Nitrógeno cavitación y centrifugación diferencial permite el monitoreo de la distribución periférica de proteínas de membrana en células cultivadas

Resumen

Aquí presentamos los protocolos para la homogeneización de detergente libre de células de mamíferos cultivadas basado en nitrógeno cavitación y posterior separación de las proteínas citosólicas y membrana-limitan por ultracentrifugación. Este método es ideal para el monitoreo de la partición de proteínas periféricas de membrana entre soluble y fracciones de la membrana.

Resumen

Las células cultivadas son útiles para estudiar la distribución subcelular de proteínas, incluyendo proteínas de membrana periférica. Codificada genéticamente fluorescente etiquetadas proteínas han revolucionado el estudio de la distribución subcelular de la proteína. Sin embargo, es difícil cuantificar la distribución con microscopia fluorescente, especialmente cuando las proteínas son parcialmente citosólicas. Por otra parte, a menudo es importante para el estudio de proteínas endógenas. Bioquímicos de ensayos como immunoblots siguen siendo el estándar de oro para la cuantificación de la distribución de la proteína después de fraccionamiento subcelular. Aunque existen kits comerciales que tienen como objetivo aislar citosólica o ciertas fracciones de la membrana, la mayoría de estos kits se basa en la extracción con detergentes, que puede ser inadecuado para el estudio de proteínas de membrana periférica que se extraen fácilmente las membranas. Aquí presentamos un protocolo libre de detergente para celular homogeneización por nitrógeno cavitación y posterior separación de las proteínas citosólicas y membrana-limitan por ultracentrifugación. Confirman la separación de orgánulos subcelulares en soluble y fracciones de pellets a través de diferentes tipos de células y comparar la extracción de proteínas entre varios métodos de homogeneización mecánica no-base de detergente común. Entre varias ventajas de nitrógeno la cavitación es la superior eficacia de disrupción celular con daño mínimo de físico y químico delicada organelos. Combinado con ultracentrifugación, nitrógeno la cavitación es un método excelente para examinar el cambio de las proteínas periféricas de membrana entre citosólica y fracciones de la membrana.

Introducción

Proteínas celulares se pueden dividir en dos clases: los que están asociados a membranas y aquellos que no son. No-membrana las proteínas asociadas se encuentran en el citosol, nucleoplasia y lumina de orgánulos como el retículo endoplásmico (ER). Hay dos clases de proteínas asociadas a membrana, integrales y periféricas. Proteínas integrales de membrana también son conocidas como proteínas transmembranales porque uno o más segmentos de la cadena polipeptídica atraviesa la membrana, por lo general como una α-hélice compuesta de aminoácidos hidrofóbicos. Proteínas transmembranales co-translationally se insertan en las membranas en el curso de su biosíntesis y permanecerán así configuradas hasta que catabolizan. Proteínas de la membrana periférica secundario son conducidas a las membranas, generalmente como consecuencia de la modificación poste-de translación con moléculas hidrofóbicas como los lípidos. En contraste con las proteínas de membrana integral, la Asociación de las proteínas periféricas de membrana con las membranas celulares es reversible y puede ser regulada. Muchos periférica de membrana proteínas función en vías de señalización y asociación regulada con membranas es uno de los mecanismos de activación o inhibición de una vía. Un ejemplo de una molécula de señalización que es una proteína periférica de membrana es la pequeña GTPasa, RAS. Después de una serie de modificaciones post-traduccionales que incluyen modificación con un lípido farnesil, el c-término modificado de una proteína madura de RAS inserta en el folleto de citoplásmico de la membrana celular. En concreto, la membrana plasmática es donde el RAS se dedica a su efector downstream RAF1. Para evitar la activación constitutiva de vía de mitógeno-activada proteína quinasa (MAPK), varios niveles de control de RAS están en lugar. Además de renderización RAS inactivo por hidrolizando GTP en PIB, RAS activa también se puede lanzar desde la membrana plasmática por modificaciones o interacciones con factores para inhibir la señalización de solubilización. Aunque la proyección de imagen vivo fluorescente ofrece a biólogos de célula la oportunidad de observar la localización subcelular de fluorescente etiquetado proteína periférica de membrana proteínas¹, existe una necesidad crítica para evaluar la Asociación de la membrana de proteínas endógenas semi-cuantitativamente con enfoques bioquímicos simples.

La evaluación bioquímica adecuada de proteína repartir entre fracciones solubles y de membrana es críticamente dependiente de dos factores: celular homogeneización y eficiente separación de fracciones solubles y de membrana. Aunque algunos de los protocolos, incluyendo los kits comercializados más utilizados, dependen de homogeneización de la célula base de detergente, estos métodos pueden confundir análisis mediante la extracción de proteínas de la membrana en la fase soluble². Por consiguiente, no detergente mecánicos, basado en métodos de disrupción celular proporcionan resultados limpiador. Existen varios métodos de interrupción mecánica de células cultivadas en cultivo o cosecha de sangre o de órganos. Estos incluyen Dounce homogeneización, interrupción de fina de la aguja, rodamientos de bolas homogeneización, sonicación y cavitación de nitrógeno. Aquí evaluamos cavitación de nitrógeno y se compara con otros métodos. Cavitación de nitrógeno depende del nitrógeno que está disuelto en el citoplasma de las células bajo alta presión. Después de equilibrar, la suspensión de células se expone bruscamente a la presión atmosférica que burbujas de nitrógeno se forman en el citoplasma que rasgar abierto la célula como consecuencia de su efervescencia. Si la presión es suficientemente alta, efervescencia de nitrógeno puede perturbar el núcleo³ y membrana destino organelos como lisosomas⁴. Sin embargo, si la presión se mantiene lo suficientemente baja, la descompresión alteran la membrana plasmática y ER pero no otros organelos, derramando así citosol y orgánulos citoplásmicos intactos en el homogeneizado que se señala el cavitate⁵. Por esta razón, la cavitación de nitrógeno es el método de elección para aislar organelos como lisosomas y mitocondrias.

Sin embargo, también es una excelente manera de preparar un homogeneizado que puede ser fácilmente separado en fracciones solubles y de membrana. El recipiente del reactor (de aquí en adelante llamado "la bomba") usado durante la cavitación consiste en una carcasa de acero inoxidable grueso que soporta alta presión, con una entrada para la entrega del gas nitrógeno desde un tanque y un puerto de salida con una válvula de descarga ajustable.

Cavitación de nitrógeno se ha utilizado para la homogeneización de la célula desde la década de 1960⁶. En 1961, cazador y Commerfold⁷ estableció cavitación de nitrógeno como una opción viable para la interrupción de tejidos de mamíferos. Desde entonces, los investigadores han adaptado la técnica a diferentes células y tejidos con éxito y cavitación de nitrógeno se ha convertido en una grapa en múltiples aplicaciones, incluyendo membrana preparación^8,9, núcleos y organelas preparación^10,11y extracción bioquímica lábil. En la actualidad, biólogos de la célula más a menudo emplean otros métodos de homogeneización de la célula porque las ventajas de la homogeneización de nitrógeno no han sido ampliamente anunciadas, bombas de nitrógeno son caras y hay una idea errónea de que un número relativamente grande de células es Obligatorio. No se han publicado protocolos para la cavitación de nitrógeno alcanzar homogenados sin células con núcleos intactos, y en evaluaciones más publicadas se utilizaron volúmenes de 20 mL de la suspensión celular. Para adaptar esta técnica clásica para los requerimientos actuales de trabajar con muestras pequeñas, presentamos un protocolo modificado de cavitación de nitrógeno diseñado específicamente para las células cultivadas. Después de la cavitación del nitrógeno, el homogenado se separa en fracciones de membrana (P) y soluble (S) por centrifugación diferencial, primero con un exprimido a velocidad baja para extraer los núcleos y células intactas y luego con un exprimido a alta velocidad (> 100.000 x g) para separar membranas de la fracción soluble. Analizar la eficiencia de la separación con los immunoblots y comparar cavitación de nitrógeno con otras técnicas de interrupción mecánica. También investigamos el efecto osmótico de buffer de homogenización durante la cavitación de nitrógeno.

Protocolo

1. buffer y preparaciones de equipo

1. enfriar 45 mL celular interrupción bombas, tubos de 15 mL y tubos de ultracentrifugación a 4 ° C.
2. Preparación y 25 mL de buffer de homogenización por 2 x 10 ⁷ células a 4 ° C. agregar una proteasa inhibidor tableta antes de uso.
   Nota: Reservas de homogeneización normalmente contienen KCl en vez de NaCl para mejor reflejar la composición sal intracelular. Buffer de homogeneización utilizado en este protocolo se compone de 10 mM HEPES, pH 7.4, 10 mM KCl y 1,5 mM de MgCl ₂ (en lo sucesivo como buffer de homogeneización hipotónica). Almacenadores intermediarios la mayoría pueden ser adaptados para la cavitación del nitrógeno (ver discusión).
3. Preparación y 6 mL de 1 x de buffer de Phosphate-Buffered salina (PBS) por muestra a 4 ° C. agregar proteasa inhibidor tabletas frescas antes de su uso.
   Nota: Tampón PBS utilizado en este protocolo consiste en Na ₂ HPO ₄ de 10 mm a pH 7.4, 1,8 mM KH ₂ PO ₄, 137 mM NaCl y KCl de 2.7 mM.
4. Preparación y 4 mL de tampón de solubilización por muestra a 4 ° C. agregar una proteasa inhibidor de la tableta antes de uso.
   Nota: Tampón de solubilización utilizado en este protocolo es 1 Tampón de ensayo (RIPA) x Radioimmunoprecipitation, que consiste en 25 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, desoxicolato de sodio 0.5% y 1% NP-40. Véase la nota 4.6.

2. La cosecha de la célula

medios de cultivo

1. crece 2 x 10 ⁷ -10 x 10 ⁹ células de cultivo de tejidos con la recomendada para el tipo de célula. Por lo general, un plato de 15 cm rinde 2 x 10 ⁷ células HEK-293 cultivadas en DMEM en confluencia de 90% ( figura 1).
2. Quitar el medio de crecimiento por el vacío de.
3. Para las células adherentes, coloque los platos de la cultura en hielo, lavar las células directamente en los platos de la cultura con buffer de homogeneización fría dos veces (10 mL de tampón por plato 15 cm por lavado) y cosechar las células con una espátula grande de la célula en un volumen adecuado de buffer de homogeneización; Para las células de suspensión, recolectar y lavar el precipitado de células en frío homogeneización buffer dos veces (10 mL de tampón por cultura de 50 mL por lavado) con giro de 500 x g a 4 ° C por 5 min y resuspender el precipitado de células lavadas en un volumen adecuado del buffer de homogeneización en el hielo.
   Nota: el volumen debe basarse en los requisitos para la concentración de proteína en los experimentos previstos, así como el mínimo/máximo volumen permitido en la bomba de disrupción celular. Una pauta general es 2-10 x 10 ⁷ células/mL, o unos 10 volúmenes de la celda de pellets. Este protocolo está optimizado para tres platos de 15 cm de las células HEK-293 en 2 mL de buffer de homogenización.

3. Cavitación de nitrógeno

1. traslado de la suspensión celular a una bomba limpia y enfriada en un baño de hielo en un revuelo placa.
   Atención: La bomba tiene alta presión, baja temperatura, nitrógeno – Utilice protección personal adecuada .
2. Colocar una barra de agitación magnética micro dentro de la bomba y encienda la placa de agitación para mantener la homogeneidad de la suspensión.
3. Añadir una tableta de inhibidor de proteasa a la suspensión y cierre de la bomba por el fabricante ' instrucción s.
4. Gradualmente presurice la bomba con un tanque de gas nitrógeno por fabricante ' instrucción de s hasta el medidor de presión de bomba Lee 300 a 600 psi. Todas las válvulas de cierre y desconecte el tanque de nitrógeno.
   Nota: La presión requerida puede variar con el tipo de célula. Aquí realizamos cavitación a 350 a 400 psi para las células HEK-293, NIH-3T3 y Jurkat.
5. Espere 20 minutos permitir que el nitrógeno a disolver y a alcanzar equilibrio dentro de las células.
6. Eliminar exceso de agua alrededor de la válvula de descarga con una toalla. Abra la válvula de descarga suavemente para lograr una liberación gota a gota de homogeneizado y recoger en un tubo previamente enfriado 15 mL.
   Nota: Cerca del final de la colección habrá un chorro de homogeneizado y gas saldrá con un silbido. Asegúrese de que el gas no causa recogieron cavitará para tirar del tubo (por lo tanto, la utilización de 15 mL tubos en lugar de tubos de 1,5 mL). Una vez que el chorro se inicia, cierre la válvula de descarga y abra la válvula de entrada de nitrógeno abruptamente para despresurizar la bomba y lograr la cavitación de las celdas restantes de la bomba. Abrir la bomba para cavitará recuperación y limpieza.
   Nota: Cavitate final debe tener un aspecto lechoso con espuma en la parte superior. Revuelva suavemente con una pipeta para permitir que la espuma antes de centrifugación a.
   Nota: Examine el cavitate por microscopia de contraste de fase para determinar la eficacia de la homogeneización. Añadir una gota de 15 μl de cavitará a la superficie de un portaobjetos de microscopía y cubrir con un cubreobjetos. Repita el paso 3.4-3.6 sólo si demasiadas células intactas se detectan con objetivo 20 X.
   Nota: Si el buffer de homogeneización no contiene EDTA o EGTA, añadir a la recogida cavitará a una concentración final de 1 mM dentro de 5 minutos después de la descarga.

4. Separación de Cytosolic y fracciones de la membrana

1. centrífuga cavitate a 500 x g por 10 min a 4 ° C para eliminar las células intactas y núcleos.
   Nota: Repita el paso de centrifugación hasta no pellet visible se produce y recoge el Post Nuclear flotante (PNS) evitando la espuma flotante en la parte superior. Volver a centrifugar la espuma para recoger y combinar PNS, si es necesario ( figura 1).
2. Proceso de PNS como desee para obtener fracciones de interés. Con el fin de separar citosólica y fracciones de la membrana, el PNS la transferencia a un tubo de ultracentrífuga y realizar ultracentrifugación como desee. Este protocolo está optimizado para una < 3,5 mL de muestra en un tubo de ultracentrífuga de policarbonato y de ultracentrifugación a 350.000 x g durante 1 h a 4 ° C.
3. Recoger el sobrenadante (fracción S) usando una pipeta de 1 mL.
4. Cuidadosamente Lave el precipitado con 3 mL de PBS frío sin perturbarla. Retirar el PBS por el vacío de.
   Nota: Si la contaminación de la fracción de membrana por las proteínas citosólicas es una preocupación mayor que la pérdida de muestra, Resuspender el precipitado en 3 mL de PBS y re-ultracentrífuga como en el paso 4.2. Retirar el PBS por el vacío de.
5. Resuspender el precipitado totalmente en un volumen adecuado de tampón de solubilización que contiene detergente de preferencia. Para lograr la equivalencia de celda, usar el mismo volumen de tampón de solubilización como la fracción citosólica.
   Nota: Se sugiere utilizar 1 x RIPA buffer como tampón de solubilización para la extracción de proteínas de membrana eficiente. Si no análisis aguas abajo es necesario para la fracción de membrana, usar 1 x laemmli solución tampón de muestra para la extracción de proteínas de membrana máxima.
   Nota: Le sugerimos desalojando y transferir el precipitado en tampón de solubilización a un tubo limpio en un rotador de tubo a 4 ° C para la extracción de proteínas de membrana máxima.
   Nota: Si el pellet es demasiado pegajosos (demasiados lípidos) ser eliminado eficientemente de thtubo de ultracentrífuga e en tampón de solubilización, se aconseja ajustar la pelotilla de la congelación en nitrógeno líquido y rápidamente removiendo el sedimento del tubo de ultracentrífuga con una espátula de metal mini antes de la pelotilla deshiela.
   Nota: Alternativamente, pelotillas de la membrana pueden ser sólo serán suspendidas y no solubilizados en un búfer que contiene detergente no para producir una fracción P de la suspensión de la vesícula de membrana, en cuyo caso la centrifugación paso 4.6 no es necesario. Esas fracciones de P son útiles al investigar funciones tales como actividades enzimáticas dependientes de la Asociación de la membrana.
6. Centrifugar la suspensión de pellets completamente solubilizado de paso 4.5 a 20.000 x g en una centrífuga de mesa durante 10 min a 4 º C. recoger el sobrenadante con una pipeta de 1 mL (la fracción de P) y descartar el precipitado (lípidos insolubles).
7. Realizar ensayos deseados como el borrar occidental con las fracciones citosólicas o membrana, o salvar a-80 ° C para su uso futuro.

Resultados

La figura 2 muestra la partición de proteínas celulares del PNS en la fracción citosólica soluble (S) o fracción de la pelotilla de membrana (P). Examinamos tres líneas de células representativas de diferentes tipos de células: HEK-293 (epiteliales), NIH-3T3 (fibroblastos) y Jurkat (linfocito). Inhibidores de disociación de guanina de Rho (RhoGDI) y receptor de manosa-6-fosfato catión independiente (CIMPR) fueron utilizados como controles positivos ...

Discusión

Son múltiples las ventajas de la cavitación de nitrógeno sobre otros métodos de alteración mecánica. Quizás el beneficio más significativo es su capacidad para suavemente y eficientemente homogeneizar a muestras. Los principios físicos de descompresión enfría muestras en lugar de generar daño de calentamiento local como ultrasonidos y fricción/cizallamiento basado en técnicas. La cavitación también es extremadamente eficaz en alterar la membrana plasmática. Porque el nitrógeno de las burbujas se generan...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Disruption Vessel (45 mL)	Parr Instrument	4639	Nitrogen cavitation Bomb
Dounce homogenizer (2 mL)	Kontes	885300-0002	Dounce pestle and tube
U-100 Insulin Syringe 28G½	Becton Dickinson	329461	Needle
Atg12 antibody	Santa Cruz	271688	Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
β-actin antibody	Santa Cruz	47778	Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
β-tubulin antibody	DSHB	E7-s	Mouse antibody, use at 1:5000 dilution
Calnexin antibody	Santa Cruz	23954	Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Calregulin antibody	Santa Cruz	373863	Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Catalase antibody	Santa Cruz	271803	Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
CIMPR antibody	Abcam	124767	Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution
EEA1 antibody	Santa Cruz	137130	Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
EGFR antibody	Santa Cruz	373746	Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
F0-ATPase antibody	Santa Cruz	514419	Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
F1-ATPase antibody	Santa Cruz	55597	Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Fibrillarin antibody	Santa Cruz	374022	Mouse antibody, use at 1:200 dilution
Golgin 97 antibody	Santa Cruz	59820	Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
HDAC1 antibody	Santa Cruz	81598	Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Hexokinase 1 antibody	Cell Signaling Technology	2024S	Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution
Lamin A/C antibody	Santa Cruz	376248	Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
LAMP1 antibody	DSHB	H4A3-c	Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Na+/K+ ATPase antibody	Santa Cruz	48345	Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Rab7 antibody	Abcam	137029	Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution
Rab9 antibody	Thermo	MA3-067	Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
RCAS1 antibody	Santa Cruz	398052	Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
RhoGDI antibody	Santa Cruz	360	Rabbit antibody, use at 1:3000 dilution
Ribosomal protein S6 antibody	Santa Cruz	74459	Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Sec61a antibody	Santa Cruz	12322	Goat antibody, use at 1:1000 dilution
Thickwall Polycarbonate ultracentrifuge tube	Beckman Coulter	349622	Sample tube for ultracentrifugation
TLK-100.3 rotor	Beckman Coulter	349481	rotor for ultracentrifugation
Optima MAX High-Capacity Personal Ultracentrifuge	Beckman Coulter	364300	ultracentrifuge
cOmplete protease inhibitor cocktail tablets	Roche	11697498001	protease inhibitors
Cell Scrapers with 25cm Handle and 3.0cm Blade	Corning	353089	large cell scraper
Magnetic Stir Bar	Fisher Scientific	14-513-57SIX	micro stir bar
Ceramic-Top Magnetic Stirrer	Fisher Scientific	S504501AS	magnetic stirrer