibration flux standard	Moor Instruments	GI-cal	Calibration tool
One Touch UltraEasy glucometer	Johnson and Johnson	#1955685	Confirm hyperglycemia
One Touch UltraEasy strips	Johnson and Johnson	#1297006	Confirm hyperglycemia
Streptozotocin	Sigma-Aldrich	S0130	Dissolve in sodium citrate buffer (pH 4.3)
Pentobarbital sodium	Sigma-Aldrich	P3761	Working concentration 3 %
Ethanol	Sinopharm Inc.	200121	Working concentration 75 %
Sucrose	Amresco	335	Working concentration 10 %
Medical gauze	China Health Materials Co.	S-7112	Surgical
Blunt-nose forceps	Shang Hai Surgical Instruments Inc.	N-551	Surgical
Surgical tapes	3M Company	3664CU	Surgical
Gauze sponge	Fu Kang Sen Medical Device CO.	BB5447	Surgical
Scalpel	Yu Lin Surgical Instruments Inc.	175C	Surgical
Skin scissor	Carent	255-17	Surgical
Suture	Ning Bo Surgical Instruments Inc.	3325-77	Surgical
Syringe and 25-G needle	MISAWA Inc.	3731-2011	Scale: 1 ml